结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：13

1

作者 袁文 王静 +3 位作者 赵维波 张钰 郭鹏举 黄韧 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期49-56,共8页

目的建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法,用于小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的检测。方法根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针,同时设计和制备了内标用于监控假阴性,建立含有内标... 目的建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法,用于小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的检测。方法根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针,同时设计和制备了内标用于监控假阴性,建立含有内标的荧光定量RT-PCR检测体系,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件;构建质粒标准品并以之为模板绘制标准曲线;进行特异性、敏感性和重复性试验,最后用建立的方法检测344份小鼠临床样本,验证在临床应用中的效果。结果该方法特异性强,与小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、出血热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒不发生交叉反应。构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系相关系数r2=0.9986,可以检测到10 copies/μL的质粒标准品,对MNV活病毒检测可检测到1.78×10-2TCID50/m L的病毒,检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍,比病毒分离高100倍。对5份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。通过对344份临床样品检测,检测到阳性样品103份,阳性率29.94%。有5份样本结果为假阴性。结论建立的MNV荧光定量RTPCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查。 展开更多

关键词 小鼠诺如病毒 荧光定量RT-PCR 内标

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小鼠诺如病毒分离鉴定及病毒衣壳蛋白基因序列分析 被引量：4

2

作者 袁文 张谱华 +4 位作者 王静 刘香梅 赵维波 张钰 黄韧 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2013年第6期18-25,I0003,共9页

目的了解广东地区小鼠诺如病毒（murine norovirus,MNV）的分子遗传特征和进化来源。方法采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞对RT-PCR检测为阳性的小鼠样本进行病毒分离,通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光试验、测序方法对病毒分离株进... 目的了解广东地区小鼠诺如病毒（murine norovirus,MNV）的分子遗传特征和进化来源。方法采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞对RT-PCR检测为阳性的小鼠样本进行病毒分离,通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光试验、测序方法对病毒分离株进行鉴定。应用RT-PCR技术针对15株MNV分离株的VP1基因的1626个核苷酸片段进行基因扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌中进行克隆。通过氨苄青霉素平皿筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定及序列分析。将这15株MNV分离株与从GenBank获得的19株MNV参考株进行序列比较分析,基于VP1基因的1626核苷酸片段构建系统发生进化树,一起进行分子流行病学研究。结果从80个小鼠样本中分离到了15株MNV病毒,通过细胞病变试验、RT-PCR试验、间接免疫荧光试验和测序分析鉴定确认分离到的病毒为MNV。序列分析结果显示MNV分离株的VP1蛋白基因全长均为1626个核苷酸,广东地区15株MNV分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别在89.7%~100%和94.8%~100%之间,15株MNV分离株与其他19株MNV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别在87.5%~92.9%和92.4%~98.2%之间。进化树分析表明来自设施A和设施D的13株病毒之间的亲缘关系较近,同属一个进化分支。来自设施B的ZD-1毒株和设施C的ZYY-163毒株与来自广东（K162）、日本（S7-P2、S7-PP3）、韩国（K4）和德国（Berlin/04/06/DE、Berlin/05/06/DE）同属另一个进化分支。结论成功分离到15株MNV病毒。遗传进化分析表明广东地区的MNV分离株来源并不相同,来自设施B和设施C的MNV分离株与国外分离株的亲缘关系较近,而来自设施A和设施D的13株MNV分离株可能是本地固有的毒株。 展开更多

关键词 小鼠诺如病毒 病毒分离鉴定 遗传进化分析

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两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA提取效能的比较 被引量：7

3

作者 田胜男 苏静芬 +1 位作者 向志光 刘云波 《中国比较医学杂志》 CAS 2013年第9期57-60,共4页

目的比较两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA的提取效能。方法用Trizol提取法和QIAamp Viral RNA Mini Kit提取法分别提取感染小鼠诺如病毒(Murine Norovirus,MNV)的小鼠小肠组织样品RNA和细胞培养物RNA,测定RNA浓度;用MNV特异的引物对... 目的比较两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA的提取效能。方法用Trizol提取法和QIAamp Viral RNA Mini Kit提取法分别提取感染小鼠诺如病毒(Murine Norovirus,MNV)的小鼠小肠组织样品RNA和细胞培养物RNA,测定RNA浓度;用MNV特异的引物对分离的核酸样品进行一步法RT-PCR扩增。结果Trizol提取法提取小肠组织的RNA浓度高于QIAamp Viral RNA Mini Kit提取法;QIAamp Viral RNA Mini Kit提取得到的细胞培养物RNA浓度高于Trizol提取法。经QIAamp Viral RNA Mini Kit提取的两种核酸样品均能扩增出特异条带,而Trizol提取的核酸样品未见特异条带。结论在MNV的检测中,QIAamp Viral RNA Kit更适合组织样品中MNV病毒核酸的提取。 展开更多

关键词 TRIZOL QIAamp VIRAL RNA MINI KIT 小鼠诺如病毒

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小鼠诺如病毒间接免疫荧光检测方法的建立 被引量：4

4

作者 田胜男 佟巍 +6 位作者 张丽芳 常慧 李雨函 苏静芬 刘先菊 向志光 刘云波 《中国比较医学杂志》 CAS 2014年第6期58-62,F0004,共6页

目的建立小鼠诺如病毒（MNV）的间接免疫荧光试验（IFA）的检测方法。方法将MNV-1接种RAW264.7细胞,培养36 h收集病毒培养物及未感染细胞培养物,点制抗原玻片;以107TCID50的MNV-1灌胃接种BALB/c小鼠,收集感染血清做阳性对照血清。收集... 目的建立小鼠诺如病毒（MNV）的间接免疫荧光试验（IFA）的检测方法。方法将MNV-1接种RAW264.7细胞,培养36 h收集病毒培养物及未感染细胞培养物,点制抗原玻片;以107TCID50的MNV-1灌胃接种BALB/c小鼠,收集感染血清做阳性对照血清。收集人工感染后不同时间点的血清样品,以1：10的稀释度使用IFA法测定感染血清MNV抗体滴度。选取80份送检小鼠血清样品,以IFA和ELISA方法测定,差异样品使用Western blot方法进行验证。结果 MNV-1感染RAW264.7细胞（36~48）h,细胞感染率为60%,以36 h感染细胞状态为佳;IFA法测定感染小鼠血清,小鼠感染1周后抗体水平逐渐提高,在4周时抗体滴度达到最高值,之后维持稳定,采集感染4周的动物血清做IFA方法的阳性质控品;80份血清中,IFA法测定阳性27份,阴性53份,ELISA法测定阳性32份,阴性48份;Western blot方法对差异样品验证,其中阳性3份,阴性2份,IFA法和ELISA法检测符合率分别为96.0%和97.5%。结论 IFA方法检测小鼠诺如病毒基本可以反应小鼠的感染情况,偶有假阴性的出现,可以选择IFA方法和ELISA方法作为初筛,差异样品用Western blot方法验证。 展开更多

关键词 间接免疫荧光法 小鼠诺如病毒

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小鼠诺如病毒检测方法团体标准的编制

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作者 李晓波 付瑞 +7 位作者 王吉 王淑菁 王莎莎 李威 秦骁 黄宗文 贺争鸣 岳秉飞 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第3期79-83,共5页

随着生命科学的发展,对实验动物质量的要求也越来越高,实验动物标准的不断完善就变得尤为重要,小鼠诺如病毒在实验小鼠中有很高的感染率,小鼠感染后不仅对动物本身造成危害,对实验结果也会产生较大影响。我国的实验动物国家标准目前还... 随着生命科学的发展,对实验动物质量的要求也越来越高,实验动物标准的不断完善就变得尤为重要,小鼠诺如病毒在实验小鼠中有很高的感染率,小鼠感染后不仅对动物本身造成危害,对实验结果也会产生较大影响。我国的实验动物国家标准目前还未将小鼠诺如病毒纳入常规检查项目,我们参考国内外小鼠诺如病毒的最新研究成果及国外相关标准,编制了小鼠诺如病毒的团体标准。本文介绍了小鼠诺如病毒检测方法团体标准编制的背景、法律法规依据,对标准内容的设置进行了解释。本标准的编制完善了实验动物相关标准,为推动实验动物质量的提高,适应实验动物国际化发展的需求提供了技术支持。 展开更多

关键词 实验动物 团体标准 小鼠诺如病毒

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重庆地区小鼠诺如病毒的感染及其对免疫功能影响的初步研究 被引量：2

6

作者 田娜 何丽雯 +3 位作者 曾莉 谭冬梅 韩志刚 谭毅 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1635-1641,共7页

目的:建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,普查重庆市实验小鼠诺如病毒(murine Norovirus,MNV)的感染情况及其对BABL/c-nu小鼠免疫功能影响的初步研究。方法:(1)根据GenBank中收录的MNV全基因组序列,设计MNV特异性引物,检测其特异性、灵敏... 目的:建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,普查重庆市实验小鼠诺如病毒(murine Norovirus,MNV)的感染情况及其对BABL/c-nu小鼠免疫功能影响的初步研究。方法:(1)根据GenBank中收录的MNV全基因组序列,设计MNV特异性引物,检测其特异性、灵敏度、重复性和稳定性,并和两个实验动物质量检测单位对123份小鼠临床样本开展比对检测,以最终构建荧光定量RT-PCR检测方法。(2)应用该方法比较小鼠不同肠道排泄物(盲肠内容物、新鲜粪便和排出体外24 h粪便)中MNV的检出情况。(3)应用该方法普查重庆市实验小鼠感染MNV的情况。(4)6~8周的BABL/c-nu小鼠被随机分为3组(n=3):正常对照组、MNV感染30 d组、MNV感染60 d组,收集各组小鼠血清及肝、肺、脾、结肠,HE染色观察各脏器的病理变化;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清、脾和结肠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)及干扰素-γ(interferon gamma,IFN-γ)的含量。结果:(1)建立的荧光定量RT-PCR方法特异性强,与同种属其他病毒均不发生交叉反应,方法的灵敏度、重复性和稳定性良好,与另外两个实验动物质检单位的检测结果吻合度高达98%。(2)新鲜粪便与盲肠内容物中MNV的检出结果完全一致;24 h的陈旧粪便也能准确反映出该笼小鼠MNV的感染情况。(3)重庆市实验小鼠存在较高的MNV感染率,且封闭群和近交系小鼠MNV感染率无品系特异性(68.3%vs.70.6%,χ^2=0.116,P=0.733),但基因修饰小鼠比普通小鼠更易感染MNV(78%vs.64%,χ^2=6.434,P=0.011)。(4)与正常对照组小鼠相比,BABL/c-nu小鼠自然感染MNV后肝、肺、脾和结肠均出现不同程度的炎症细胞浸润和明显的组织病理变化,且结肠组织的TNF-α、IFN-γ水平明显升高(F=21.682,P=0.002;F=77.223,P=0.000)。结论:本研究建立的实时荧光定量PCR方法可靠,且可通过小鼠粪便样本,日常监测MNV的感染情况等;重庆市实验小鼠有较高的MNV感染率,且BABL/c-nu小鼠感染MNV会对动物实验结果造成干扰。因此,各实验动物单位应该重视MNV的传播和防控,加强实验动物的饲养管理,降低实验动物感染MNV的风险。 展开更多

关键词 小鼠诺如病毒 实时荧光定量RT-PCR BABL/c-nu小鼠 酶联免疫吸附法 肿瘤坏死因子-α 干扰素-Γ

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小鼠诺如病毒巢式PCR检测方法的建立及应用 被引量：1

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作者 赵娜 王丽媛 +5 位作者 赵歆伊 曹福源 陈松 张艳淑 姚林 李爽 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第7期102-104,共3页

为了建立一种高敏感性和特异性的检测方法,突破目前小鼠诺如病毒(MNV)检测局限,根据MNV保守区基因组序列设计合成内、外2对引物,通过PCR反应条件的优化,建立MNV的巢式PCR检测方法。结果表明,该方法仅能特异的扩增MNV目的基因而不能扩增... 为了建立一种高敏感性和特异性的检测方法,突破目前小鼠诺如病毒(MNV)检测局限,根据MNV保守区基因组序列设计合成内、外2对引物,通过PCR反应条件的优化,建立MNV的巢式PCR检测方法。结果表明,该方法仅能特异的扩增MNV目的基因而不能扩增其他病毒,且敏感度达到500个拷贝,比普通PCR提高1000倍。说明本研究建立的巢式PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以准确快速的用于小鼠诺如病毒的病原检测。 展开更多

关键词 小鼠诺如病毒 病毒RNA 巢式PCR 检测 特异性 感染率

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小鼠诺如病毒数字RT-PCR定量检测方法的建立

8

作者 谭建锡 禹思宇 +2 位作者 胡忆文 周智君 唐连飞 《湖南畜牧兽医》 2020年第3期39-42,共4页

为了建立快速、准确定量检测小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的方法,试验针对MNV高度保守区的靶向扩增引物和探针构建MNV的数字RT-PCR定量检测方法,优化其退火温度,并对其敏感性、特异性及临床应用效果进行检测。结果表明:建立的数... 为了建立快速、准确定量检测小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的方法,试验针对MNV高度保守区的靶向扩增引物和探针构建MNV的数字RT-PCR定量检测方法,优化其退火温度,并对其敏感性、特异性及临床应用效果进行检测。结果表明:建立的数字RT-PCR方法能对MNV进行定量检测;最佳退火温度为57.5℃;分别对MNV、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒3型等核酸检测,除MNV外均为阴性;最低可检测到7拷贝/μL;对不同稀释度核酸进行3次重复试验,变异系数均小于7%;对20个小鼠盲肠样本进行MNV检测,结果与荧光RT-PCR结果一致。说明试验建立的数字RT-PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可应用于MNV的临床快速定量检测。 展开更多

关键词 小鼠诺如病毒 数字RT-PCR 定量 检测方法 灵敏度 临床应用

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实验小鼠感染诺如病毒后组织病理变化及病毒含量分析 被引量：2

9

作者 李晓波 付瑞 +7 位作者 王吉 王淑菁 王莎莎 李威 秦骁 黄宗文 贺争鸣 岳秉飞 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2020年第8期42-48,共7页

目的研究常用实验小鼠在人工感染小鼠诺如病毒后组织病理改变及病毒含量变化情况。方法使用KM、BALB/c、NIH、C57BL/6及BALB/c-nu等五个品系小鼠,每个品系分为对照组和感染组,感染组以灌胃方式接种小鼠诺如病毒液,对照组灌同等体积生理... 目的研究常用实验小鼠在人工感染小鼠诺如病毒后组织病理改变及病毒含量变化情况。方法使用KM、BALB/c、NIH、C57BL/6及BALB/c-nu等五个品系小鼠,每个品系分为对照组和感染组,感染组以灌胃方式接种小鼠诺如病毒液,对照组灌同等体积生理盐水,分别在感染后第7、14、21、28、55天采集肝、脾、肺、盲肠、结肠及小肠,每个组织取2份,分别进行病理诊断及病毒核酸含量检测,最后对结果进行汇总分析。结果肝、脾、肺病理改变总发生率分别为8%(10/125)、5.6%(7/125)和4%(5/125),盲肠、结肠及小肠均未发现病变,其中KM及BALB/c小鼠病变主要发生在肝、脾和肺,C57BL/6小鼠主要在肝和肺,NIH及BALB/c-nu小鼠主要在肝和脾。在所观察的实验鼠中KM小鼠较易发生肺的病变;KM及NIH小鼠发生病变较早,C57BL/6小鼠较晚。所有实验鼠盲肠、结肠MNV核酸阳性率均为100%(125/125),小肠、肝、脾、肺及血阳性率分别为71.2%(89/125),17.6%(22/125),39.2%(49/125),3.2%(4/125)和1.6%(2/125);病毒含量比较盲肠>结肠>小肠>脾>肺>肝;BALB/c-nu小鼠结肠病毒含量显著高于其他品系小鼠(P<0.01),其它品系小鼠各组织病毒含量无统计学差异;C57BL/6小鼠在感染MNV第14天盲肠及结肠病毒含量达峰值(P<0.05),其它品系小鼠不同时间点病毒含量无统计学差异;组织器官病理检查及病毒核酸检测结果之间无相关性。结论小鼠诺如病毒感染会引起组织病变,建议进行病理有关的动物实验选择MNV阴性小鼠。 展开更多

关键词 小鼠诺如病毒 病理变化 病毒组织分布

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常用实验小鼠感染诺如病毒后外周血免疫指标分析 被引量：4

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作者 李晓波 付瑞 +8 位作者 王吉 王淑菁 李威 王莎莎 秦骁 黄宗文 贺争鸣 岳秉飞 赵德明 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第7期67-75,共9页

目的通过小鼠感染MNV后外周血免疫指标的改变来评估MNV感染对小鼠免疫功能的影响。方法选取KM,BALB/c,BALB/c-nu,C57BL/6及NIH等五个品系小鼠,每个品系分成MNV感染组和对照组,于感染前(第0天)和感染后的第7、14、21、28天从眼周静脉采... 目的通过小鼠感染MNV后外周血免疫指标的改变来评估MNV感染对小鼠免疫功能的影响。方法选取KM,BALB/c,BALB/c-nu,C57BL/6及NIH等五个品系小鼠,每个品系分成MNV感染组和对照组,于感染前(第0天)和感染后的第7、14、21、28天从眼周静脉采集抗凝血,流式细胞术测定总T细胞、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞、总B细胞、NK细胞及NK-T细胞占总淋巴细胞的百分比及干扰素、白介素、趋化因子等13种细胞因子的含量,比较感染后各指标总体均值的差异,分析各时间点变化情况。结果与对照组相比,KM小鼠感染组总T细胞、CD4^+T细胞含量显著增高(P<0.01),CD4/CD8显著增高(P<0.05),总B细胞及CXCL10含量显著降低(P<0.01);BALB/c小鼠CD8^+T细胞显著降低(P<0.05),IFN-γ含量显著增高(P<0.01);BALB/c-nu小鼠各免疫细胞均无统计学差异,TNF-α、CXCL1及CXCL10显著增高(P<0.01),CCL2显著增高(P<0.05),IFN-β显著降低(P<0.05);C57BL/6小鼠CD4^+(P<0.05)CD8^+T细胞(P<0.01)均显著降低,总B细胞及IL-10显著增高(P<0.05),CCL5及GM-CSF显著降低(P<0.05);NIH小鼠总T细胞和CD8^+T细胞显著增高(P<0.01),CD4/CD8显著降低(P<0.05),总B细胞显著降低(P<0.01),细胞因子均无统计学差异。对于有统计学差异的免疫指标,有半数感染第7天即出现显著差异,大多数第28天仍存在显著差异。结论MNV的感染会影响正常小鼠的细胞免疫和体液免疫应答,而且不同品系的动物影响不同,建议在进行免疫相关的动物实验时选择MNV阴性小鼠,以避免实验结果出现偏差。 展开更多

关键词 小鼠诺如病毒 品系 外周血 免疫功能 小鼠

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蜂胶提取物对诺如病毒的体外抑制作用研究 被引量：5

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作者 唐梦旋 陈莉莉 +3 位作者 廖宁波 陈江 程东庆 吴国平 《食品科学技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期40-47,共8页

为研究蜂胶提取物对人源诺如病毒的体外抑制作用,采用小鼠诺如病毒和噬菌体MS2病毒为替代病毒,研究蜂胶水提物和醇提物随浓度及时间变化对小鼠诺如病毒和噬菌体MS2病毒的抑制作用及其机制。浓度相关性实验表明:随着蜂胶醇提物浓度增加,... 为研究蜂胶提取物对人源诺如病毒的体外抑制作用,采用小鼠诺如病毒和噬菌体MS2病毒为替代病毒,研究蜂胶水提物和醇提物随浓度及时间变化对小鼠诺如病毒和噬菌体MS2病毒的抑制作用及其机制。浓度相关性实验表明:随着蜂胶醇提物浓度增加,小鼠诺如病毒和MS2病毒滴度呈显著下降趋势,当醇提物质量浓度达到500μg/mL时,小鼠诺如病毒和MS2病毒滴度分别下降了6.93 lgPFU/mL和3.75 lgPFU/mL。时间相关性实验表明:将质量浓度为250μg/mL蜂胶醇提物与小鼠诺如病毒和MS2病毒培养60 min,前40 min小鼠诺如病毒和MS2病毒滴度分别下降4.18 lgPFU/mL和3.30 lgPFU/mL,随后下降趋势减缓,在60 min时,小鼠诺如病毒和MS2病毒的总滴度分别下降了4.48 lgPFU/mL和3.67 lgPFU/mL。机制研究表明:蜂胶醇提物可能与宿主细胞(受体)结合,或直接与病毒颗粒结合,使病毒衣壳蛋白变性,阻止病毒进入宿主细胞;透射电镜图像进一步证实了蜂胶醇提物直接作用病毒导致其膨胀破裂。最后,经蜂胶醇提物处理后,人为污染病毒的蔬菜汁和果汁中病毒的滴度显著降低。研究结果将有可能为果蔬在鲜榨过程中,挑选合适的添加剂提供更多的选择。 展开更多

关键词 蜂胶提取物 人源诺如病毒 小鼠诺如病毒 噬菌体 天然添加剂

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