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黑曲霉尿苷/尿嘧啶营养缺陷型转化系统的构建及应用
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作者 王小平 宋问 +6 位作者 张霏 刘燕 王升帆 邵东 梁玲玲 许新德 郑建永 《浙江工业大学学报》 北大核心 2024年第1期105-111,共7页
黑曲霉(Aspergillus niger)是一种重要的工业发酵菌株,它具有强大的蛋白分泌表达能力。为了提高黑曲霉遗传操作效率及优化重组菌株的筛选策略,构建以尿苷/尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的转化系统。利用CRISPR/Cas9技术实现pyrG基因的敲除... 黑曲霉(Aspergillus niger)是一种重要的工业发酵菌株,它具有强大的蛋白分泌表达能力。为了提高黑曲霉遗传操作效率及优化重组菌株的筛选策略,构建以尿苷/尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的转化系统。利用CRISPR/Cas9技术实现pyrG基因的敲除,在含有尿嘧啶核苷和5-氟乳清酸(5-FOA)的抗性培养基中筛选表型正确的转化子。经基因组PCR验证,黑曲霉营养缺陷型菌株可稳定遗传。利用该转化系统可成功实现增强型绿色荧光蛋白在黑曲霉中的表达。通过结合增强型绿色荧光蛋白和流式细胞仪建立了黑曲霉转化子的高通量筛选模型。 展开更多
关键词 黑曲霉 CRISPR/Cas9 基因敲除 尿嘧啶营养缺陷型 增强绿色荧光蛋白(EGFP)
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非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫对雏鸡组织荷虫量及脾脏细胞因子表达水平的影响
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作者 刘思勤 祁浩瑞 +1 位作者 雷佳佳 任超 《湖南农业大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期76-81,共6页
将2周龄雏鸡随机分成3组,试验组雏鸡颈部皮下注射0.l mL 107个/mL非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(NRTUAs),感染对照组和空白对照组分别注射等剂量的RH虫株和PBS;于感染的第4天采集各组雏鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸、法氏... 将2周龄雏鸡随机分成3组,试验组雏鸡颈部皮下注射0.l mL 107个/mL非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(NRTUAs),感染对照组和空白对照组分别注射等剂量的RH虫株和PBS;于感染的第4天采集各组雏鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸、法氏囊、胸腺、脑、胸肌、腿肌组织,提取其DNA,采用绝对荧光定量PCR检测各器官组织的荷虫量;提取剩余脾脏组织的RNA,采用相对荧光定量PCR仪检测脾脏中IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL26、STAT1、IRF1、IFN-γ、IL-10的转录水平。结果表明,雏鸡感染弓形虫的第4天,各器官组织不能完全清除NRTUAs,除肝脏、睾丸、腿肌和脑组织外,NRTUAs组的组织荷虫量均显著低于RH组的;NRTUAs刺激脾脏不会使免疫相关细胞因子的转录水平显著上调或下调,说明NRTUAs是致病性较低的虫株,不会刺激雏鸡脾脏引发强烈的先天性免疫反应,不会引起促炎、抑炎因子的过量产生。 展开更多
关键词 雏鸡 非复制尿嘧啶营养缺陷型弓形虫 组织荷虫量 脾脏细胞因子表达水平 荧光定量PCR
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耐盐酵母尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建 被引量:4
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作者 赵秀丽 张珊 +2 位作者 宋璐 王檬 侯丽华 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第8期11-16,共6页
在酱油高盐稀态发酵过程中通常添加假丝酵母(T酵母)和鲁氏酵母(S酵母)来增强酱油的风味品质。但是目前对T酵母和S酵母进行遗传操作没有相应的营养缺陷型菌株。因此,对T酵母和S酵母分别进行甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate,EMS)诱... 在酱油高盐稀态发酵过程中通常添加假丝酵母(T酵母)和鲁氏酵母(S酵母)来增强酱油的风味品质。但是目前对T酵母和S酵母进行遗传操作没有相应的营养缺陷型菌株。因此,对T酵母和S酵母分别进行甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate,EMS)诱变和紫外诱变,以酵母的致死率为诱变标准做单因素试验,得到最佳的EMS质量分数、EMS作用时间,紫外照射距离、紫外照射时长,酵母菌浓度。通过筛选、测序获得尿嘧啶营养缺陷型菌株,为后续耐盐酵母的分子生物学研究提供理论依据。 展开更多
关键词 S酵母 T酵母 EMS诱变 紫外诱变 尿嘧啶营养缺陷型
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杂交技术培育金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株 被引量:1
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作者 鲍大鹏 万佳宁 +5 位作者 卢绪志 余养朝 张光忠 茅文俊 王莹 周陈力 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期225-230,共6页
为培育金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株,将金针菇尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株NG1-65、NG1-92和NG1-95(A1B1)分别与可亲和的野生型单核菌株DG1-29(A2B2)杂交得到3株杂交菌株SGN1、SGN2和SGN3,通过栽培试验获得这3株双核体菌株的子实体... 为培育金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株,将金针菇尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株NG1-65、NG1-92和NG1-95(A1B1)分别与可亲和的野生型单核菌株DG1-29(A2B2)杂交得到3株杂交菌株SGN1、SGN2和SGN3,通过栽培试验获得这3株双核体菌株的子实体,收集孢子后通过涂布于选择培养基和镜检获得206株尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株,从中随机选取30株单核体菌株,通过单单杂交得到38株尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株。结果表明,这些尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株在不含尿嘧啶添加物的基本培养基中无法正常生长,在PDA培养基上生长速率低于野生型菌株,在添加尿嘧啶的PDAU培养基上可以不同程度地恢复正常生长。本研究结果为进一步利用营养缺陷型菌株开展金针菇杂交育种、菌种保护等方面研究提供了一定的技术支撑。 展开更多
关键词 金针菇 尿嘧啶营养缺陷型 双核体 菌种保护
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香菇尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选与分子验证 被引量:8
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作者 王连会 茅文俊 鲍大鹏 《上海农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第3期6-9,共4页
筛选出对5'-FOA敏感性较高的香菇‘L26'菌株,采用原生质体紫外诱变技术,获得‘L26'菌株18株尿嘧啶营养缺陷型突变菌株。分子验证表明:其中8株菌株的尿嘧啶合成代谢路径发生了基因突变。6个菌株的pyrF基因发生突变,2个菌株的... 筛选出对5'-FOA敏感性较高的香菇‘L26'菌株,采用原生质体紫外诱变技术,获得‘L26'菌株18株尿嘧啶营养缺陷型突变菌株。分子验证表明:其中8株菌株的尿嘧啶合成代谢路径发生了基因突变。6个菌株的pyrF基因发生突变,2个菌株的pyrG基因发生突变。 展开更多
关键词 香菇 尿嘧啶营养缺陷型 5’-氟乳清酸
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米曲霉RIB40高效同源重组和尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建 被引量:5
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作者 高育青 张豪杰 +2 位作者 张丹凤 潘裕添 张峰 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2023年第1期200-207,共8页
目的:以米曲霉RIB40为出发菌株,构建具有高同源重组效率的营养缺陷型菌株。方法:首先通过同源重组技术和5-氟乳清酸(5-Fluoroorotic Acid,5-FOA)对尿苷/尿嘧啶营养缺陷的筛选作用,获得AopyrG基因缺失的米曲霉RIB40。然后利用烟曲霉Afpyr... 目的:以米曲霉RIB40为出发菌株,构建具有高同源重组效率的营养缺陷型菌株。方法:首先通过同源重组技术和5-氟乳清酸(5-Fluoroorotic Acid,5-FOA)对尿苷/尿嘧啶营养缺陷的筛选作用,获得AopyrG基因缺失的米曲霉RIB40。然后利用烟曲霉AfpyrG基因替换Aoku70得到ΔAoku70敲除菌株,再通过5-FOA的筛选作用使得ΔAoku70菌株基因组发生自身环化,丢失AfpyrG基因。最后为了检验ΔAoku70ΔAopyrG菌株的可用性,将编码红色荧光蛋白的mCherry基因敲入至双突变菌株的组蛋白H2B基因上,并通过激光共聚焦显微镜观察红色荧光蛋白质的亚细胞定位。结果:通过AopyrG和Aoku70的双基因敲除,获得了高同源重组效率的营养缺陷型菌株ΔAoku70ΔAopyrG。用激光共聚焦观察到红色荧光蛋白定位于细胞核,表明ΔAoku70ΔAopyrG菌株可用于米曲霉的基因改造。结论:ΔAoku70ΔAopyrG菌株可作为一个高同源重组效率的营养缺陷型出发菌株用于今后米曲霉RIB40的遗传改良。 展开更多
关键词 米曲霉 RIB40 尿苷/尿嘧啶营养缺陷型 pyrG KU70 荧光定位
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米曲霉尿嘧啶营养缺陷型突变体筛选及转化体系建立 被引量:2
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作者 秦坤海 刘琪聪 +2 位作者 黄慧 曾斌 胡志宏 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2023年第1期51-56,共6页
米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种十分重要的工业微生物,但由于其菌丝体和孢子均含有多个细胞核,并且对多种抗性药物具有抗性,导致其遗传转化和分子生物学研究较其他模式丝状真菌困难。目前米曲霉遗传转化主要采用营养缺陷型作为筛选... 米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种十分重要的工业微生物,但由于其菌丝体和孢子均含有多个细胞核,并且对多种抗性药物具有抗性,导致其遗传转化和分子生物学研究较其他模式丝状真菌困难。目前米曲霉遗传转化主要采用营养缺陷型作为筛选标记。尿嘧啶营养缺陷型是米曲霉转化中最常用的一种营养缺陷型标记,其筛选标记基因pyrG编码乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶为尿嘧啶的前体尿苷合成所必需。本研究以米曲霉3.042为背景,利用紫外线诱变和5-氟乳清酸(5-FOA)胁迫筛选获得5株尿嘧啶营养缺陷型菌株,经DNA测序5株菌株均为pyrG基因不同位点突变,确定为尿嘧啶营养缺陷型。以筛选到的尿嘧啶营养缺陷型菌株为背景,利用农杆菌介导的米曲霉转化系统,成功构建了米曲霉尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的农杆菌转化体系。 展开更多
关键词 米曲霉3.042 尿嘧啶营养缺陷型 农杆菌转化 紫外线诱变 5-氟乳清酸
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非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫刺激雏鸡脾脏的转录组学分析 被引量:3
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作者 吴绿怡 刘思勤 +1 位作者 廖艳鹏 任超 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期774-783,共10页
【目的】探究非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(NRTUAs)感染雏鸡脾脏的转录组学变化,明确NRTUAs对雏鸡脾脏先天性免疫的调节效果,为研发家禽抗弓形虫疫苗提供理论依据。【方法】分别以NRTUAs和磷酸盐缓冲液(PBS)感染14日龄雏鸡,感染后第... 【目的】探究非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(NRTUAs)感染雏鸡脾脏的转录组学变化,明确NRTUAs对雏鸡脾脏先天性免疫的调节效果,为研发家禽抗弓形虫疫苗提供理论依据。【方法】分别以NRTUAs和磷酸盐缓冲液(PBS)感染14日龄雏鸡,感染后第3 d采集脾脏组织样品进行转录组测序,筛选出NRTUAs组与PBS组间的差异表达基因(DEGs),然后进行GO功能注释、KEGG信号通路富集及蛋白调控网络分析,并通过实时荧光定量PCR验证转录组测序的准确性。【结果】与PBS组相比,从感染NRTUAs的雏鸡脾脏中筛选出499个DEGs(286个为上调DEGs,213个为下调DEGs),且NRTUAs组中上调表达的DEGs多于下调表达的DEGs。GO功能注释分析发现,DEGs注释在生物过程(Biological process,BP)、细胞组分(Cellular component,CC)和分子功能(Molecular function,MF)三大类别的58个功能条目上,主要涉及端粒蛋白定位建立正调控、蛋白稳定、含伴侣蛋白T-复合物、内质网腔、内质网、内质网膜组成部分、纺锤中央区及未折叠蛋白结合等功能条目;KEGG信号通路富集分析显示,DEGs主要富集在内质网蛋白加工通路、RNA转运、细胞周期、钙信号通路、黏着斑、细胞衰老、神经活性配体—受体相互作用、细胞因子—细胞因子受体相互作用通路及氨基酸生物合成等通路中;蛋白互作网络分析结果表明,DEGs编码蛋白PLK1、CCNB1、CDK1、CDC20、CCNA2和NDC1均在细胞周期通路上调表达。实时荧光定量PCR验证结果显示,只有2个DEGs(CXCL12和VPREB3)呈上调表达,其余8个DEGs呈下调表达,与转录组测序结果基本一致。【结论】感染NRTUAs后雏鸡脾脏免疫相关基因表达上调,且多数DEGs富集在内质网蛋白合成与细胞周期等相关信号通路上,脾脏细胞活动明显增强,即通过加快建立细胞连接及启动先天性免疫反应而积极对抗弓形虫入侵。 展开更多
关键词 非复制尿嘧啶营养缺陷型弓形虫 雏鸡 转录组学 脾脏 免疫
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紫外诱变筛选柄篮状菌尿嘧啶缺陷型菌株 被引量:2
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作者 周志义 张佑红 耿安丽 《化学与生物工程》 CAS 2016年第7期48-51,共4页
柄篮状菌EMM是一株从原始菌OPC4诱变获得的高产纤维素酶菌株。为了获得转化用的宿主菌,通过紫外诱变的方法,在1.5g·mL-1 5-FOA的筛选压力下,从EMM诱变得到一株尿嘧啶营养缺陷型菌株EMU6。从原始菌OPC4的基因组里克隆出2 553bp的pyr... 柄篮状菌EMM是一株从原始菌OPC4诱变获得的高产纤维素酶菌株。为了获得转化用的宿主菌,通过紫外诱变的方法,在1.5g·mL-1 5-FOA的筛选压力下,从EMM诱变得到一株尿嘧啶营养缺陷型菌株EMU6。从原始菌OPC4的基因组里克隆出2 553bp的pyrF基因,NCBI比对发现,pyrF为编码乳清酸磷酸核糖基转移酶的基因,影响尿嘧啶的合成。测序比对发现,尿嘧啶营养缺陷型菌株EMU6的pyrF基因在1 160bp处有一个核苷酸缺失。柄篮状菌尿嘧啶营养缺陷型菌株的获得使基于pyrF基因转化体系的建立成为可能。 展开更多
关键词 柄篮状菌 尿嘧啶营养缺陷型 PEG/CaCl2转化法 pyrF 紫外诱变
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里氏木霉QM9414尿嘧啶缺陷型转化体系改进和β-葡萄糖苷酶的过量表达 被引量:1
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作者 钟立霞 钱远超 +1 位作者 戴美学 钟耀华 《化工学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第6期2510-2518,共9页
里氏木霉是广泛应用于纤维素酶生产的工业真菌,但高产突变株遗传操作困难,限制了菌种改良。首先利用定点整合策略敲除里氏木霉突变株QM9414的pyr4基因,成功构建尿嘧啶营养缺陷型菌株QP4,其遗传转化效率显著提高,而且产酶能力不受影响。... 里氏木霉是广泛应用于纤维素酶生产的工业真菌,但高产突变株遗传操作困难,限制了菌种改良。首先利用定点整合策略敲除里氏木霉突变株QM9414的pyr4基因,成功构建尿嘧啶营养缺陷型菌株QP4,其遗传转化效率显著提高,而且产酶能力不受影响。进一步在QP4中过量表达β-葡萄糖苷酶(BGL)基因bgl1,经大量平板显色筛选获得2株BGL活力明显增强的工程菌QPB4和QPB5,其酶活分别提高10.01倍和8.26倍。利用发酵酶液对2种不同预处理的玉米芯底物进行水解糖化实验,结果显示以酸处理玉米芯为底物时QPB4和QPB5的葡萄糖得率比QP4分别提高60.98%和52.44%,而以脱木素处理玉米芯为底物时其葡萄糖得率分别提高80.01%和86.00%。研究表明改进里氏木霉高产突变株遗传转化体系可以显著促进菌株改良,提高糖化应用效果。 展开更多
关键词 纤维素酶 里氏木霉高产突变株 遗传转化 水解糖化 尿嘧啶营养缺陷型标记 构建和表达 生物技术 生物工程
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微生物发酵法生产乳清酸
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作者 张一平 柏建新 +2 位作者 朱晓宏 杜郭君 邓崇亮 《无锡轻工大学学报(食品与生物技术)》 CSCD 北大核心 2003年第3期32-35,40,共5页
以谷氨酸棒杆菌JSIM 201为出发菌株,通过紫外线和甲基磺酸乙酯诱变处理,得到了一株尿嘧啶营养缺陷型突变体U 12菌株,它能以葡萄糖为碳源,硫酸铵为氮源,在发酵液中积累一种紫外吸收物质.该紫外吸收物质经物理、化学分析鉴定,证明是乳清酸... 以谷氨酸棒杆菌JSIM 201为出发菌株,通过紫外线和甲基磺酸乙酯诱变处理,得到了一株尿嘧啶营养缺陷型突变体U 12菌株,它能以葡萄糖为碳源,硫酸铵为氮源,在发酵液中积累一种紫外吸收物质.该紫外吸收物质经物理、化学分析鉴定,证明是乳清酸.对U 12菌株进行了发酵条件优化研究,在最佳发酵工艺条件下,积累乳清酸最高达到8.6g/L. 展开更多
关键词 微生物发酵法生产 乳清酸 谷氨酸棒杆菌 尿嘧啶营养缺陷型突变体U-12菌株 诱变 工艺优化
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