甲氧苄啶纳米抗体噬菌体展示文库的构建及初步筛选

1

作者 刘翔宇 尹永康 +4 位作者 张红 宋茜 王玲 张启迪 梁晓 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期5074-5085,共12页

【目的】构建甲氧苄啶(trimethoprim,TMP)纳米抗体(nanobody,Nb)噬菌体展示文库,制备TMP高亲和力纳米抗体,为TMP免疫分析方法的建立提供新型抗体材料。【方法】通过活性酯酶法将TMP半抗原Hapten B与牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH... 【目的】构建甲氧苄啶(trimethoprim,TMP)纳米抗体(nanobody,Nb)噬菌体展示文库,制备TMP高亲和力纳米抗体,为TMP免疫分析方法的建立提供新型抗体材料。【方法】通过活性酯酶法将TMP半抗原Hapten B与牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联制备2种免疫原,Hapten A和Hapten B与卵清白蛋白(OVA)偶联制备2种包被原。采用磺胺增效剂类药物单克隆抗体5C4,通过间接ELISA方法验证免疫原和包被原偶联效果。将免疫原与弗氏佐剂混合,先后对羊驼进行基础免疫和加强免疫,监测每次免疫后羊驼抗血清效价及对TMP的亲和力,选取效价及TMP亲和力最高的外周血作为纳米抗体基因来源,构建噬菌体展示文库。分离羊驼外周血总淋巴细胞,扩增重链抗体可变区纳米抗体基因(VHH),插入噬菌粒,电击转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞构建初始噬菌体纳米抗体展示文库。经辅助噬菌体救援,采用同源包被原浓度梯度递减包被、酸洗脱、TMP浓度梯度递减洗脱筛选策略筛选TMP高亲和力噬菌体并测序,原核表达纳米抗体,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纳米抗体融合蛋白。【结果】间接ELISA检测结果显示,2种免疫原与2种包被原在稀释18000倍时D 450 nm值仍高于1.25。免疫原Hapten B-BSA 5次免疫后羊驼抗血清效价为1∶88000,对TMP的半数抑制浓度(IC 50)为12.21μg/L,但Hapten B-KLH 4次免疫后羊驼抗血清效价为1∶11000,对TMP的IC 50为30.56μg/L。以Hapten B-BSA五免后羊驼外周血为纳米抗体基因来源构建噬菌体展示文库,初始库容量为6.08×10^(7) CFU/mL,目的片段插入率为96%,噬菌体展示文库多样性良好。经4轮筛选后,获得3株TMP高亲和力噬菌体,测序分析后获得1株TMP高亲和力纳米抗体及序列。SDS-PAGE和Western blotting鉴定融合蛋白大小约为17 ku,蛋白含量80%以上。【结论】本研究成功构建TMP纳米抗体噬菌体展示文库,获得1株TMP高亲和力纳米抗体。研究结果为磺胺增效剂类药物纳米抗体的制备提供了理论依据和技术支持,为兽药等小分子新型识别材料的制备提供了新的思路。 展开更多

关键词 甲氧苄啶 纳米抗体 噬菌体展示文库

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微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库的构建 被引量：6

2

作者 姚龙泉 尹继刚 +1 位作者 张西臣 李建华 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期26-28,42,共4页

目的为筛选微小隐孢子虫保护性抗原基因,构建了微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库。方法用Trizol试剂提取微小隐孢子虫总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,用EcoRⅠ和HindⅢ消化接头,使形... 目的为筛选微小隐孢子虫保护性抗原基因,构建了微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库。方法用Trizol试剂提取微小隐孢子虫总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,用EcoRⅠ和HindⅢ消化接头,使形成两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。经Mini Column纯化,收集400bp以上的双链cDNA片段,将其连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示文库。结果经测定,库容量为1.2×107pfu/mL,重组率为96.7%,扩增后文库滴度为2.4×1010pfu/mL。对随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,92%的插入片段大于400bp。结论成功构建了微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库。 展开更多

关键词 微小隐孢子虫 T7噬菌体展示文库

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新孢子虫cDNAT7噬菌体展示文库的构建及筛选 被引量：3

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作者 王铭 高洋 +3 位作者 程子英 郑君 贾洪林 宋铭忻 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期277-280,共4页

为筛选犬新孢子虫相关抗原,本研究利用T7噬菌体展示技术构建犬新孢子虫cDNA文库,并利用阳性血清筛选新型犬新孢子虫抗原蛋白。所构建的新孢子虫cDNA文库的原始文库重组克隆数为6×106pfu,扩增后文库滴度为3×1010pfu/mL。分别... 为筛选犬新孢子虫相关抗原,本研究利用T7噬菌体展示技术构建犬新孢子虫cDNA文库,并利用阳性血清筛选新型犬新孢子虫抗原蛋白。所构建的新孢子虫cDNA文库的原始文库重组克隆数为6×106pfu,扩增后文库滴度为3×1010pfu/mL。分别提取犬新孢子虫免疫小鼠血清和感染小鼠血清中的IgG,并利用纯化的IgG对构建的新孢子虫cDNA文库进行筛选。经过3轮筛选,共鉴定出14个不同的犬新孢子虫基因插入片段。经过分析,有7个基因编码的是功能未知蛋白,其它为蛋白质合成相关蛋白、核苷酸代谢相关蛋白、核糖体蛋白、微线体蛋白、棒状体蛋白和致密颗粒蛋白。对这些蛋白的进一步研究将有助于开发新孢子虫病的诊断试剂和疫苗。 展开更多

关键词 新孢子虫病 T7噬菌体展示文库 抗原候选基因

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家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库的构建和免疫相关基因的淘选 被引量：3

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作者 胡翠美 王菲 +1 位作者 宋亮 夏庆友 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期642-649,共8页

中肠是昆虫重要的免疫防御器官之一。为探究家蚕中肠的分子免疫机制,尤其是针对不同病原体的模式识别分子或结合蛋白,以家蚕5龄第3天幼虫中肠为材料,构建家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库,并分别以几丁质和脂多糖为配体,通过不同方法进行... 中肠是昆虫重要的免疫防御器官之一。为探究家蚕中肠的分子免疫机制,尤其是针对不同病原体的模式识别分子或结合蛋白,以家蚕5龄第3天幼虫中肠为材料,构建家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库,并分别以几丁质和脂多糖为配体,通过不同方法进行文库的生物淘选。结果共获得10个基因片段,其中在以脂多糖为配体的淘选中获得了β-1,3葡聚糖识别蛋白4,该分子是已知的模式识别受体。另外还获得了多个免疫相关候选基因,如分别编码几丁质结合蛋白、翻译控制的肿瘤蛋白、氨肽酶N、脂肪酰辅酶A结合蛋白等的几个基因。研究结果为深入开展家蚕中肠免疫功能的研究提供了重要线索。 展开更多

关键词 家蚕 中肠 T7噬菌体展示文库 淘选 模式识别分子

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噬菌体展示文库的筛选技术 被引量：4

5

作者 李丽芳 张映 《生物技术通报》 CAS CSCD 2005年第4期36-38,共3页

噬菌体展示技术(PhageDisplayTechniques,PDT)是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术。该技术作为筛选与多种靶分子(如抗体、酶类、细胞表面受体等)具有特异性亲和力或活性的肽的一个有效方法,自问世以来,已取得了很大的发展,并被... 噬菌体展示技术(PhageDisplayTechniques,PDT)是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术。该技术作为筛选与多种靶分子(如抗体、酶类、细胞表面受体等)具有特异性亲和力或活性的肽的一个有效方法,自问世以来,已取得了很大的发展,并被广泛地应用于基因治疗、基因疫苗研究、抗原表位研究、药物设计、研究细胞信号传导等领域[1]。但该技术在两方面仍需进一步完善:(1)寻求更为有效的表达载体;(2)进一步完善筛选方法。 展开更多

关键词 噬菌体展示文库 筛选技术 肽库 抗体库 生物技术

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噬菌体表面展示文库筛选人干细胞因子模拟肽 被引量：1

6

作者 苏林 孔燕 +2 位作者 刘长征 杨克恭 陈松森 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期351-356,共6页

目的用噬菌体表面展示文库筛选具有人干细胞因子(hSCF)生物学活性的模拟肽。方法采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)从噬菌体环七肽库和十二肽库筛选与重组hSCF受体(rc-kit/Ig1-3)有较高亲和力的噬菌体克隆,提取噬菌体单链DNA进行序列测定,... 目的用噬菌体表面展示文库筛选具有人干细胞因子(hSCF)生物学活性的模拟肽。方法采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)从噬菌体环七肽库和十二肽库筛选与重组hSCF受体(rc-kit/Ig1-3)有较高亲和力的噬菌体克隆,提取噬菌体单链DNA进行序列测定,根据序列测定结果合成阳性小肽,四甲基偶氮噻唑盐(MTT)法检测合成小肽刺激UT-7细胞增殖的活性。结果经3轮筛选获得11个来源于环七肽库和8个来源于十二肽库与rc-kit/Ig1-3结合活性较高的噬菌体克隆,DNA测序结果显示环七肽库筛选到1个共有序列DPSPHTH,十二肽库没有筛选到共有序列。序列比对分析显示,这些小肽与hSCF没有同源序列。MTT法测定结果表明,合成的4个小肽均能促进UT-7细胞增殖,其中CE16和LE20刺激效果明显。结论获得4个具有较高hSCF生物学活性的模拟肽。 展开更多

关键词 噬菌体表面展示文库 人干细胞因子 模拟肽 筛选 酶联免疫吸附测定法

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PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库的构建及鉴定 被引量：1

7

作者 王国栋 邓小芸 刘书梅 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期1372-1376,共5页

【目的】构建PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库，为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础。【方法】分离纯化PK15细胞mRNA，先后合成第一链和第二链cDNA，经平末端修饰后，定向导入EcoR Ⅰ和HindⅢ接头，再由EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消... 【目的】构建PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库，为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础。【方法】分离纯化PK15细胞mRNA，先后合成第一链和第二链cDNA，经平末端修饰后，定向导入EcoR Ⅰ和HindⅢ接头，再由EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化，与噬菌体载体臂相连，然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装，形成初级cDNAT7噬菌体展示文库，并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量。【结果】经噬斑试验鉴定，初级文库滴度为2．0×10^5PFU／mL，扩增后滴度达6．0×10^10PFU／mL。PCR鉴定结果显示，文库的重组率为95．83％，且插入片段主要分布于500-2000bp，其中500～750bp的占21．73％，750～100bp的占21．73％，1000-2000bp的占39．13％。随机挑选20个克隆进行测序，发现均为猪源序列。【结论】构建的PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率，质量良好，符合后续文库筛选的要求，可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用。 展开更多

关键词 PK15细胞 CDNA T7噬菌体展示文库 构建 鉴定

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噬菌体展示文库技术及在疫苗研制中的应用现状 被引量：3

8

作者 吕雪峰 任锐 +2 位作者 穆国东 苏双 许志林 《吉林畜牧兽医》 2010年第1期14-16,共3页

噬菌体展示文库技术已成为高效表达筛选功能性蛋白的新一代技术,广泛应用于药物筛选及多肽疫苗研制等研究领域。现对噬菌体展示技术及其在疫苗研制中的研究现状作简要的综述。

关键词 噬菌体 噬菌体展示文库 疫苗 应用

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犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库的构建

9

作者 韩岩岩 宋德光 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第5期49-52,共4页

试验旨在筛选水泡性口炎病毒的受体,构建犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。通过用Trizol试剂提取犊牛口腔黏膜上皮细胞总RNA,然后分离和纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,然后用EcoRⅠ和H... 试验旨在筛选水泡性口炎病毒的受体,构建犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。通过用Trizol试剂提取犊牛口腔黏膜上皮细胞总RNA,然后分离和纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,然后用EcoRⅠ和HindⅢ酶消化双链cDNA末端接头,使双链cDNA 2端含有EcoRⅠ和HindⅢ黏性末端。所有处理后的双链cDNA,经Mini Column纯化,收集400bp以上的双链cDNA片段,将其连接带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示文库。经测定未扩增文库的滴度为1.3×107PFU/mL,重组率为95.8%,扩增后文库滴度为2.6×1010 PFU/mL。随机挑取100个噬菌斑进行PCR鉴定,95%的插入片段大于400bp。结果表明成功构建了犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。 展开更多

关键词 口腔黏膜上皮细胞 T7噬菌体展示文库 水泡性口炎病毒

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新疆双峰驼纳米抗体噬菌体展示文库多样性的生物信息学分析

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作者 冯亚宁 姜志强 +1 位作者 马晓玲 李江伟 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1533-1538,共6页

【目的】骆驼免疫系统中只存在重链抗体,其可变区VHH片段是最小的天然抗体片段。通过对双峰驼VHH基因进行序列分析,了解双峰驼VHH基因特征,分析VHH文库多样性组成。【方法】采用新疆双峰驼VHH特异引物扩增全部抗体基因片段,连接到M13噬... 【目的】骆驼免疫系统中只存在重链抗体,其可变区VHH片段是最小的天然抗体片段。通过对双峰驼VHH基因进行序列分析,了解双峰驼VHH基因特征,分析VHH文库多样性组成。【方法】采用新疆双峰驼VHH特异引物扩增全部抗体基因片段,连接到M13噬菌粒载体上,与p III蛋白融合表达在噬菌体表面,构建噬菌体展示文库。基因测序和菌落PCR方法,分析文库大小和阳性克隆插入率。NCBI-Ig GBLAST工具对抗体序列进行IMGT编号命名,Web Logo工具分析抗体保守序列分布频率,MEGA6软件对VHH序列进行同源性比对和系统进化树构建。【结果】利用免疫的新疆双峰驼淋巴细胞,构建了库容量为1.4×109的VHH抗体噬菌体展示文库。对91个随机挑选的文库TG1单菌落进行PCR。结果表明该文库VHH阳性插入率为97%,DNA测序表明文库多样性为97.8%。对91个克隆DNA测序结果进一步分析表明,这些基因中除2个为常规VH抗体外,其余均为重链VHH抗体。根据抗体序列中的特征氨基酸分布,将91个抗体序列划分为7个亚群。【结论】构建的新疆双峰驼VHH文库多样性较好,生物信息学分析揭示出文库中多样性克隆的分布和特征,有助于新疆双峰驼纳米抗体噬菌体展示文库的进一步构建。 展开更多

关键词 双峰驼 单域抗体 噬菌体展示文库 VHH序列 生物信息学分析

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鸡法氏囊三肽囊素阳性细胞cDNA酵母展示文库的筛选

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作者 陶明华 廖凯 +2 位作者 张国强 谌南辉 胡松年 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期326-331,共6页

在禽类和哺乳类中存在的三肽囊素(Bursin),对禽类和哺乳类淋巴细胞具有重要的免疫调节功能及生理学活性。牛骨髓和肝脏中含有三肽囊素(Bursin)序列的前囊素(pro Bursin)的分离使我们假设:在鸟类和哺乳类中存在的三肽囊素可能是由前囊素... 在禽类和哺乳类中存在的三肽囊素(Bursin),对禽类和哺乳类淋巴细胞具有重要的免疫调节功能及生理学活性。牛骨髓和肝脏中含有三肽囊素(Bursin)序列的前囊素(pro Bursin)的分离使我们假设:在鸟类和哺乳类中存在的三肽囊素可能是由前囊素酶解而来的。为了验证这种假设我们通过提取鸡法氏囊三肽囊素阳性细胞的mRNA、构建cDNA酵母展示文库、对酵母展示文库用流式细胞仪进行三轮抗三肽囊素单克隆抗体以及FITC标记山羊抗小鼠IgM单克隆抗体的分选,最后对第3次分选得到的酵母克隆随机挑20个进行测序。这20个克隆中并没有编码三肽囊素的核酸序列,因此我们推测:在鸡法氏囊内三肽囊素不是由其前体囊素的裂解而来,而可能是由一种类似微生物体内低分子量的多肽通过非核糖体途径有多肽合成聚合酶的聚合作用合成的,这需要进一步的试验验证。 展开更多

关键词 三肽囊素cDNA展示文库 流式细胞仪 分选

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构建金葡菌N315 T7噬菌体cDNA展示文库,探索金葡菌耐药性扩散机制

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《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期I0001-I0001,共1页

耐药性的产生与广泛传播一直以来都严重干扰着金葡菌的临床防治，使得近年来金葡菌感染逐步呈现发病率高、耐药性强、治疗困难、病死率高的态势。因此，能否有效的控制耐药性产生与传播成为影响金葡菌感染防治工作的关键。耐甲氧西林金... 耐药性的产生与广泛传播一直以来都严重干扰着金葡菌的临床防治，使得近年来金葡菌感染逐步呈现发病率高、耐药性强、治疗困难、病死率高的态势。因此，能否有效的控制耐药性产生与传播成为影响金葡菌感染防治工作的关键。耐甲氧西林金葡菌（MRSA）多重耐药性的获得与其染色体上携带的葡萄球菌盒式染色体元件（SCC）密切相关。 展开更多

关键词 多重耐药性 展示文库 CDNA 耐甲氧西林金葡菌 金葡菌感染 扩散 临床防治 感染防治

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驼源天然噬菌体纳米抗体文库的构建及抗CD22纳米抗体的筛选 被引量：1

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作者 何婉钧 崔愷 +2 位作者 张西倩 蒋丹 徐广贤 《细胞与分子免疫学杂志》 北大核心 2025年第3期254-261,共8页

目的筛选出抗CD22特异性纳米抗体,为其作为免疫治疗制剂提供基础。方法构建天然噬菌体纳米抗体展示文库,分析其多样性。以生物素化CD22抗原为靶点,进行3轮生物素链霉亲和素液相筛选法,初步通过ELISA和基因测序鉴定抗CD22纳米抗体序列。... 目的筛选出抗CD22特异性纳米抗体,为其作为免疫治疗制剂提供基础。方法构建天然噬菌体纳米抗体展示文库,分析其多样性。以生物素化CD22抗原为靶点,进行3轮生物素链霉亲和素液相筛选法,初步通过ELISA和基因测序鉴定抗CD22纳米抗体序列。结果经测定,构建的噬菌体纳米抗体展示文库容量为3.89×10~9 CFU/mL,插入有效片段高于85%。基于此文库,初步筛选出7条抗CD22纳米抗体,其氨基酸序列比对结果显示,整体相似性为70.34%,均为亲水性蛋白。蛋白-蛋白复合物对接预测结果表明,5条纳米抗体序列的模拟蛋白都可以配对连接到CD22,主要作用力为疏水相互作用和氢键。结论本研究为靶向CD22的嵌合抗原受体T细胞的研究提供基础,成功构建天然噬菌体纳米抗体展示文库,获得5条抗CD22特异性的纳米抗体。 展开更多

关键词 CD22 纳米抗体 噬菌体展示文库

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基于噬菌体展示技术筛选鉴定HLA-G肿瘤靶向锚定蛋白

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作者 颜家耀 仲丽晴 刘宝瑞 《中国肿瘤生物治疗杂志》 北大核心 2025年第7期689-697,共9页

目的:基于噬菌体展示靶向锚定蛋白文库,以人白细胞抗原G(HLA-G)为靶点筛选锚定序列作为HLA-G结合蛋白(HGBP)并评价其功能。方法:利用TCGA、GTEx等数据库分析肿瘤组织中HLA-G表达与临床预后和免疫浸润的相关性。利用噬菌体展示靶向锚定... 目的:基于噬菌体展示靶向锚定蛋白文库,以人白细胞抗原G(HLA-G)为靶点筛选锚定序列作为HLA-G结合蛋白(HGBP)并评价其功能。方法:利用TCGA、GTEx等数据库分析肿瘤组织中HLA-G表达与临床预后和免疫浸润的相关性。利用噬菌体展示靶向锚定蛋白文库对HLA-G胞外片段进行生物淘选并随机挑取单克隆进行测序。通过ELISA、免疫荧光染色鉴定优势噬菌体克隆的功能。利用原核体系生产纯化HGBP,通过ELISA、表面等离子共振(SPR)、免疫荧光染色法评价其亲和力及肿瘤特异性结合能力。结果:生物信息学分析发现,HLA-G在肿瘤组织中普遍呈高表达,其与临床总生存期、免疫细胞浸润水平具有相关性(P<0.05)。5轮噬菌体文库筛选后获得优势克隆,ELISA及免疫荧光染色结果均显示,优势噬菌体对HLA-G阳性细胞结合显著强于阴性细胞(P<0.05, P<0.001)。经纯化生产的HGBP与HLA-G之间的亲和力可达17 nmol/L,ELISA结果显示,HGBP与HLA-G分子的结合显著(P<0.05);免疫荧光染色结果表明,HGBP能与HLA-G阳性细胞特异性结合(P<0.01)。结论:经噬菌体展示文库筛选出的HGBP对HLA-G具有高亲和力,可特异性结合肿瘤细胞表达的HLA-G。 展开更多

关键词 人白细胞抗原G 噬菌体展示文库 靶向锚定蛋白 肿瘤靶向治疗

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噬菌体展示耐药突变HIV-1蛋白酶敏感切割位点六肽随机文库的构建 被引量：1

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作者 卢海妹 周波 +6 位作者 潘卫 贾建安 王锦红 温宗梅 何俊 陈露 邓松华 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期403-406,共4页

目的构建耐药性突变HIV-1蛋白酶(protease PR)敏感切割位点序列体外噬菌体筛选模型,研究HIV-1蛋白酶耐药性突变与敏感切割序列的关系。方法用含随机核苷酸序列的引物PCR方法对HIV-1gag基因上的CAP2片段的PR切割位点处的氨基酸序列进行... 目的构建耐药性突变HIV-1蛋白酶(protease PR)敏感切割位点序列体外噬菌体筛选模型,研究HIV-1蛋白酶耐药性突变与敏感切割序列的关系。方法用含随机核苷酸序列的引物PCR方法对HIV-1gag基因上的CAP2片段的PR切割位点处的氨基酸序列进行随机化,再将重组CAP2片段和NC片段拼接克隆于噬菌体展示载体LD3-pCANT-AB5S上,建立HIV-1蛋白酶靶蛋白切割位点随机化的噬菌体展示文库。结果该噬菌体展示文库库容量为2.6×106,滴度为4.1×1015TU·L-1,CAP2片段插入率为47.8%;序列分析显示切割位点中随机化的核苷酸与氨基酸均呈随机性分布。结论成功地构建HIV-1蛋白酶的敏感切割序列噬菌体筛选文库,为筛选到突变PR敏感切割序列噬菌体及研究耐药HIV-1蛋白酶抑制剂与突变PR的关系打下基础。 展开更多

关键词 人类免疫缺陷病毒-1 蛋白酶 耐药突变 噬菌体展示文库

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结核分枝杆菌T7噬菌体展示基因组DNA文库的构建与鉴定 被引量：1

16

作者 曾焱华 王丽 +3 位作者 刘海灿 游晓拢 邓湘赢 万康林 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1120-1123,共4页

目的利用T7噬菌体作为载体,构建结核分枝杆菌的基因组DNA文库。方法提取MTB的基因组DNA,用EcoR I和Hind III进行双酶切,以对基因组DNA进行片段化,并在其末端加上定向的EcoR I和Hind III黏性末端,用DNA片段纯化分离柱除去小于200bp的片... 目的利用T7噬菌体作为载体,构建结核分枝杆菌的基因组DNA文库。方法提取MTB的基因组DNA,用EcoR I和Hind III进行双酶切,以对基因组DNA进行片段化,并在其末端加上定向的EcoR I和Hind III黏性末端,用DNA片段纯化分离柱除去小于200bp的片段和多余接头。将DNA片段与T7 10-3b噬菌体连接,经包装蛋白进行包装后转入BLT5403宿主菌以构建T7噬菌体展示基因组DNA文库,并检测文库的滴度和随机性。结果成功提取到较高质量的MTB基因组DNA;构建的T7噬菌体展示基因组DNA文库的滴度约为6×106 pfu/cm3;用PCR检测结果表明,在随机挑取的16个噬菌斑中,其重组率为100%,且插入片段都介于250~2 000bp左右。结论成功构建了MTB T7噬菌体展示基因组DNA文库,为从基因组范围筛选MTB的优势抗原奠定了前期实验基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 基因组DNA T7噬菌体展示文库

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利用噬菌体表面展示技术构建人肝癌细胞的cDNA表达文库 被引量：3

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作者 张林 刘杞 孙航 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2005年第3期329-332,397,共5页

目的:筛选对人肝再生增强因子(hALR)高反应性的肝癌细胞株,以此作为细胞来源,利用噬菌体展示技术构建出含有其cDNA表达文库,为进一步从文库中筛选hALR相互作用蛋白奠定基础。方法:hALR刺激不同肝癌细胞株,从中筛选出对hALR刺激有高反应... 目的:筛选对人肝再生增强因子(hALR)高反应性的肝癌细胞株,以此作为细胞来源,利用噬菌体展示技术构建出含有其cDNA表达文库,为进一步从文库中筛选hALR相互作用蛋白奠定基础。方法:hALR刺激不同肝癌细胞株,从中筛选出对hALR刺激有高反应性的细胞株。以PolyATtractSystem1000提取mRNA,用T7Select10-3OrientExpresscDNACloningSystem和RandomPrimer构建它的cDNA噬菌体表面展示文库;以噬菌体滴度分析和PCR评价文库质量。结果:hALR对不同肝癌细胞株均有不同程度的促增殖作用,且呈明显的剂量依赖关系。对QGY促增殖作用最强,以它作为建库细胞。对所建文库进行噬菌体滴度分析,表明原始cDNA文库含有2×107独立的重组子;随机挑取重组子进行PCR鉴定,发现插入长度在0.2～2kb,平均为0.6kb,能够较好地代表来源细胞中mRNA所表达的几乎所有信息。结论:hALR对所检测的肝癌细胞株均有促增殖作用;QGY细胞对hALR刺激有最高的反应性;以它为基础,构建出库容量为2×107的高质量噬菌体表面展示文库。 展开更多

关键词 肝再生增强因子 肝癌细胞 CDNA 噬菌体展示文库

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东方田鼠肝脏裂解物筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库 被引量：2

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作者 孙焕 刘金明 +6 位作者 孙帅 宋震宇 石耀军 陆珂 李浩 金亚美 林矫矫 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期592-596,617,共6页

东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为寻找东方田鼠抗血吸虫抗性相关靶基因,探索其分子机理,我们将日本血吸虫童虫与东方田鼠不同组织/器官裂解物共培养,比较它们对血吸虫童虫的杀伤效果,之后,以杀伤效果较好的肝脏裂解物为探针,以亲和淘... 东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为寻找东方田鼠抗血吸虫抗性相关靶基因,探索其分子机理,我们将日本血吸虫童虫与东方田鼠不同组织/器官裂解物共培养,比较它们对血吸虫童虫的杀伤效果,之后,以杀伤效果较好的肝脏裂解物为探针,以亲和淘洗方法筛选日本血吸虫成虫(44d)噬菌体展示cDNA文库。经三轮筛选后,随机挑取92个噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析,获得了19个有效EST序列,其中15条EST序列与已知基因或表达序列标签同源,4个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性,为新的表达序列标签。对19个有效EST编码蛋白的功能预测结果显示,其中6个为卵壳蛋白(Eggshell protein)相关基因,10个EST及其编码蛋白的功能与血吸虫基因表达调控及蛋白质加工修饰相关。研究结果提示,东方田鼠直接或间接地影响血吸虫基因表达,进而影响血吸虫的发育,可能是东方田鼠具有抗血吸虫特性的一个重要分子机理。 展开更多

关键词 日本血吸虫 东方田鼠 筛选 噬菌体展示cDNA文库

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东方田鼠肺脏裂解物筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库 被引量：2

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作者 孙焕 刘金明 +6 位作者 孙帅 宋震宇 石耀军 陆珂 李浩 金亚美 林矫矫 《中国兽医寄生虫病》 2008年第2期5-9,共5页

目的寻找与东方田鼠抗性相关的血吸虫靶基因。方法以东方田鼠肺脏裂解物为探针,亲和淘洗筛选日本血吸虫成虫(44 d)噬菌体展示cDNA文库。三轮筛选后,随机挑取76个阳性噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析。结果共获得了13个有效EST序... 目的寻找与东方田鼠抗性相关的血吸虫靶基因。方法以东方田鼠肺脏裂解物为探针,亲和淘洗筛选日本血吸虫成虫(44 d)噬菌体展示cDNA文库。三轮筛选后,随机挑取76个阳性噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析。结果共获得了13个有效EST序列,其中8条EST序列与已知基因或表达序列标签同源,5个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性,为新的表达序列标签。功能预测结果显示,这13个有效EST编码蛋白主要与血吸虫基因表达调控及蛋白质加工修饰相关。结论东方田鼠直接或间接地影响血吸虫基因表达,进而影响血吸虫的发育,可能是东方田鼠具有抗血吸虫特性的一个重要分子机理。 展开更多

关键词 日本血吸虫 东方田鼠 筛选 噬菌体展示cDNA文库

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基于M13噬菌体展示单链抗体文库的新型蛋白质均衡器的研制及其在肾病患者尿蛋白分析中的应用 被引量：1

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作者 赵鹏 陶定银 +2 位作者 梁振 张丽华 张玉奎 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期249-253,共5页

通过将展示单链抗体(scFv)文库的M13噬菌体固定于冷凝胶整体柱表面制备了一种新型蛋白质均衡器。由于展示的scFv片段具有种类多、数目大以及与蛋白质结合的特异性强等优点,因此其非常适合用于复杂蛋白质样品的预处理。将肾病患者尿蛋白... 通过将展示单链抗体(scFv)文库的M13噬菌体固定于冷凝胶整体柱表面制备了一种新型蛋白质均衡器。由于展示的scFv片段具有种类多、数目大以及与蛋白质结合的特异性强等优点,因此其非常适合用于复杂蛋白质样品的预处理。将肾病患者尿蛋白在平衡器上反复上样5次后,依次使用2mol/LNaCl、50mmol/LGly-HCl(pH2.5)和凝血酶溶液洗脱与均衡器结合的蛋白质,收集各馏分,并采用串联微柱反相液相色谱-电喷雾质谱进行蛋白质的分离鉴定。与未经均衡器处理的样品相比,鉴定的蛋白质数目由142个提高到396个。此外,凝胶电泳的分析结果显示,在上样流出液中蛋白质的浓度差异明显变小,大量的高丰度蛋白质存在于NaCl洗脱液中。上述结果表明,基于M13噬菌体展示scFv文库的新型蛋白质均衡器能够有效减小样品中蛋白质的浓度差异,有利于发现更多的低丰度蛋白质。 展开更多

关键词 蛋白质均衡器 M13噬菌体展示单链抗体文库 串联微柱反相液相色谱-电喷雾质谱 蛋白质 肾病患者 尿

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