基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1的重组表达与纯化。首先,采用毕赤酵母GS115表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1,其产量可达100 mg/L,进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L,并实现3 L反应器发酵产...基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1的重组表达与纯化。首先,采用毕赤酵母GS115表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1,其产量可达100 mg/L,进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L,并实现3 L反应器发酵产量提高到1 g/L。其次,对上述重组蛋白发酵液分别使用阳离子交换层析及亲和层析进行了纯化工艺优化,目的蛋白得率达到60.7%。本研究为后续PreProDre p 1诊断试剂盆的开发提供了参考。展开更多
过敏原的硝基化会引起其致敏潜能的增强,进而带来更大的致敏性健康风险.过敏原蛋白质通常含有多个酪氨酸硝基化位点,分析过敏原硝基化的位点选择性是探究硝基化对过敏原致敏性影响的重要基础.本文以尘螨过敏原为研究对象,建立了基于超...过敏原的硝基化会引起其致敏潜能的增强,进而带来更大的致敏性健康风险.过敏原蛋白质通常含有多个酪氨酸硝基化位点,分析过敏原硝基化的位点选择性是探究硝基化对过敏原致敏性影响的重要基础.本文以尘螨过敏原为研究对象,建立了基于超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时定量分析3种尘螨过敏原(Der f 1、Der p 1和Der p 2)的13个酪氨酸位点硝基化程度的方法,并应用于分析3种尘螨过敏原在过氧亚硝酸盐硝基化作用下的位点选择性.结果表明,3种尘螨过敏原均发生了位点特异性的硝基化,Y195、Y37和Y92分别为Der f 1、Der p 1和Der p 2中反应活性最高的硝基化位点.尘螨过敏原位点选择性的硝基化表明,在评价硝基化尘螨过敏原的致敏性变化时应当考虑其位点特异性的硝基化状况.展开更多
目的研制粉尘螨Ⅱ组变应原Der f 2单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb),并建立双单抗夹心ELISA检测方法 ,测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f 2的含量。方法应用基因工程方法获得粉尘螨变应原Der f2重组蛋白并通过亲和层析纯化,...目的研制粉尘螨Ⅱ组变应原Der f 2单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb),并建立双单抗夹心ELISA检测方法 ,测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f 2的含量。方法应用基因工程方法获得粉尘螨变应原Der f2重组蛋白并通过亲和层析纯化,再免疫小鼠,利用间接ELISA筛选获得McAb杂交瘤细胞株并纯化、鉴定抗体的特异性;用一株单抗包被酶标板,同时用生物素标记另一株单抗,从而建立双单抗体夹心ELISA法;并用此法测定粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f2的含量。结果成功地获得了一株单抗3B12与屋尘螨抗原具有交叉反应,另外一株单抗3G7与屋尘螨抗原没有交叉反应,并建立了双单抗夹心ELISA方法测定Der f2的含量,其方法的检测限为0.5ng/mL,并在6.25ng/mL-300ng/mL范围内线性良好;标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f2的含量为100ng/10000BAU。结论成功制备了高效价抗Der f 2单抗,并建立了双抗体夹心ELISA检测方法。该方法具有很高的灵敏度,可以测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原Der f 2含量,为临床应用奠定基础。展开更多
文摘基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1的重组表达与纯化。首先,采用毕赤酵母GS115表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1,其产量可达100 mg/L,进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L,并实现3 L反应器发酵产量提高到1 g/L。其次,对上述重组蛋白发酵液分别使用阳离子交换层析及亲和层析进行了纯化工艺优化,目的蛋白得率达到60.7%。本研究为后续PreProDre p 1诊断试剂盆的开发提供了参考。
文摘过敏原的硝基化会引起其致敏潜能的增强,进而带来更大的致敏性健康风险.过敏原蛋白质通常含有多个酪氨酸硝基化位点,分析过敏原硝基化的位点选择性是探究硝基化对过敏原致敏性影响的重要基础.本文以尘螨过敏原为研究对象,建立了基于超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时定量分析3种尘螨过敏原(Der f 1、Der p 1和Der p 2)的13个酪氨酸位点硝基化程度的方法,并应用于分析3种尘螨过敏原在过氧亚硝酸盐硝基化作用下的位点选择性.结果表明,3种尘螨过敏原均发生了位点特异性的硝基化,Y195、Y37和Y92分别为Der f 1、Der p 1和Der p 2中反应活性最高的硝基化位点.尘螨过敏原位点选择性的硝基化表明,在评价硝基化尘螨过敏原的致敏性变化时应当考虑其位点特异性的硝基化状况.
文摘目的研制粉尘螨Ⅱ组变应原Der f 2单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb),并建立双单抗夹心ELISA检测方法 ,测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f 2的含量。方法应用基因工程方法获得粉尘螨变应原Der f2重组蛋白并通过亲和层析纯化,再免疫小鼠,利用间接ELISA筛选获得McAb杂交瘤细胞株并纯化、鉴定抗体的特异性;用一株单抗包被酶标板,同时用生物素标记另一株单抗,从而建立双单抗体夹心ELISA法;并用此法测定粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f2的含量。结果成功地获得了一株单抗3B12与屋尘螨抗原具有交叉反应,另外一株单抗3G7与屋尘螨抗原没有交叉反应,并建立了双单抗夹心ELISA方法测定Der f2的含量,其方法的检测限为0.5ng/mL,并在6.25ng/mL-300ng/mL范围内线性良好;标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f2的含量为100ng/10000BAU。结论成功制备了高效价抗Der f 2单抗,并建立了双抗体夹心ELISA检测方法。该方法具有很高的灵敏度,可以测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原Der f 2含量,为临床应用奠定基础。
