基于CRISPR/Cas9技术的SIRT3基因敲除猪肺泡巨噬细胞系的构建与鉴定

1

作者 王宝鑫 张文华 +4 位作者 董霞 郑好 张晶 陈洪波 周傲 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期991-1000,共10页

【目的】旨在构建稳定敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞系,分析SIRT3敲除对病毒诱导的炎症反应的调控作用,为探究SIRT3基因在宿主抗病毒感染中的作用奠定试验基础。【方法】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对猪SIRT3基因第2号外显子设... 【目的】旨在构建稳定敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞系,分析SIRT3敲除对病毒诱导的炎症反应的调控作用,为探究SIRT3基因在宿主抗病毒感染中的作用奠定试验基础。【方法】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对猪SIRT3基因第2号外显子设计sgRNA,连接pb-U6-puro-BFP质粒后转染3D4/21细胞,筛选单克隆细胞,结合Sanger测序、qPCR和Western blot技术对获得的单克隆细胞进行鉴定,进而获得SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21-SIRT3-KO),并以流感病毒A/WSN/33为研究对象,感染野生型和3D4/21-SIRT3-KO猪肺泡巨噬细胞,利用qPCR方法检测炎症相关因子IL-6、IL-8的表达水平,初步分析SIRT3基因在流感病毒感染诱导炎症反应的影响。【结果】Sanger测序结果显示,在挑选获得的敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞克隆中,SIRT3基因第2号外显子位点产生了碱基缺失,并导致移码突变;同时,利用qPCR和Western blot检测猪肺泡巨噬细胞中SIRT3 mRNA和蛋白水平的表达,结果显示与野生型细胞相比,3D4/21-SIRT3-KO细胞中SIRT3 mRNA和SIRT3蛋白均不表达;流感病毒感染SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞时发现,敲除SIRT3能显著加剧流感病毒感染诱导的炎症反应。【结论】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系,并初步分析了SIRT3在流感病毒感染中作用。 展开更多

关键词 猪肺泡巨噬细胞系 SIRT3 CRISPR/Cas9 炎症反应 抗病育种 基因编辑

在线阅读 下载PDF 职称材料

阵发性睡眠性血红蛋白尿症病人骨髓粒-巨噬细胞系祖细胞的特点

2

作者 高清平 李秀珍 +3 位作者 梅广义 陈济民 夏虹 王巧玲 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 1996年第1期108-109,共2页

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是后天的细胞膜缺陷性疾病。这种缺陷累及红细胞、粒细胞和血小板,还累及骨髓造血祖细胞。本实验采用造血祖细胞体外培养技术研究PNH病人骨髓粒-巨噬细胞系祖细胞(CFU—GM)的增殖能力;骨髓细胞经新鲜酸化A... 阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是后天的细胞膜缺陷性疾病。这种缺陷累及红细胞、粒细胞和血小板,还累及骨髓造血祖细胞。本实验采用造血祖细胞体外培养技术研究PNH病人骨髓粒-巨噬细胞系祖细胞(CFU—GM)的增殖能力;骨髓细胞经新鲜酸化AB型血清处理后培养的CFU—GM的增殖能力;以及CFU—GM对粒-巨噬细胞系集落刺激因子(GM—CSF)的反应能力。 展开更多

关键词 阵发性睡眠性血红蛋白尿症 粒-巨噬细胞系祖细胞 粒-巨噬细胞系集落刺激因子

在线阅读 下载PDF 职称材料

牛磺鹅去氧胆酸对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞凋亡的影响 被引量：4

3

作者 张文 王建光 +4 位作者 李金莲 赵孝民 陈正涛 周川 石有斐 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第7期1674-1680,共7页

为了探讨牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)对小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的抗凋亡作用,试验采用二苯胺法及实时荧光定量PCR技术分别检测了针对RAW264.7细胞凋亡百分率及凋亡抑制蛋白CIAP-1、CIAP-2和XIAP的mRNA表达影响。结果显示,剂量为0.05、0.1... 为了探讨牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)对小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的抗凋亡作用,试验采用二苯胺法及实时荧光定量PCR技术分别检测了针对RAW264.7细胞凋亡百分率及凋亡抑制蛋白CIAP-1、CIAP-2和XIAP的mRNA表达影响。结果显示,剂量为0.05、0.10和10μg/mL TCDCA可以极显著地对抗地塞米松(DEX)诱导的RAW264.7细胞系凋亡(P<0.01)。1μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1和XIAP表达有显著的促进作用(P<0.05);10μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和XIAP表达均具有显著的促进作用(P<0.05)。TCDCA给药后对DEX诱导的RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和XIAP表达均具有极显著的促进作用(P<0.01),但不同给药剂量的TCDCA作用有所差异。以上研究结果表明,TCDCA具有对抗DEX诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7凋亡作用,且与上调凋亡抑制蛋白mRNA表达有关。 展开更多

关键词 牛磺鹅去氧胆酸 小鼠巨噬细胞系RAW264.7 细胞凋亡 凋亡抑制蛋白

在线阅读 下载PDF 职称材料

L929细胞条件培养液对氧化应激的单核/巨噬细胞系膜流动性的影响 被引量：1

4

作者 庞战军 周玫 陈瑗 《第一军医大学学报》 CSCD 1997年第4期266-268,共3页

采用荧光偏振技术，观察了L929细胞条件培养液（L929－CM）对U937及J774单核／巨噬细胞系细胞膜流动性（以膜微粘度［η］为指标）的影响，及在叔丁基氢过氧化物（tbOOH）攻击下受L929－CM处理的细胞膜流动性的变化。结果表明经L929－C... 采用荧光偏振技术，观察了L929细胞条件培养液（L929－CM）对U937及J774单核／巨噬细胞系细胞膜流动性（以膜微粘度［η］为指标）的影响，及在叔丁基氢过氧化物（tbOOH）攻击下受L929－CM处理的细胞膜流动性的变化。结果表明经L929－CM处理可使单核／巨噬细胞系细胞膜微粘度下降，流动性增加，并且在tbOOH作用下其细胞膜流动性降低不显著。提示L929－CM可以防止tbOOH对单核／巨噬细胞的氧化损伤． 展开更多

关键词 细胞膜 条件培养液 巨噬细胞系 MCSF 细胞培养

在线阅读 下载PDF 职称材料

党参多糖对巨噬细胞的诱导活化作用 被引量：16

5

作者 石轶男 孙娜 +1 位作者 孙耀贵 李宏全 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期777-784,共8页

旨在通过检测党参多糖(Codonopsis pilosula polysaccharide,CPPS)对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞的增殖作用、TNF-α和IL-6分泌及其mRNA转录和NF-кB通路活化情况,探究CPPS对小鼠巨噬细胞系的诱导活化作用。以水提醇沉法从山西道地药... 旨在通过检测党参多糖(Codonopsis pilosula polysaccharide,CPPS)对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞的增殖作用、TNF-α和IL-6分泌及其mRNA转录和NF-кB通路活化情况,探究CPPS对小鼠巨噬细胞系的诱导活化作用。以水提醇沉法从山西道地药材潞党参提取CPPS,经Sevage法除蛋白质,苯酚-硫酸法测定其含量。采用MTT法检测不同质量浓度CPPS(从31.25到4 000μg·mL^(-1)以2倍倍比稀释的方式)对RAW 264.7细胞增殖的影响。分别将25、50、100、150和200μg·mL^(-1)的CPPS作用于巨噬细胞系RAW 264.7细胞,ELISA检测TNF-α和IL-6的分泌量,RT-PCR检测TNF-α和IL-6mRNA转录量,Western blot检测细胞核内NF-кB p65和细胞质内IкB-α蛋白表达量。结果显示,CPPS含量为83.97%;CPPS质量浓度在31.25~250μg·mL^(-1)可刺激RAW264.7细胞增殖,以125μg·mL^(-1)增殖作用最显著(P<0.01),而高于500μg·mL^(-1)时则抑制RAW 264.7细胞的增殖;100和150μg·mL^(-1)的CPPS可使TNF-α(P<0.01)和IL-6(P<0.05)的分泌量及其mRNA的转录量极显著增加(P<0.001);100μg·mL^(-1)的CPPS可刺激RAW 264.7细胞核内NF-кB p65蛋白表达量升高(P<0.01),并使细胞质内IкB-α蛋白表达量降低(P<0.001)。结果表明,CPPS不仅可以通过刺激RAW 264.7细胞增殖,还可能通过激活NF-кB信号通路使TNF-α和IL-6的分泌量增多,进而参与机体的免疫调节。 展开更多

关键词 党参多糖 巨噬细胞系 TNF-Α IL-6 NF-кB

在线阅读 下载PDF 职称材料

绵羊布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞的荧光表征与分析 被引量：2

6

作者 马慧 苟亚峰 +1 位作者 刘朋涛 高剑峰 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2014年第5期536-542,共7页

通过对绿色荧光蛋白(GFP)布鲁氏菌16M(强毒株)和M5(弱毒株)侵染小鼠巨噬细胞及胞内溶酶体、内质网、高尔基体初次结合所用时间进行测定,探讨二者在结合所用时间上是否存在差异;其次比较GFP布鲁氏菌16M和M5与胞内各细胞器结合产生的荧光... 通过对绿色荧光蛋白(GFP)布鲁氏菌16M(强毒株)和M5(弱毒株)侵染小鼠巨噬细胞及胞内溶酶体、内质网、高尔基体初次结合所用时间进行测定,探讨二者在结合所用时间上是否存在差异;其次比较GFP布鲁氏菌16M和M5与胞内各细胞器结合产生的荧光强度。将GFP布鲁氏菌16M(强毒株)和M5(弱毒株)分不同时间段分别侵染RAW 264.7(细菌和细胞比例为100︰1),利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察和检测。结果表明:布鲁氏菌16M和M5侵染初期10 min时进入巨噬细胞,1.5 h时布鲁氏菌到达溶酶体,2.0 h时布鲁氏菌到达内质网和高尔基体。结果提示,布鲁氏菌16M和M5在侵染进入宿主细胞与胞内各细胞器初次结合所用时间相同,但布鲁氏菌16M与各细胞器结合的荧光强度均高于布鲁氏菌M5。以此推断布鲁氏菌16M进入胞内的数量高于布鲁氏菌M5。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 绿色荧光蛋白 巨噬细胞系 激光共聚焦显微镜 流式细胞仪

在线阅读 下载PDF 职称材料

GW003对骨髓细胞体外形成粒-巨噬细胞集落能力的影响

7

作者 欧红玲 邢爽 +4 位作者 李明 熊国林 陈凤华 李晓宁 王欣茹 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期475-478,共4页

本研究旨在观察重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子融合蛋白(GW003)对骨髓造血细胞体外形成粒系集落能力的影响。分别抽取正常恒河猴、缓解期和化疗中ALL患者骨髓并分离有核细胞,分别加入系列浓度的GW003、吉粒芬、G-CSF突变体,在培... 本研究旨在观察重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子融合蛋白(GW003)对骨髓造血细胞体外形成粒系集落能力的影响。分别抽取正常恒河猴、缓解期和化疗中ALL患者骨髓并分离有核细胞,分别加入系列浓度的GW003、吉粒芬、G-CSF突变体,在培养12 d后计数粒-巨噬细胞系集落(CFU-GM)。结果表明,GW003具有提高正常恒河猴骨髓有核细胞体外形成CFU-GM的能力,效果明显优于相同摩尔浓度的吉粒芬及G-CSF突变体;在一定的浓度范围内,GW003浓度与恒河猴骨髓细胞形成CFU-GM的数量呈明显的剂量效应关系(r=R2=0.965,P=0.003);GW003能提高ALL患者骨髓细胞粒系集落体外形成能力,对化疗中患者的效果更为显著,可有效缓解化疗引起的骨髓抑制。结论:GW003可显著提高骨髓细胞体外形成粒细胞集落的能力,可有效缓解骨髓抑制。 展开更多

关键词 粒细胞集落刺激因子 融合蛋白 粒-巨噬细胞系集落

在线阅读 下载PDF 职称材料

刚地弓形虫热休克蛋白21体外条件下对小鼠巨噬细胞功能的影响 被引量：4

8

作者 李纯静 周天缘 +5 位作者 于正青 储稳 徐立新 宋小凯 严若峰 李祥瑞 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期136-143,共8页

[目的]本试验旨在探究刚地弓形虫热休克蛋白21(TgHSP21)在体外对小鼠巨噬细胞系(Ana-1)功能的调节作用。[方法]构建重组表达载体pET-32a/TgHSP 21,获得重组蛋白TgHSP21(rTgHSP21)。用免疫荧光抗体试验(IFA)验证rTgHSP21在体外与Ana-1细... [目的]本试验旨在探究刚地弓形虫热休克蛋白21(TgHSP21)在体外对小鼠巨噬细胞系(Ana-1)功能的调节作用。[方法]构建重组表达载体pET-32a/TgHSP 21,获得重组蛋白TgHSP21(rTgHSP21)。用免疫荧光抗体试验(IFA)验证rTgHSP21在体外与Ana-1细胞的结合情况。Ana-1细胞分别用不同质量浓度(5、10、20、40、80μg·mL^-1)的rTgHSP21处理后,采取细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖情况,应用Transwell细胞小室检测细胞趋化情况,应用流式细胞术检测Ana-1细胞凋亡和吞噬能力。分别用总一氧化氮(NO)试剂盒和细胞因子ELISA试剂盒检测Ana-1细胞的NO和肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素12(IL-12)、IL-6、IL-1β的分泌量。[结果]成功获得纯化的rTgHSP21,其具有与Ana-1细胞结合的能力。5和10μg·mL^-1的rTgHSP21均显著促进Ana-1细胞的增殖,各个浓度的rTgHSP21均显著促进细胞凋亡和吞噬能力。80μg·mL^-1 rTgHSP21明显促进Ana-1细胞分泌NO。在不同浓度rTgHSP21作用下,细胞因子IL-6和TNF-α的表达量均明显上升,而其质量浓度为10、20、40和80μg·mL^-1时IL-12的分泌被抑制。此外,rTgHSP21显著抑制了Ana-1细胞的迁移能力。[结论]TgHSP21能够与Ana-1细胞结合并在体外条件下调节Ana-1细胞的增殖、吞噬、凋亡、迁移及分泌。 展开更多

关键词 弓形虫 热休克蛋白21 小鼠巨噬细胞系 免疫功能

在线阅读 下载PDF 职称材料

羊布鲁氏菌强毒株16M感染小鼠巨噬细胞模型的建立 被引量：3

9

作者 孙春辉 郎需龙 +4 位作者 杨艳玲 王秀然 李晓燕 卜昭阳 王兴龙 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第3期199-203,共5页

巨噬细胞是机体抗吞噬能力最强的细胞,但布鲁氏菌不但不能被巨噬细胞杀死,反而能在胞内大量繁殖,因此,本研究建立其感染模型,为下一步继续研究布鲁氏菌与其宿主细胞表面相关膜蛋白之间的作用和胞内寄生机制奠定基础。用羊布鲁氏菌强毒株... 巨噬细胞是机体抗吞噬能力最强的细胞,但布鲁氏菌不但不能被巨噬细胞杀死,反而能在胞内大量繁殖,因此,本研究建立其感染模型,为下一步继续研究布鲁氏菌与其宿主细胞表面相关膜蛋白之间的作用和胞内寄生机制奠定基础。用羊布鲁氏菌强毒株16M感染巨噬细胞系264.7(细胞和细菌比例为1∶500),感染时间为4 h,建立布鲁氏菌感染巨噬细胞模型,做间接免疫荧光试验和透射电镜试验。间接免疫荧光试验中一抗与二抗最佳稀释度分别为1∶80和1∶80,电镜下观察到细菌侵入细胞时膜凹陷,形态发生变化,形成内吞小体。本试验减少感染过程所涉及的环境因素,优化了间接免疫荧光试验所需的一抗和二抗浓度比,成功建立感染模型。 展开更多

关键词 羊布鲁氏菌强毒株16M 巨噬细胞系RAW264.7 间接免疫荧光试验 透射电镜试验

在线阅读 下载PDF 职称材料

CD163单等位基因表达的iPAMs细胞系的构建及其介导PRRSV感染的特征分析 被引量：1

10

作者 王慧 冯保亮 +4 位作者 向光明 黄雷 刘志国 李奎 牟玉莲 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2617-2628,共12页

【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得CD 163(cluster of differentiation 163)单等位基因表达的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并探究其介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine r... 【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得CD 163(cluster of differentiation 163)单等位基因表达的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并探究其介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染的特征,为深入研究CD 163基因在PRRSV感染中的作用机制奠定基础。【方法】在猪CD 163基因外显子1区域设计8条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接到pX458载体中,通过T7E1酶切试验检测不同sgRNA载体的活性;将活性较高的3条sgRNAs表达载体电转染到iPAMs中,通过流式细胞术分选单克隆细胞,对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定、蛋白表达检测、脱靶分析以及PRRSV感染分析。【结果】在设计的8条sgRNAs中有3条基因编辑效率在28%以上。基因型鉴定结果表明,50株片段敲除的单克隆细胞中有4株符合预期的CD 163单等位基因表达的iPAMs,效率为8%。蛋白表达检测和脱靶分析结果显示,CD 163单等位基因表达的iPAMs中CD163蛋白表达量显著下降(P<0.05),且在预测位置未发生脱靶现象。PRRSV感染分析显示,CD 163单等位基因表达的iPAMs可以正常感染PRRSV,病毒拷贝数和PRRSV-N蛋白表达量与野生型细胞无显著差异(P>0.05)。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统构建了可以正常感染PPRSV的CD 163单等位基因表达的iPAMs,为阐明CD163在猪繁殖与呼吸综合征传染病中所起的作用以及培育抗病猪新品种奠定了基础。 展开更多

关键词 CD163 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) CRISPR/Cas9 永生化猪肺泡巨噬细胞系(iPAMs)

在线阅读 下载PDF 职称材料

雪荔方总黄酮对LPS致RAW264.7细胞炎症的保护作用 被引量：11

11

作者 丛友权 韩晶晶 +1 位作者 方芸 陈军 《中成药》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期890-895,共6页

目的观察雪荔方总黄酮(紫花地丁、六月雪、车前草、荔枝草,TFXL)对脂多糖(LPS)致RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用。方法噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度的雪荔方总黄酮对RAW264.7细胞活性的影响;NO试剂盒法检测雪荔方总黄酮对LPS致RAW264.7细胞... 目的观察雪荔方总黄酮(紫花地丁、六月雪、车前草、荔枝草,TFXL)对脂多糖(LPS)致RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用。方法噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度的雪荔方总黄酮对RAW264.7细胞活性的影响;NO试剂盒法检测雪荔方总黄酮对LPS致RAW264.7细胞的NO释放量;酶联免疫吸附法(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)的分泌;逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α、IL6和IL10 mRNA的表达;免疫印迹法(Western blot)检测细胞IκB-α、p65蛋白表达。结果与LPS模型组相比,雪荔方总黄酮能显著降低NO、TNF-α和IL-6分泌,增加IL-10分泌;抑制iNOS、TNF-α、IL6mRNA表达,促进IL10 mRNA表达;抑制IκB-α、p65的磷酸化,其高剂量组能抑制IκB-α的降解。结论本研究初步证实了雪荔方总黄酮对LPS致RAW264.7巨噬细胞炎症的保护作用,其作用机制可能与NF-κB信号通路有关。 展开更多

关键词 雪荔方 总黄酮 小鼠巨噬细胞系 脂多糖 抗炎

在线阅读 下载PDF 职称材料

IL-6在人单核细胞和脂肪细胞共培养体系中水平的相关变化

12

作者 沈海军 欧红芹 +1 位作者 沈捷 马向华 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期649-652,共4页

目的:研究人单核/巨噬细胞系THP-1与人原代脂肪细胞共培养体系中白细胞介素(IL-6)分泌水平的变化,以探讨炎症和肥胖的相关性。方法:建立THP-1与人原代脂肪细胞共培养体系,并用JNK抑制剂干预共培养体系24h后,用酶联免疫吸附法(ELISA)分... 目的:研究人单核/巨噬细胞系THP-1与人原代脂肪细胞共培养体系中白细胞介素(IL-6)分泌水平的变化,以探讨炎症和肥胖的相关性。方法:建立THP-1与人原代脂肪细胞共培养体系,并用JNK抑制剂干预共培养体系24h后,用酶联免疫吸附法(ELISA)分别测定单核细胞组、脂肪细胞组、共培养组及共培养加JNK抑制剂组上清中IL-6的水平。结果:共培养组较单核细胞组、脂肪细胞组IL-6水平升高(P<0.05),共培养加入JNK抑制剂后,IL-6水平有所下降(P=0.114)。结论:人单核/巨噬细胞系THP-1与人原代脂肪细胞共培养促进炎症因子IL-6的释放,选择性阻断炎症介导的信号传导途径,IL-6的释放减少,对症使用抗炎介质及JNK抑制剂有望成为肥胖治疗的新靶点。 展开更多

关键词 IL-6 肥胖 炎症 单核/巨噬细胞系THP-1 人原代脂肪细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

检测鸡细胞介导免疫反应的体外试验

13

作者 刘胜旺 《畜牧兽医科技信息》 1997年第22期7-7,共1页

用具有γ-干扰素活性的激活的鸡脾细胞上清液刺激鸡巨噬细胞系HD₁₁,再根据巨噬细胞系所产生的NO浓度来间接地检测鸡γ-干扰素的含量。此实验可用于检测感染鸡特异的细胞介导的免疫反应。用竞争ELISA来检测特异... 用具有γ-干扰素活性的激活的鸡脾细胞上清液刺激鸡巨噬细胞系HD₁₁,再根据巨噬细胞系所产生的NO浓度来间接地检测鸡γ-干扰素的含量。此实验可用于检测感染鸡特异的细胞介导的免疫反应。用竞争ELISA来检测特异性抗原刺激的鸡脾淋巴细胞分泌的γ-干扰素。 展开更多

关键词 细胞介导免疫反应 γ-干扰素 干扰素基因 巨噬细胞系 竞争ELISA 表达载体 亚硝酸根 杆状病毒 脾细胞 基因序列比较

在线阅读 下载PDF 职称材料

CD163基因敲除iPAMs的构建及其感染PRRSV的特征分析

14

作者 董泽霞 林鑫 +5 位作者 周期律 王楠 黄雷 刘志国 冯政 牟玉莲 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3471-3483,共13页

[目的]获得分化抗原163(cluster of differentiation 163,CD163)基因敲除的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并从细胞水平研究CD163蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and r... [目的]获得分化抗原163(cluster of differentiation 163,CD163)基因敲除的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并从细胞水平研究CD163蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵过程中的作用。[方法]将靶向CD 163基因第7外显子的sgRNA质粒(pX330-sgCD163)转染至iPAMs,转染48 h后通过有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型鉴定,通过Western blotting和脱靶分析来筛选CD 163基因敲除的iPAMs;通过实时荧光定量PCR、Western blotting、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和半数细胞培养物感染量(50%tissue culture infective dose,TCID 50)等试验分析CD 163基因敲除的iPAMs感染PRRSV的特征。[结果]测序结果表明,100株单克隆细胞中有1株CD 163双等位基因敲除的iPAMs,敲除效率为1%;Western blotting结果显示,CD 163基因敲除的iPAMs中检测不到CD163蛋白的表达,且在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。实时荧光定量PCR结果表明,与野生型iPAMs组相比,CD 163基因敲除的iPAMs组病毒拷贝数极显著降低(P<0.01);Western blotting和IFA结果表明,在接毒24 h后的CD 163基因敲除的iPAMs组中未检测到PRRSV-N蛋白的表达;TCID 50试验结果同样显示,在CD 163基因敲除的iPAMs组中未观察到细胞病变。[结论]本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了CD 163基因敲除的iPAMs,该细胞系可以完全抵抗PRRSV感染。该细胞系的建立为后续研究PRRSV与CD163蛋白的互作机制提供了新型试验材料。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 CD 163基因 永生化猪肺泡巨噬细胞系(iPAMs) 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)

在线阅读 下载PDF 职称材料

木犀草素和槲皮素体外抗炎作用研究 被引量：94

15

作者 周霄楠 韩超 +2 位作者 宋鹏琰 赵兴华 钟秀会 《动物医学进展》 北大核心 2017年第10期56-61,共6页

旨在观察木犀草素及槲皮素对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞瘤细胞系(RAW264.7)分泌NO、TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-10的影响,评价其抗炎效果。试验采用LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型,选对数生长期细胞,设对照组、LPS组、木犀草素5、2.5、... 旨在观察木犀草素及槲皮素对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞瘤细胞系(RAW264.7)分泌NO、TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-10的影响,评价其抗炎效果。试验采用LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型,选对数生长期细胞,设对照组、LPS组、木犀草素5、2.5、1.25μg/mL组,槲皮素10、5、2.5μg/mL组。药物预处理4h后致炎24h,Griess法测定细胞培养上清液中NO的含量,ELISA测定上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-10的含量。试验数据表明,木犀草素及槲皮素均可极显著地抑制LPS诱导RAW264.7细胞后NO、TNF-α、IL-1β以及IL-6含量的升高(P<0.01),且在一定程度上呈剂量依赖性。结果表明,木犀草素及槲皮素在体外具有良好的抗炎效果。 展开更多

关键词 木犀草素 槲皮素 抗炎作用 小鼠巨噬细胞瘤细胞系

在线阅读 下载PDF 职称材料