利用CRISPR/Cas9技术构建Quaking敲除的小鼠胚胎成纤维细胞株

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作者 高登科 马白荣 +5 位作者 郭怡莹 刘薇 刘田 靳亚平 江舟 陈华涛 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期65-72,共8页

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,并检测Quaking基因对NIH3T3细胞增殖能力的影响。【方法】首先,利用在线网站设计两条靶向作用于Quaking外显子的sgRNA,成功构建了两个分别靶向Quakin... 【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,并检测Quaking基因对NIH3T3细胞增殖能力的影响。【方法】首先,利用在线网站设计两条靶向作用于Quaking外显子的sgRNA,成功构建了两个分别靶向Quaking基因第1、第2外显子的CRISPR/Cas9重组慢病毒质粒。将构建的Quaking基因CRISPR/Cas9重组慢病毒载体和pcDNA3.1-Quaking过表达质粒共转染至HEK293T细胞中,通过Western blot实验检测Quaking蛋白的敲除效率。其次,将筛选得到的敲除效率高的重组慢病毒质粒(LentiCRISPRv2-sgRNA1)与辅助包装质粒共转染入HEK293T细胞进行慢病毒包装,慢病毒转导NIH3T3细胞后,利用嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞株。最后,通过Western blot及免疫荧光染色鉴定敲除效果。【结果】发现Quaking蛋白在该细胞株中不表达,并测序证实了发生片段敲除。CCK8检测发现,Quaking基因敲除显著抑制了NIH3T3细胞的增殖能力。【结论】本研究首次通过CRISPR/Cas9技术成功构建了小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,为后续研究Quaking基因在小鼠生理功能调节中的作用机制提供了体外模型基础。 展开更多

关键词 Quaking CRISPR/Cas9 小鼠胚胎成纤维细胞 基因敲除

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4种典型纳米材料对小鼠胚胎成纤维细胞毒性的初步研究 被引量：29

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作者 杨辉 杨丹凤 +4 位作者 张华山 张伟 刘焕亮 刘超 袭著革 《生态毒理学报》 CAS CSCD 2007年第4期427-434,共8页

为探讨不同种类纳米材料对原代培养小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryo fibroblasts,MEF)的毒性效应及作用机制,选择4种典型的纳米材料(纳米碳、单壁碳纳米管、纳米氧化锌、纳米二氧化硅)制备颗粒悬液,设立5个剂量组(5、10、20、50、100μ... 为探讨不同种类纳米材料对原代培养小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryo fibroblasts,MEF)的毒性效应及作用机制,选择4种典型的纳米材料(纳米碳、单壁碳纳米管、纳米氧化锌、纳米二氧化硅)制备颗粒悬液,设立5个剂量组(5、10、20、50、100μg·mL-1)对BALB/c小鼠MEF细胞进行24、48、72h染毒培养,利用细胞形态学观察和噻唑蓝实验(MTT比色法)检测上述4种纳米材料对MEF细胞活性的影响,同时,测定染毒24h后细胞培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性以探讨纳米颗粒对细胞膜完整性的影响.结果显示:1)4种纳米材料均能明显影响MEF细胞的生长形态.染毒24h后,MEF细胞发生不同程度的回缩变形,细胞间隙增大,排列稀疏,胞内颗粒物增多,细胞透明度下降.2)纳米碳、纳米氧化锌、纳米二氧化硅对MEF细胞增殖的抑制作用和对细胞膜完整性的损伤作用均随染毒剂量的升高而增强,具有明显的剂量-效应关系,其半数致死浓度(24h-IC50)分别为21.85、21.94、461.10μg·mL-1;碳纳米管组的剂量-效应之间不呈对数线性关系,未能得出其24h-IC50.3)在不同染毒剂量水平上,4种纳米材料的毒性对比差异显著:低剂量水平上纳米碳与碳纳米管的毒性强于纳米氧化锌和纳米二氧化硅,随着剂量的升高纳米氧化锌的细胞毒性升高最为显著.结果提示,纳米材料能够对MEF细胞造成毒性损伤,破坏细胞膜的完整性可能只是作用途径之一;纳米材料的毒性可能受粒径、形状、化学组成等许多因素的影响. 展开更多

关键词 纳米材料 小鼠胚胎成纤维细胞 细胞毒性 纳米碳 单壁碳纳米管 纳米氧化锌 纳米二氧化硅

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^(137)Cs γ-射线诱导小鼠胚胎成纤维细胞衰老模型的建立 被引量：4

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作者 路璐 黄颂 +4 位作者 李德冠 张俊伶 邢永华 李程程 孟爱民 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期87-89,共3页

随着老龄人口的增加，各种老年疾病随之而来，如何延缓衰老已经成为世界各国学者研究的热点。研究衰老机制，建立衰老模型尤为必要。有学者根据衰老的自由基理论，利用一定剂量的1射线照射建立衰老模型[1-5]，但检测的衰老相关指标较少... 随着老龄人口的增加，各种老年疾病随之而来，如何延缓衰老已经成为世界各国学者研究的热点。研究衰老机制，建立衰老模型尤为必要。有学者根据衰老的自由基理论，利用一定剂量的1射线照射建立衰老模型[1-5]，但检测的衰老相关指标较少。为此采用^137Csγ射线照射小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblast，MEF），探讨衰老模型的建立。 展开更多

关键词 Γ射线 小鼠胚胎成纤维细胞 衰老

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小鼠胚胎成纤维细胞分离培养研究 被引量：5

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作者 庄淑珍 吕芳 +1 位作者 潘巍 张富春 《新疆农业科学》 CAS CSCD 2007年第6期729-733,共5页

为探索实验室影响小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分离和培养的因素,取昆明白小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对不同胎龄、不同血清浓度、不同胰蛋白酶浓度和作用时间对MEF分离及培养的影响进行研究,观察MEF的生长形态及其生物学... 为探索实验室影响小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分离和培养的因素,取昆明白小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对不同胎龄、不同血清浓度、不同胰蛋白酶浓度和作用时间对MEF分离及培养的影响进行研究,观察MEF的生长形态及其生物学特性。结果表明,在实验室条件下,12.5-14.5 d胎龄的小鼠胎儿MEF分离效果最好;最佳培养基为DMEM添加15%小牛血清;第3代细胞增殖最旺盛;室温条件下,0.125%胰蛋白酶消化MEF时间以8-10 min为宜。在培养ES细胞时,应选择第3-5代的MEF作为饲养层细胞。研究获得了可在实验室分离制备MEF的方法,为实验室进一步分离培养ES细胞奠定基础。 展开更多

关键词 小鼠胚胎成纤维细胞 分离 培养 生物学特性

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小鼠胚胎成纤维细胞对Lewis肺癌细胞增殖及凋亡的影响 被引量：2

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作者 耿智敏 姬乐 +1 位作者 郑见宝 王林 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期286-289,共4页

目的探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)是否具有肿瘤相关成纤维细胞相似的生物学活性。方法原代培养MEF并经细胞免疫组化法鉴定α-SMA的表达情况;收集培养48h无血清高糖DMEM培养基上清并制备条件培养基MEF-CM,根据实验中Lewis肺癌细胞(LLC)... 目的探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)是否具有肿瘤相关成纤维细胞相似的生物学活性。方法原代培养MEF并经细胞免疫组化法鉴定α-SMA的表达情况;收集培养48h无血清高糖DMEM培养基上清并制备条件培养基MEF-CM,根据实验中Lewis肺癌细胞(LLC)细胞培养基不同,分为MEF条件培养基组、DMEM组,应用MTT法检测不同培养基对LLC增殖率的影响;再根据5-Fu作用与否,进一步应用流式细胞仪检测不同培养基对LLC凋亡的影响。结果成功获得原代培养的MEF,表达α-SMA;MEF-CM较DMEM能够明显促进LLC细胞增殖(P<0.05);MEF-CM较DMEM能够明显抑制LLC细胞凋亡,并能够明显拮抗5-Fu的肿瘤杀伤作用(P<0.05)。结论 MEF是一种活化的成纤维细胞,具有肿瘤相关成纤维细胞相似的生物学活性,有促进LLC增殖及抑制凋亡的作用,可以作为肿瘤相关成纤维细胞用于肿瘤微环境的研究。 展开更多

关键词 小鼠胚胎成纤维细胞 LEWIS肺癌细胞 肿瘤微环境 肿瘤相关成纤维细胞 细胞增殖 细胞凋亡 细胞培养

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罗格列酮与全反式维甲酸诱导小鼠胚胎成纤维细胞定向骨分化研究 被引量：1

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作者 王涵 邵英 +6 位作者 朱茄慧 廖云鹏 马妍 任文艳 周林云 吴柯 何百成 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期1384-1391,共8页

目的探讨罗格列酮(RSG)与全反式维甲酸(ATRA)对干细胞定向骨分化的影响,并初步解析这一作用的可能分子机制。方法通过定量PCR、组织化学染色及Western blot等方法,检测相关成骨与成脂分化标志物的变化情况;利用荧光素酶报告质粒,检测Ru... 目的探讨罗格列酮(RSG)与全反式维甲酸(ATRA)对干细胞定向骨分化的影响,并初步解析这一作用的可能分子机制。方法通过定量PCR、组织化学染色及Western blot等方法,检测相关成骨与成脂分化标志物的变化情况;利用荧光素酶报告质粒,检测Runx2的转录水平以及BMP/Smad信号的激活情况。结果在C2C12、C3H10T1/2和MEFs中,PPARγ以及RAR和RXR各亚型受体均有表达。单独使用RSG或ATRA均能增加MEFs细胞中碱性磷酸酶(ALP)的活性,且RSG能明显增加ATRA所诱导的ALP活性。RSG或ATRA单独应用不能诱导钙盐沉积,两者合用不但增加OPN和OCN的表达,而且还诱导钙盐沉积。RSG可诱导脂滴生成,ATRA不能诱导脂滴生成,且抑制RSG促进脂滴生成的作用。RSG在MEFs中促进C/EBPα表达,但ATRA能抑制RSG的这种作用。ATRA与RSG合用可促进MEFs中Runx2的蛋白表达。同时,ATRA与RSG合用增加了MEFs中BMP/Smad的转录和Smad1/5/8的磷酸化水平,同时也增加了Smad6的mRNA表达,但对Samd7的mRNA表达有抑制作用。结论RSG与ATRA合用能诱导MEFs定向骨分化,该作用可能与ATRA抑制RSG诱导的成脂分化,并增加BMP/Smad信号转导活性有关。 展开更多

关键词 罗格列酮 全反式维甲酸 小鼠胚胎成纤维细胞 成脂分化 成骨分化 BMP/Smad信号

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蛋白磷酸酶2A催化亚基α在小鼠胚胎成纤维细胞迁移中的作用研究 被引量：1

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作者 王庆华 王生存 +4 位作者 李斌 刘春 吴刘成 王旭 邵义祥 《动物医学进展》 北大核心 2016年第6期49-54,共6页

利用体外基因敲除技术检测小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)周期和迁移能力的变化,探究蛋白磷酸酶2A的Cα亚基在MEFs细胞迁移过程中的作用。用Cαfl/fl的纯合子雄鼠与雌鼠1∶2配对,取E12.5d的胚胎制作小鼠胚胎成... 利用体外基因敲除技术检测小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)周期和迁移能力的变化,探究蛋白磷酸酶2A的Cα亚基在MEFs细胞迁移过程中的作用。用Cαfl/fl的纯合子雄鼠与雌鼠1∶2配对,取E12.5d的胚胎制作小鼠胚胎成纤维细胞。利用表达Cre重组酶(Ad-Cre-EGFP)以及GFP荧光蛋白(Ad-EGFP)的腺病毒载体,对P3代MEFs进行感染,分别用PCR,RT-PCR和Western blot方法进行基因型鉴定。同时利用流式分选技术检测感染后MEFs的细胞周期的变化,利用细胞划痕试验检测了其细胞迁移能力的变化。结果显示,胰酶消化的方法成功获得了小鼠胚胎成纤维细胞,DNA,RNA和蛋白水平的鉴定获得了3对3的野生型和基因敲除MEFs。流式分选发现Ad-Cre处理的MEFs与Ad-EGFP处理的MEFs相比,处于G2期的细胞比例为30.8%±2.57%,高于Ad-EGFP MEFs的23.9%±2.46%,并且细胞碎片的比例也远高于后者。划痕试验表明,Cα亚基缺失后细胞迁移能力下降,12h就显著低于对照组。结果表明,腺病毒携带的Cre重组酶能够在体外有效地敲除掉MEFs中的蛋白磷酸酶2A的Cα亚基,PP2ACα亚基的缺失会导致MEFs细胞周期倾向于阻滞在G2期,并会降低细胞迁移的能力。 展开更多

关键词 蛋白磷酸酶2A 小鼠胚胎成纤维细胞 细胞迁移 细胞周期

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HP1α在Zmpste24-缺陷早老小鼠胚胎成纤维细胞中表达和磷酸化水平升高 被引量：1

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作者 刘佳 周光前 +5 位作者 尹献辉 刘宝华 郑慧玲 李雪芹 王优雅 王子梅 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期624-629,共6页

本实验旨在研究异染色质蛋白1(heterochromatin protein 1,HP1)在Zmpste24基因敲除早老小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)中的表达量和磷酸化水平,探索异染色质功能异常与早老发病机制的内在联系.首先取雄雌Zmpste2... 本实验旨在研究异染色质蛋白1(heterochromatin protein 1,HP1)在Zmpste24基因敲除早老小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)中的表达量和磷酸化水平,探索异染色质功能异常与早老发病机制的内在联系.首先取雄雌Zmpste24杂合子小鼠胚胎,原代培养MEFs;分别用PCR和Western印迹检测MEFs基因型和A型核纤层蛋白(laminA)表达以区分野生型与Zmpste24-缺陷型早老细胞;用与衰老相关的β-半乳糖苷酶染色法(senescence associated-β-galactosidase assay,SA-β-gal)确定早老细胞出现衰老表型的传代数.用Western印迹和phos-tagWestern印迹分别检测HP1在Zmpste24+/+和Zmpste24-/-MEFs中表达量和磷酸化水平的差异.实验结果显示,Zmpste24-/-MEFs中存在异常的LaminA,且在传代培养第5代出现明显的细胞衰老现象.选用培养至第3代或第4代的MEFs细胞进行下述实验发现,Zmpste24-/-MEFs中HP1α表达量明显高于Zmpste24+/+MEFs,而HP1β未发现明显升高;Zmpste24+/+MEFs中HP1α以非磷酸化状态为主,但在Zmpste24-/-MEFs中磷酸化HP1α比例明显升高;2种细胞中均未检测到磷酸化HP1β.本研究结果证明,HP1α在Zmpste24-缺陷型早老小鼠传代早期MEFs中的表达量和磷酸化水平均有升高,提示HP1α参与A型核纤层蛋白相关的早老小鼠发病机制. 展开更多

关键词 异染色质蛋白1(HP1) A型核纤层蛋白 早老症 小鼠胚胎成纤维细胞 蛋白质磷酸化

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HCMV体外感染小鼠胚胎成纤维细胞的研究 被引量：1

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作者 吉阳 任鹏 +1 位作者 陈敬贤 王明丽 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2013年第3期215-219,共5页

目的观察人巨细胞病毒(HCMV)AD169株体外感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的生物学特征,为探讨HCMVAD169株能跨种属感染MEF提供依据。方法将100TCID50HCMV AD169株病毒悬液接种至MEF和人胚胎成纤维细胞(HF)上,逐日观察HCMV特征性细胞病变效... 目的观察人巨细胞病毒(HCMV)AD169株体外感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的生物学特征,为探讨HCMVAD169株能跨种属感染MEF提供依据。方法将100TCID50HCMV AD169株病毒悬液接种至MEF和人胚胎成纤维细胞(HF)上,逐日观察HCMV特征性细胞病变效应(CPE);分别收集感染后1、3、5 d的MEF和HF培养物,提取细胞DNA,采用实时荧光定量PCR检测HCMV立即早期基因(IE)拷贝数变化;分别采用HCMV立即早期基因(IE-1)、主要衣壳蛋白(MCP)和包膜糖蛋白(gB)单克隆抗体进行间接免疫荧光实验检测感染后的1、3、5 d MEF和HF中相应病毒蛋白的表达。结果观察到HCMV AD169株接种MEF出现病毒所致CPE,与HF出现的CPE相似;实时荧光定量PCR检测HCMV IE基因拷贝数发现,MEF在HCMVAD169感染后的1、3、5 d,病毒基因拷贝数呈增长趋势,但均低于相同时间点的HF中病毒拷贝数;间接免疫荧光检测HCMV感染MEF和HF后1、3、5 d HCMV IE-1、MCP和gB蛋白表达情况时发现,在MEF上HCMV IE-1、MCP和gB蛋白表达随时间延长呈增强趋势。结论 HCMV AD169株可以体外感染MEF,并在其中复制增殖。 展开更多

关键词 人巨细胞病毒 小鼠胚胎成纤维细胞 跨种属感染

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小鼠骨髓间充质干细胞、骨髓单核细胞和胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞的效率比较

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作者 王尧 王雷 +4 位作者 陆玉华 范向军 朱铭岩 朱沙俊 王志伟 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期1304-1311,共8页

目的比较小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、小鼠骨髓单核细胞(BM-MNCs)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程为诱导性多能干细胞(iPS细胞)的效率。方法用慢病毒LV-ef1a-mOct4-IRES-EGFP、LV-ef1amSox2-IRES-EGFP、LV-ef1a-mKlf4-IRES-EGFP和LV... 目的比较小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、小鼠骨髓单核细胞(BM-MNCs)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程为诱导性多能干细胞(iPS细胞)的效率。方法用慢病毒LV-ef1a-mOct4-IRES-EGFP、LV-ef1amSox2-IRES-EGFP、LV-ef1a-mKlf4-IRES-EGFP和LV-ef1a-mc-Myc-IRES-EGFP感染BMSCs、BMMNCs和MEFs,通过计算碱性磷酸酶染色阳性克隆数比较这3种细胞重编程为iPS细胞的效率。用胚胎干细胞表面标记检测、胚胎干细胞内源基因检测、拟胚体形成实验和畸胎瘤形成实验验证重编程获得的iPS细胞的多能性。结果起源于小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs的3种iPS细胞均能形成边缘光整的致密克隆,可表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织。但是BMSCs来源的碱性磷酸酶阳性克隆数低于BM-MNCs和MEFs来源的克隆数。结论小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs均可重编程为iPS细胞,但BMSCs重编程为iPS细胞的效率低于BM-MNCs和MEFs。 展开更多

关键词 诱导性多潜能干细胞 重编程效率 骨髓间充质干细胞 骨髓单核细胞 小鼠胚胎成纤维细胞

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RNAi对小鼠胚胎成纤维细胞中MC1R基因表达的影响 被引量：7

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作者 尹志红 王恩峰 +1 位作者 白瑞 庞全海 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期218-224,共7页

旨在研究RNAi对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)黑素皮质素受体1(Melanocortin-1receptor,MC1R)基因表达的影响;以MC1R基因作为影响哺乳动物毛色性状的候选基因,通过RNA干扰(RNAi)技术抑制小鼠胚胎成纤维细胞中MC1R基因表达。合成3对针对小鼠ME... 旨在研究RNAi对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)黑素皮质素受体1(Melanocortin-1receptor,MC1R)基因表达的影响;以MC1R基因作为影响哺乳动物毛色性状的候选基因,通过RNA干扰(RNAi)技术抑制小鼠胚胎成纤维细胞中MC1R基因表达。合成3对针对小鼠MEF中MC1R基因的瞬时干扰siRNA,采用反向转染法将siRNA转染入MEF,取转染siRNA 48h后的小鼠胚胎成纤维细胞提取总RNA和总蛋白,并通过QRT-PCR技术和Western bolt检测MC1RmRNA和其蛋白的相对表达量;结果显示,siRNA1组和siRNA2组的MC1R mRNA相对表达量和MC1R蛋白表达量显著低于空白对照组(P<0.05),但siRNA3组表达不显著;本试验利用反向转染方法,成功地对体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞进行siRNA转染。MC1R基因与蛋白的抑制情况相一致,说明siRNA1和siRNA2对MC1R的抑制效果确实有效,并筛选出有显著干扰效果的siRNA,为进一步研究MC1R在毛色发育过程中的调控机理提供科学依据。 展开更多

关键词 小干扰RNA 黑素皮质素受体1基因 小鼠胚胎成纤维细胞 抑制率

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灰毡毛忍冬乙醇提取物减缓D–半乳糖致小鼠胚胎成纤维细胞氧化应激的效果 被引量：2

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作者 韩少凡 程满 +5 位作者 王懿文 陈彦超 朱登峰 彭国平 饶力群 汪启明 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期43-51,78,共10页

为探讨灰毡毛忍冬乙醇提取物对D–半乳糖诱导小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)氧化应激的保护作用及其潜在机制,通过广泛靶标代谢组测序和高效液相色谱法检测灰毡毛忍冬乙醇提取物中活性物质,采用20 mg/mL的D–半乳糖处理MEF细胞,建立细胞衰老模... 为探讨灰毡毛忍冬乙醇提取物对D–半乳糖诱导小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)氧化应激的保护作用及其潜在机制,通过广泛靶标代谢组测序和高效液相色谱法检测灰毡毛忍冬乙醇提取物中活性物质,采用20 mg/mL的D–半乳糖处理MEF细胞,建立细胞衰老模型,试验设置对照组(0 mg/mL的D–半乳糖)、模型组(20 mg/mL的D–半乳糖)、灰毡毛忍冬乙醇提取物组(100、500、1000μg/mL的灰毡毛忍冬乙醇提取物添加20 mg/mL的D–半乳糖)、阳性对照组(50μg/mL的三七总皂苷添加20 mg/mL的D–半乳糖),按照试验分组,将细胞在37℃、5%的CO_(2)培养箱中培养48 h,检测细胞抑制率、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量、线粒体膜电位(MMP)和线粒体活性氧(mtROS)水平,以及p53、p16、线粒体复合体基因、Bcl–2、Caspase–3的表达水平。结果表明:灰毡毛忍冬乙醇提取物中含有酚酸、黄酮、有机酸、萜类等大量活性物质;与对照组相比,模型组细胞抑制率显著增加,细胞数量显著减少,MMP下降,mtROS水平增加,SOD含量降低,MDA含量增加,线粒体复合体蛋白NDUFV1和抑凋亡蛋白Bcl–2明显下降,Caspase–3明显上升;与模型组相比较,灰毡毛忍冬乙醇提取物组和阳性对照组有效降低了细胞抑制率,显著提高了细胞数量和SOD活性,降低了MDA含量,提高MMP水平,降低mtROS含量,有效降低p53、p16、Caspase–3的蛋白水平,升高Bcl–2、NDUFV1的蛋白水平。说明在MEF细胞中,灰毡毛忍冬乙醇提取物可通过增加线粒体复合体I蛋白富集和减缓细胞凋亡来减弱D–半乳糖所诱导的氧化应激效应。 展开更多

关键词 灰毡毛忍冬 乙醇提取物 D–半乳糖 小鼠胚胎成纤维细胞 线粒体 氧化应激

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Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为神经干细胞 被引量：2

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作者 刘畅 戎利民 刘斌 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期87-92,共6页

目的：探讨Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞（ mouse embryonic fibroblasts ， MEFs）直接重编程为神经干细胞的方法，为诱导神经干细胞（induced neural stem cells ， iNSCs）作为种子细胞治疗脊髓损伤（spinal cord injury， SCI）奠定... 目的：探讨Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞（ mouse embryonic fibroblasts ， MEFs）直接重编程为神经干细胞的方法，为诱导神经干细胞（induced neural stem cells ， iNSCs）作为种子细胞治疗脊髓损伤（spinal cord injury， SCI）奠定实验基础。方法：逆转录病毒感染Sox2转录因子的MEFs在神经干细胞培养基中贴壁培养10 d。随后，悬浮、贴壁反复循环培养3次。 Real-time PCR检测神经干细胞标志基因和多潜能标志基因的表达。 iNSCs在分化培养基中贴壁培养7～14 d，免疫荧光分别检测神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物nes-tin、MAP2、GFAP和MBP的表达。将iNSCs显微注射至小鼠大脑皮质，7～14 d后免疫荧光检测神经细胞标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。结果：Real-time PCR显示iNSCs的多种神经干细胞标志基因nestin、Blbp、Pax6和zbtb16表达较诱导前显著增高（P＜0.05），且iNSCs不表达多潜能相关基因Nanog、Oct4和zfp42。免疫荧光显示iNSCs高表达神经干细胞标志物nestin。免疫荧光同时表明iNSCs可在体内外存活并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论：Sox2可以诱导MEFs直接重编程为神经干细胞。 iNSCs具有自我更新的能力，且在体内外都具有三向分化潜能，可作为修复SCI合适的种子细胞。 展开更多

关键词 SOX2 小鼠胚胎成纤维细胞 直接重编程 神经干细胞

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FSHβ在骨形态蛋白9诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化中的作用研究 被引量：3

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作者 苏晓娅 黄敏 刘宏 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期327-333,共7页

目的:探讨卵泡刺激素β亚基(follicle-stimulating hormoneβ,FSHβ)对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化中的作用。方法:采用Ad Easy系统构建表... 目的:探讨卵泡刺激素β亚基(follicle-stimulating hormoneβ,FSHβ)对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化中的作用。方法:采用Ad Easy系统构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、FSHβ和BMP9的重组腺病毒(Ad-GFP、Ad-FSHβ和Ad-BMP9),实验分组为:AdGFP组、Ad-BMP9组、Ad-FSHβ组和Ad-BMP9+Ad-FSHβ组。运用化学发光定量和组织化学染色法分别检测各组3、5、7 d碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性;Western blot检测成骨分化早期转录因子(Runx2和DLX5)的蛋白表达水平;RT-PCR检测成骨分化晚期指标骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的m RNA表达水平;茜素红染色检测钙盐沉积;流式细胞技术检测各实验组细胞的周期分布。结果:在MEFs中,过表达FSHβ能明显促进BMP9诱导MEFs骨化过程中第3天(6 874.67±224.93 vs.11 935.67±568.76,P=0.000)、第5天(43 434.67±2 047.57 vs.98 913.33±4 606.26,P=0.000)、第7天(38 198.00±2 376.43 vs.78 534.67±2 114.56,P=0.000)的ALP活性,转录因子Runx2(1.171±0.105 vs.1.350±0.053,P=0.026)、DLX5(1.382±0.123 vs.1.738±0.286,P=0.001)和晚期成骨指标OCN(1.300±0.045 vs.1.471±0.046,P=0.002)、OPN(1.300±0.084 vs.1.479±0.038,P=0.016)的表达水平,以及钙盐沉积。此外,FSHβ和(或)BMP9对MEFs细胞周期没有明显影响(G1期:F=0.226,P=0.876;G2期:F=0.147,P=0.929;S期:F=0.027,P=0.994)。结论:在不影响MEFs细胞周期的情况下,FSHβ协同BMP9诱导MEFs成骨分化。 展开更多

关键词 骨形态发生蛋白9 卵泡刺激素β亚基 小鼠胚胎成纤维细胞 成骨分化

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敲除ABRO1对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)LPS/TLR4通路活化的影响

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作者 李东旭 张文 +3 位作者 葛志强 詹轶群 尹荣华(指导) 杨晓明(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期257-261,共5页

目的:探讨敲除ABRO1对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)LPS/TLR4通路活化的影响。方法:分离培养ABRO1敲除(KO)及野生型(WT)MEF细胞;采用CBA流式细胞术检测LPS诱导后ABRO1 KO与WT MEF细胞分泌IL-6的水平;采用Western blot法确认其NF-κB信号通路... 目的:探讨敲除ABRO1对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)LPS/TLR4通路活化的影响。方法:分离培养ABRO1敲除(KO)及野生型(WT)MEF细胞;采用CBA流式细胞术检测LPS诱导后ABRO1 KO与WT MEF细胞分泌IL-6的水平;采用Western blot法确认其NF-κB信号通路以及MAPK信号通路的活化;采用qPCR检测IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达;采用荧光素酶报告基因检测NF-κB的转录活性。结果:CBA流式结果显示,10 ng/ml、100 ng/ml和1μg/ml 3种不同剂量的LPS诱导ABRO1 KO与WT MEF细胞分泌IL-6的水平差异无统计学意义。qPCR检测显示,1μg/ml LPS诱导ABRO1 KO与WT MEF细胞IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平差异无统计学意义。Western blot结果显示,1μg/ml LPS诱导ABRO1 KO与WT MEF细胞的NF-κB信号通路以及MAPK信号通路活化差异无统计学意义。荧光素酶报告基因检测结果显示,1μg/ml LPS诱导ABRO1 KO与WT MEF细胞NF-κB报告基因活性差异无统计学意义。结论:敲除ABRO1不影响MEF细胞LPS/TLR4信号通路活化。 展开更多

关键词 ABRO1基因 小鼠胚胎成纤维细胞 白细胞介素6 脂多糖类

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miR-223促进小鼠胚胎成纤维细胞复制性衰老

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作者 徐舜 张兵 +4 位作者 杨文平 黄海姣 谢罗逸君 黄君愉 刘新光 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期1234-1241,共8页

微小RNA(miRNAs)作为强大的基因表达调控子,广泛参与多种生命过程,在细胞衰老进程中的作用也日益受到关注。miR-223是一个典型的抑癌基因,可显著抑制细胞增殖能力。miR-223与阿尔茨海默症、心血管疾病以及类风湿性关节炎等衰老相关疾病... 微小RNA(miRNAs)作为强大的基因表达调控子,广泛参与多种生命过程,在细胞衰老进程中的作用也日益受到关注。miR-223是一个典型的抑癌基因,可显著抑制细胞增殖能力。miR-223与阿尔茨海默症、心血管疾病以及类风湿性关节炎等衰老相关疾病的发生发展密切相关。尽管如此,miR-223在细胞衰老进程中的作用及其分子机制尚未见报道。本研究通过连续传代建立了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)的复制性衰老模型,并利用荧光定量qRT-PCR检测发现,miR-223在衰老MEF细胞中的表达水平显著上调。随后,通过转染miR-223模拟物Agomir-223在MEF细胞中过表达miR-223。结果显示,过表达miR-223可显著促进MEF细胞的衰老表型并抑制其增殖能力,而抑制miR-223的表达可延缓MEF细胞的复制性衰老进程。进一步利用生物信息学方法预测,获得多个miR-223的候选衰老相关靶基因,包括Rasa1、Ddit4和Smad1等。然而,双萤光素酶报告系统结果显示,miR-223并不显著影响其萤光强度,表明它们很可能并不是miR-223的下游靶基因。综上所述,miR-223可显著促进MEF细胞复制性衰老,然而其调节细胞衰老进程的分子机制依然有待深入研究。 展开更多

关键词 微小R-223 小鼠胚胎成纤维细胞 复制性衰老

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小鼠黑色素瘤细胞外泌体促进成纤维细胞表达Rac1蛋白 被引量：2

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作者 把小云 王祎婷 +2 位作者 常秀林 段乳侠 方廖琼 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期606-611,共6页

目的:探讨小鼠黑色素瘤细胞外泌体对成纤维细胞表达Ras相关C3肉毒毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)蛋白的影响。方法:超高速离心法分离小鼠黑色素瘤B16-F10细胞外泌体,电镜负染色观察外泌体的形态,纳米颗粒... 目的:探讨小鼠黑色素瘤细胞外泌体对成纤维细胞表达Ras相关C3肉毒毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)蛋白的影响。方法:超高速离心法分离小鼠黑色素瘤B16-F10细胞外泌体,电镜负染色观察外泌体的形态,纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)测定外泌体的粒径分布,Western blot鉴定外泌体标志蛋白肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,Tsg101)和酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-related protein 2,Tyrp2)的表达;激光共聚焦显微镜观察在共培养过程中小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)摄取外泌体的过程;免疫细胞化学染色和Western blot实验分析MEF表达Rac1蛋白的情况。结果:B16-F10细胞外泌体在电镜下呈典型茶托状形态,NTA测得其粒径范围在141~255 nm,Western blot测出其标志蛋白Tsg101和Tyrp2。激光共聚焦显微镜观察结果显示,与共培养0 h相比,共培养12 h的MEF内有少量的外泌体,且共培养24和36 h的MEF内聚集了大量的外泌体。Western blot结果表明,与共培养0 h相比,共培养24和36 h的MEF中Rac1蛋白表达水平显著增加(P<0. 01)。免疫细胞化学染色结果表明,与共培养0 h相比,共培养12、24和36 h的MEF中Rac1蛋白阳性表达水平显著增加(P<0. 05或P<0. 01)。结论:小鼠黑色素瘤细胞外泌体可促进成纤维细胞表达Rac1蛋白。 展开更多

关键词 黑色素瘤 外泌体 Ras相关C3肉毒毒素底物1 小鼠胚胎成纤维细胞

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TNF-α激活NF-κB信号通路抑制培养成纤维细胞SDF-1α分泌 被引量：4

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作者 张玉龙 毋巨龙 +2 位作者 杨忠 丁可 李世荣 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第15期1509-1513,共5页

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)激活核因子-κB(NF-κB)信号通路对成纤维细胞生物学行为的影响。方法小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行体外培养,将细胞分为TNF-α组、TNF-α+吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)组及对照组,处理后的细胞采用CCK-8方... 目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)激活核因子-κB(NF-κB)信号通路对成纤维细胞生物学行为的影响。方法小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行体外培养,将细胞分为TNF-α组、TNF-α+吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)组及对照组,处理后的细胞采用CCK-8方法检测细胞增殖情况、Western blot和细胞免疫荧光检测IκBα蛋白表达与定位、ELISA检测基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)的分泌。结果 TNF-α在一定浓度范围内对成纤维细胞起到明显的促增殖作用,CCK-8检测显示TNF-α组在不同浓度和不同时相点MEF的光密度值与TNF-α+PDTC组及对照组相比差异显著(P<0.05);免疫荧光染色显示IκBα主要分布于细胞质,TNF-α组与对照组和TNF-α+PDTC组相比,IκBα荧光强度明显减弱。Western blot结果发现TNF-α刺激后30 min,TNF-α组和TNF-α+PDTC组IκBα蛋白表达[(3 070.0±39.0)vs(1 421.7±75.3),(3 212.2±57.5)vs(1 468.2±45.8),P<0.05]均降至最低值,随时间推移逐渐恢复,TNF-α+PDTC组IκBα蛋白表达显著高于TNF-α组[(3 112.3±89.7)vs(2 610.4±26.9),P<0.05];ELISA检测发现TNF-α作用后成纤维细胞SDF-1α的分泌呈减少趋势[(15.9±1.6)vs(12.7±0.6),P<0.05],TNF-α+PDTC组则能显著逆转TNF-α作用[(23.5±3.2)vs(15.0±1.2),(21.6±0.4)vs(12.7±0.6),P<0.05],促进SDF-1α分泌。结论 TNF-α能通过激活NF-κB通路,影响小鼠胚胎成纤维细胞的增殖并抑制SDF-1α分泌。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子-α 核因子-ΚB 小鼠胚胎成纤维细胞 吡咯烷二硫氨基甲酸

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MicroRNA-450a-3p通过抑制Bub1基因的表达调控小鼠细胞增殖和胚胎发育

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作者 刘晨 杨丹丹 +5 位作者 蒋凤兵 白慧丽 李宝林 罗敏 湛晓琴 施琼 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期1651-1657,共7页

目的:探讨microRNA-450a-3p(miR-450a-3p)对小鼠细胞增殖和胚胎发育的调控是否通过抑制Bub1基因的表达实现。方法:用萤光素酶报告基因实验检测miR-450a-3p能否特异性结合于Bub1基因的3’-非翻译区(untranslated region,UTR);用Western b... 目的:探讨microRNA-450a-3p(miR-450a-3p)对小鼠细胞增殖和胚胎发育的调控是否通过抑制Bub1基因的表达实现。方法:用萤光素酶报告基因实验检测miR-450a-3p能否特异性结合于Bub1基因的3’-非翻译区(untranslated region,UTR);用Western blotting和实时荧光定量RT-PCR检测miR-450a-3p对Bub1蛋白和mRNA表达;分别通过MTT、Hoechst染色、流式细胞术等分析miR-450a-3p对小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)增殖、凋亡和细胞周期等生物学功能的调控;利用染色体核型分析技术检测miR-450a-3p对MEFs染色体数目的影响。结果:miR-450a-3p能与靶基因Bub1的3’-UTR结合,在翻译水平抑制MEFs中Bub1的表达,然而其转录水平的表达却不受影响。miR-450a-3p通过下调靶基因Bub1的表达,抑制MEFs的增殖,促进细胞的凋亡;而且miR-450a-3p还能使大多数细胞停滞在G1/G0期,使细胞分裂受阻,导致细胞染色体数目异常。结论:miR-450a-3p能够调控靶基因Bub1的表达,抑制MEFs增殖,并最终影响小鼠胚胎的发育。 展开更多

关键词 MicroRNA-450a-3p 小鼠胚胎成纤维细胞 基因 Bub1 胚胎

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PTEN在骨形态发生蛋白9诱导小鼠胚胎成纤细胞骨向分化中的作用 被引量：1

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作者 伍秋香 任春美 +8 位作者 陈振华 陈前昭 袁霜雪 王东旭 曾于桦 李洋 邵英 黄军 何百成 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期264-269,共6页

目的研究PTEN对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化的影响,并分析PTEN调节BMP9功能的可能机制。方法采用定量PCR检测PTEN在间充质干细胞(mesenchyma... 目的研究PTEN对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化的影响,并分析PTEN调节BMP9功能的可能机制。方法采用定量PCR检测PTEN在间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达,分析在MEFs中BMP9对PTEN表达的影响。采用组织化学染色法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,PCR检测OPN和OCN的表达水平,茜素红染色检测钙盐沉积,分析PTEN对BMP9诱导MEFs成骨分化的影响;利用荧光素酶报告质粒和蛋白印迹等方法分析PTEN对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)/Smads信号转导的影响。结果 PTEN在几种常见MSCs中均有表达;BMP9在MEFs中明显抑制PTEN的表达。抑制PTEN能促进BMP9诱导MEFs的ALP活性增加,但过表达PTEN对BMP9诱导MEFs的ALP活性有明显抑制作用。抑制PTEN明显促进BMP9在MEFs细胞中诱导的OCN表达,并增强钙盐沉积。报告质粒分析结果显示,抑制PTEN能明显增强BMPR-Smad报告质粒的转录活性,并增加Smad1/5/8的磷酸化水平。结论下调PTEN表达可能是BMP9诱导MEFs成骨分化重要途径之一,其机制可能与促进BMPs/Smads信号转导有关。 展开更多

关键词 骨形态发生蛋白9 PTEN 小鼠胚胎成纤维细胞 成骨分化 BMPs/Smads

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