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重组小鼠干细胞逆转录病毒载体高效基因转染CD41^+、UT7、U937和MDA-MB-435细胞 被引量：4
1
作者 石小玉 李文林 +3 位作者 梁朝 张际青 赵林 李红 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期212-218,共7页
目的 :研究重组小鼠干细胞逆转录病毒载体介导基因转染 ,探索一条高效基因转染的途径 ,为重组小鼠干细胞逆转录病毒载体在基因转染中的应用提供理论依据和奠定实验基础。方法 :①逆转录病毒载体的构建 :EC1- 4 (repeats 1- 4ofcadherin ... 目的 :研究重组小鼠干细胞逆转录病毒载体介导基因转染 ,探索一条高效基因转染的途径 ,为重组小鼠干细胞逆转录病毒载体在基因转染中的应用提供理论依据和奠定实验基础。方法 :①逆转录病毒载体的构建 :EC1- 4 (repeats 1- 4ofcadherin - 5extracellulardomains)基因克隆产物和mutant(Ser2 2 2A)MEK 1基因克隆产物 ,Bg1Ⅱ和EcoRⅠ限制性内切核酸酶切割后 ,克隆进入逆转录病毒表达载体pMSCV。②CD4 1+ 细胞的获取和细胞培养 :从脐带血分离的CD34+ 细胞通过TPO诱导表达CD4 1,FACS分离CD4 1+ 细胞。高糖DMEM培养液培养NIH 3T3和MDA -MB - 4 35细胞 ,U937细胞培养在RPMI- 16 4 0培养液 ,UT7细胞是细胞因子依赖性细胞株 ,Iscove’smodifiedDulbeco’s培养液中加入GM -CSF。③测定病毒滴度 :逆转录病毒载体转入包装细胞 2 93,36h后收集病毒上清液 ,感染NIH3T3细胞 ,流式细胞仪测定病毒滴度。④Westernblot:基因转染CD4 1+ 、UT7、U937和MDA -MB - 4 35细胞 ,Westernblot检测基因产物的表达。结果 :2 93细胞产生高滴度MEK1pMSCV病毒 :3 1× 10 7,高滴度EC1- 4pMSCV病毒 :1 0×10 8。用稀释 8倍的病毒转染基因 ,重组逆转录病毒MEK1pMSCV转染白血病细胞株UT7和U973,GFP阳性细胞 (转染阳性细胞 )分别是 6 0 73%、 展开更多
关键词 基因转染 小鼠干细胞逆转录病毒 CD41^+细胞 UT7细胞 U937细胞 MDA-MB-435细胞
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细胞因子对逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓造血干细胞基因转移效率的影响 被引量：6
2
作者 王存邦 达万明 +2 位作者 冀孟菊 白海 魏亚明 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 1998年第3期182-186,共5页
本实验探讨细胞因子SCF,IL-3和IL-6对基因转移效率的影响,为临床基因治疗提供可靠依据。以小鼠造血干细胞为靶细胞,应用包装细胞株PA317-GCGPXSN制备病毒上清,实施基因转移,采用FACS,GM-CFU,PCR和Southern blot方法测定基因转移效率。... 本实验探讨细胞因子SCF,IL-3和IL-6对基因转移效率的影响,为临床基因治疗提供可靠依据。以小鼠造血干细胞为靶细胞,应用包装细胞株PA317-GCGPXSN制备病毒上清,实施基因转移,采用FACS,GM-CFU,PCR和Southern blot方法测定基因转移效率。实验结果为:SCF,IL-3,IL-6单用或联合应用后,FACS测定的基因转移效率为0.07％-0.20％,GM-CFU测定的结果为20.4％-46.40％,阳性对照组测定的结果则分别为0.06％和10.92％。结论提示SCF/IL-3,SCF/IL-3/IL-6联合应用能显著提高基因转移效率。 展开更多
关键词 细胞因子 逆转录病毒载体 造血干细胞 基因转移
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高滴度逆转录病毒载体4种转染方法对小鼠脾脏T细胞转染率的比较 被引量：8
3
作者 刘希民 达万明 +1 位作者 张苗 靳海杰 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2001年第4期268-268,共1页
关键词 小鼠 脾脏 T细胞 基因转染率 高滴度逆转录病毒载体 衣霉素
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PDGF-A基因逆转录病毒载体的构建及其在猪骨髓间充质干细胞中表达的研究 被引量：5
4
作者 闫国和 杨余亮 +6 位作者 侯爱莲 王锋超 许庆娥 熊玮 程天民 王军平 粟永萍 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第21期2024-2028,共5页
目的克隆血小板衍生生长因子A链(platelet-derived growth factor A chain,PDGF-A)基因,以逆转录病毒载体pLXSN为骨架携带PDGF-A基因转染猪骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs),为应用PDGF-A基因修饰bM... 目的克隆血小板衍生生长因子A链(platelet-derived growth factor A chain,PDGF-A)基因,以逆转录病毒载体pLXSN为骨架携带PDGF-A基因转染猪骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs),为应用PDGF-A基因修饰bMSCs进行创面修复奠定基础。方法采用RT-PCR二步分离法,以人肝癌细胞总RNA为模板,扩增PDGF-A基因的全长cDNA编码序列,构建PDGF-A基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并将其导入病毒包装细胞PA317中,经G418筛选并扩增,以病毒液感染NIH3T3细胞,选出抗性克隆,测其病毒滴度,将高滴度病毒液感染bMSCs。采用RT-PCR、Southern blot和ELISA法,分别检测PDGF-A基因转染bMSCs的效率及PDGF-A在bMSCs中的表达水平;光镜、MTT法、成骨与成脂诱导分别检测bMSCs转染PDGF-A基因后的生长状态、增殖情况及干细胞特性。结果经测序验证,克隆到PDGF-A基因的全长cDNA序列与GenBank所报告的该基因序列完全一致。成功构建了PDGF-A链基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并实现了PDGF-A基因在bMSCs的稳定表达。bMSCs转染PDGF-A后的生长状态、增殖情况良好,且仍具干细胞特性。结论成功地将PDGF-A基因克隆到pLXSN载体中,并实现了PDGF-A基因在bMSCs中的稳定表达。bMSCs转染PDGF-A后仍具干细胞特性。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 血小板衍生生长因子A链基因 骨髓间充质干细胞 稳定表达
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逆转录病毒载体转染的人凝血因子Ⅸ基因在人脐带组织源间充质干细胞中的表达 被引量：3
5
作者 陈晓梨 董春兰 +8 位作者 冯小明 陈振萍 周泽平 许显辉 赵钦军 邱志勇 任倩 张蕾 韩忠朝 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2009年第1期184-187,共4页
为了研究逆转录病毒(pLEGFP-N1)转染的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在人脐带间充质干细胞中的表达,应用DNA重组技术将hFⅨcDNA构建入pLEGFP-N1载体,转导入包装细胞系Pheonix细胞,应用病毒上清感染人脐带组织源间充质干细胞(hUCT-MSCs),经G41... 为了研究逆转录病毒(pLEGFP-N1)转染的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在人脐带间充质干细胞中的表达,应用DNA重组技术将hFⅨcDNA构建入pLEGFP-N1载体,转导入包装细胞系Pheonix细胞,应用病毒上清感染人脐带组织源间充质干细胞(hUCT-MSCs),经G418筛选10天后获得全部的转染阳性细胞,从蛋白质水平和其功能活性上检测hFⅨ的表达。结果显示:配养上清液中可检测到hFⅨ的表达,每24小时分泌量达2.68±0.36μg/106细胞。Western blot检测表明,转导hFⅨ的hUCT-MSCs能分泌预期分子大小的hFⅨ入上清。功能性凝集测定实验表明了转导FⅨ的hUCT-MSCs2天培养上清中hFⅨ的活性为100%-130%。结论:pLEGFP-N1-hFⅨ能有效地转导hUCT-MSCs,并在其子代细胞中表达具有凝血活性的hFⅨ,这为hUCT-MSCs成为血友病B基因治疗的细胞载体研究奠定了基础。 展开更多
关键词 逆转录病毒 人凝血因子Ⅸ 人脐带组织源间充质干细胞 基因治疗 血友病B
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逆转录病毒介导的RNAi抑制小鼠生精细胞Zfy基因表达的研究 被引量：2
6
作者 马军德 贾斌 +4 位作者 马世俊 申红 张挺军 付维明 蔡国宝 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2013年第2期176-181,共6页
为了构建逆转录病毒RNAi(RNA interference)载体靶向抑制小鼠生精细胞Zfy基因的表达,检测Zfy基因的沉默效果。将构建好的逆转录病毒RNAi载体转染经分离培养的小鼠生精细胞,筛选出稳定转染的单克隆细胞扩大培养,应用qRT-PCR检测各试验组... 为了构建逆转录病毒RNAi(RNA interference)载体靶向抑制小鼠生精细胞Zfy基因的表达,检测Zfy基因的沉默效果。将构建好的逆转录病毒RNAi载体转染经分离培养的小鼠生精细胞,筛选出稳定转染的单克隆细胞扩大培养,应用qRT-PCR检测各试验组细胞Zfy基因mRNA的表达情况。结果显示,转染逆转录病毒RNAi载体的生精细胞Zfy基因mRNA的表达水平显著降低,与阴性对照和空白对照相比差异极显著(P<0.01);阴性对照与空白对照之间差异不显著(P>0.05)。因此,逆转录病毒RNAi载体可以稳定、高效抑制Zfy基因的表达,为进一步探究Zfy基因在小鼠生精过程中的作用和功能奠定了基础。 展开更多
关键词 RNAI Zfy基因 逆转录病毒载体 小鼠生精细胞
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逆转录病毒介导hBMP_7基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达 被引量：2
7
作者 金丹 曾位森 +4 位作者 裴国献 胡罢生 魏宽海 王珂 陈滨 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期477-479,T001,共4页
采用粘 粘端连接方法构建hBMP7逆转录病毒载体 ,重组质粒转染包装细胞PT6 7后 ,制备含目的基因的重组逆转录病毒液感染兔骨髓间充质干细胞。限制性内切酶酶切分析筛选插入方向正确的重组质粒并进行基因测序。结果显示 ,hBMP7逆转录病毒... 采用粘 粘端连接方法构建hBMP7逆转录病毒载体 ,重组质粒转染包装细胞PT6 7后 ,制备含目的基因的重组逆转录病毒液感染兔骨髓间充质干细胞。限制性内切酶酶切分析筛选插入方向正确的重组质粒并进行基因测序。结果显示 ,hBMP7逆转录病毒载体中外源基因插入方向正确、无碱基错误和缺失。原位杂交和免疫组织化学检测表明 ,感染后 2天经基因转染的BMSc原位杂交和免疫组化检测结果呈阳性 ,未经转染的细胞检测结果呈阴性。转染的BMSc经G4 18筛选至 4周仍有外源BMP蛋白的表达。提示采用逆转录病毒介导方法转染的BMSc中可有外源性BMP7mRNA和蛋白的表达。 展开更多
关键词 逆转录病毒 hBMP7基因转染 兔 骨髓间充质干细胞 骨形态发生蛋白质类 生物医学工程 基因表达
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逆转录病毒介导的小鼠IL-23基因在小鼠结肠癌细胞中的表达及其抗肿瘤活性 被引量：1
8
作者 郝京生 单保恩 +2 位作者 李巧霞 李启亮 付小梅 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期226-228,232,共4页
　目的: 获得表达小鼠IL -23 (mIL- 23 )基因的小鼠结肠癌细胞株。方法: 应用逆转录病毒载体, 将mIL -23基因导入小鼠结肠癌细胞株Colon26, 经G418筛选后获得表达mIL 23的阳性细胞克隆(Colon26 /IL- 23)。用PCR和RT -PCR检测目的基因的... 　目的: 获得表达小鼠IL -23 (mIL- 23 )基因的小鼠结肠癌细胞株。方法: 应用逆转录病毒载体, 将mIL -23基因导入小鼠结肠癌细胞株Colon26, 经G418筛选后获得表达mIL 23的阳性细胞克隆(Colon26 /IL- 23)。用PCR和RT -PCR检测目的基因的表达, 用ELISA法检测mIL -23的产生及mIL- 23诱导的小鼠脾细胞IFN -γ的产生, 用MTT比色法检测Co lon26 /IL -23细胞和Colon26细胞的体外增殖。将Colon26 /IL- 23细胞接种于BALB/c小鼠的右侧背部皮下, 观察其致瘤性。结果: 建立了可表达mIL -23基因的小鼠结肠癌细胞株。分泌至培养上清中的IL -23, 可诱导小鼠脾细胞产生IFN- γ。在体外Colon26 /IL- 23细胞的生长与Colon26细胞无明显不同, 但其在体内的致瘤性下降, 具有抗瘤作用。结论: Colon26 /IL- 23细胞可分泌IL -23并证明其具有抗瘤活性。 展开更多
关键词 IL-23 逆转录病毒载体 基因表达 小鼠结肠癌细胞
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表达红色荧光蛋白DsRed报告基因的逆转录病毒载体的构建和在肝干细胞体内示踪中的应用 被引量：1
9
作者 李文林 苏娟 +2 位作者 陶欣荣 Joseph T Lau 胡以平 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期240-242,共3页
目的:建立表达红色荧光蛋白DsRed的逆转录病毒载体,并对肝原始细胞进行体外标记和体内示踪研究。方法:将pDsRed1 1载体中的DsRed片段克隆到逆转录病毒载体pLNCG C1中构建了pLNCG DsRed载体。将该载体导入Phoenix包装细胞,进而采用乒乓... 目的:建立表达红色荧光蛋白DsRed的逆转录病毒载体,并对肝原始细胞进行体外标记和体内示踪研究。方法:将pDsRed1 1载体中的DsRed片段克隆到逆转录病毒载体pLNCG C1中构建了pLNCG DsRed载体。将该载体导入Phoenix包装细胞,进而采用乒乓转染的方法感染包装细胞PT67,获得高滴度稳定产毒的PT67 细胞系。结果:利用PT67 细胞系产生的病毒上清可以高效的感染体外培养的肝原始细胞系。将这些DsRed标记的肝原始细胞移植到小鼠损伤肝脏中,4周后可以在再生肝脏中清晰地观察到具有红色荧光的外源细胞。结论:由于肝脏组织没有红色自发荧光,用DsRed标记肝原始细胞进行肝内示踪时背景干扰小。 展开更多
关键词 红色荧光蛋白 基因.报告 逆转录病毒载体 肝干细胞
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逆转录病毒载体介导Fn-TPO基因修饰人骨髓间充质干细胞 被引量：1
10
作者 于洁 张磊 +3 位作者 莫姝 杨光 李欣 宪莹 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第24期2396-2399,共4页
目的应用逆转录病毒载体介导纤维连接蛋白-血小板生成素(Fn-TPO)基因修饰人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),观察Fn-TPO基因修饰对于骨髓MSCs的影响。方法构建携带Fn-TPO基因的重组逆转录病毒载体,并以其对骨髓MSCs进行体... 目的应用逆转录病毒载体介导纤维连接蛋白-血小板生成素(Fn-TPO)基因修饰人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),观察Fn-TPO基因修饰对于骨髓MSCs的影响。方法构建携带Fn-TPO基因的重组逆转录病毒载体,并以其对骨髓MSCs进行体外基因修饰;台盼蓝拒染法计数活细胞数检测基因修饰后骨髓MSCs的体外增殖能力,RT-PCR检测Fn-TPO基因在骨髓MSCs中的表达情况,MTT法检测基因修饰后骨髓MSCs黏附造血细胞的能力,ELISA检测基因修饰后骨髓MSCs分泌至细胞培养液中的TPO浓度。结果成功构建携Fn-TPO基因的重组逆转录病毒载体且以该逆转录病毒载体对骨髓MSCs进行体外基因修饰;Fn-TPO基因在骨髓MSCs内能够正常转录;基因修饰后的骨髓MSCs体外增殖能力无明显改变(P>0.05);黏附造血细胞能力增强(P=0.01),分泌TPO的能力增强且不随培养时间延长而显著减弱(P<0.01),但受细胞生长状态影响。结论成功应用携带Fn-TPO基因的逆转录病毒载体对人骨髓MSCs进行基因修饰,使基因修饰后骨髓MSCs黏附造血细胞分泌TPO能力增强。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 纤维连接蛋白 血小板生成素 逆转录病毒载体 基因修饰
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小鼠骨生成诱导因子基因逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达 被引量：2
11
作者 郑翠侠 张晓娜 +2 位作者 韩兵 宋怀东 马勤耘 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期1501-1504,共4页
目的构建小鼠骨生成诱导因子(OIF)基因重组逆转录病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。方法 PCR法扩增OIF-3FLAG基因,测序后克隆入逆转录病毒载体pMSCV PIG(Puro-IRES-GFP)的相应位点,构建重组逆转录病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,... 目的构建小鼠骨生成诱导因子(OIF)基因重组逆转录病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。方法 PCR法扩增OIF-3FLAG基因,测序后克隆入逆转录病毒载体pMSCV PIG(Puro-IRES-GFP)的相应位点,构建重组逆转录病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,并对重组体进行测序鉴定。应用脂质体分别将PMSCV PIG-OIF-3FLAG和VSVG、GAG-POL辅助病毒包装载体共转染至293T包装细胞,48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达;收集包装细胞上清液,进一步用含有包装病毒的上清液再感染293T细胞,48 h后加入3μg/mL嘌呤霉素(puromycin),连续7d,筛选病毒感染的稳定表达pMSCVPIG-OIF-3FLAG的293T细胞株,分别采用Real-time PCR技术和Western blotting方法检测293T细胞OIF mRNA及其蛋白表达。结果构建OIF基因逆转录病毒表达载体PMSCV PIG-OIF-3FLAG,经酶切及测序鉴定证实目的基因插入位点和读码框架正确;病毒感染293T细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达小鼠OIF的293T细胞株;Real-time PCR和Western blotting鉴定证实OIF mRNA和蛋白在该细胞株中呈高表达。结论成功构建小鼠OIF基因的逆转录病毒载体,并获得稳定高表达OIF基因的293T细胞株。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 小鼠骨生成诱导因子 293T细胞
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胰十二指肠同源盒基因-1逆转录病毒表达载体的构建及其在肝干细胞中的稳定表达
12
作者 金彩霞 李文林 +3 位作者 朱吉 田棣 张南 胡以平 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期834-836,共3页
目的:通过克隆胰十二指肠同源盒基因-1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1),构建表达PDX-1的逆转录病毒表达载体和稳定表达PDX-1的肝原始细胞系(liver epithelial progenitor cells,LEPCs),以研究肝干细胞向胰腺细胞的转分化潜能。... 目的:通过克隆胰十二指肠同源盒基因-1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1),构建表达PDX-1的逆转录病毒表达载体和稳定表达PDX-1的肝原始细胞系(liver epithelial progenitor cells,LEPCs),以研究肝干细胞向胰腺细胞的转分化潜能。方法:通过PCR方法克隆PDX-1基因全长,将其构建到pMSCVpuro逆转录病毒载体中获得pMSCV PDX-1 puro载体。将该载体导入Phoenix包装细胞系,进而采用乒乓转染的方法感染包装细胞PT67,获得高滴度稳定产毒的PT67细胞系。结果:成功构建了pMSCV PDX-1 puro载体,并转染PT67细胞。利用PT67细胞系产生的病毒上清可以高效的感染体外培养的肝干细胞LEPCs,获得稳定表达PDX-1基因的LEPCs(LEPCs PDX-1)。结论:PDX-1逆转录病毒表达载体的成功构建和稳定表达PDX-1的肝干细胞系的获得为研究LEPCs向胰腺细胞的转分化奠定了基础。 展开更多
关键词 胰十二指肠同源盒基因-1 逆转录病毒科 肝 干细胞
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逆转录病毒—从实验小鼠外周血浆细胞中检出
13
作者 杨怡 陈德蕙 +1 位作者 董梅 庄汉澜 《电子显微学报》 CAS CSCD 2006年第6期528-530,共3页
应用超薄切片透射电镜技术在实验Balb/C小鼠外周血浆细胞中意外地检出逆转录病毒。病毒粒子有包膜,呈球形,直径约100 nm,包膜表面有纤突,病毒核衣壳在粗面内质网内膜上芽生成熟。该病毒被疑为小鼠体内的潜在性感染,应该引起实验动物生... 应用超薄切片透射电镜技术在实验Balb/C小鼠外周血浆细胞中意外地检出逆转录病毒。病毒粒子有包膜,呈球形,直径约100 nm,包膜表面有纤突,病毒核衣壳在粗面内质网内膜上芽生成熟。该病毒被疑为小鼠体内的潜在性感染,应该引起实验动物生产部门的关注。 展开更多
关键词 BALB/C小鼠 逆转录病毒 电镜
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hTERT-逆转录病毒载体构建及其介导的脐血间质干细胞基因转移研究
14
作者 李克 刘瑞敏 +1 位作者 韩雪飞 邢莹 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期361-364,共4页
目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(MSCs)中导入hTERT基因,观察该基因对细胞端粒酶活性的影响,能否延长细胞的寿命以及转基因细胞的分化能力。方法:PCR法扩增出hTERT全部片段,定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装... 目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(MSCs)中导入hTERT基因,观察该基因对细胞端粒酶活性的影响,能否延长细胞的寿命以及转基因细胞的分化能力。方法:PCR法扩增出hTERT全部片段,定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装细胞内,筛选阳性产毒细胞,测定病毒滴度。取病毒上清感染脐血MSCs,筛选转基因细胞。检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达,端粒酶活性的变化,hTERT转入后对细胞增殖的影响。用5-氮杂胞苷将转基因细胞向心肌方向诱导,检测心肌特异抗体的表达。结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒,证明PLNCX2-hTERT构建成功,转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达,细胞端粒酶阳性。生长曲线显示转基因细胞增殖速度快于未转染细胞。向心肌细胞诱导后,心肌特异性抗体α-sarcom ericactin和connexin-43均有表达。结论:在逆转录病毒介导下,外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达,激活细胞端粒酶的活性,有效延长了细胞的寿命,不影响其分化功能。 展开更多
关键词 间质干细胞 脐血 人端粒酶逆转录酶 逆转录病毒载体
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胰岛素样生长因子-1逆转录病毒表达载体的构建及其在大鼠胚胎神经干细胞中的表达
15
作者 王进 王红星 崔景彬 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2007年第6期1136-1140,共5页
目的:构建胰岛素样生长因子-1(IGF-1)逆转录病毒表达载体,并观察转IGF-1基因的鼠胚胎神经干细胞(NSC)体内外基因表达情况。方法:通过酶切和连接的方法将IGF-1基因克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN中,感染包装细胞后收集病毒颗粒再感染从胎... 目的:构建胰岛素样生长因子-1(IGF-1)逆转录病毒表达载体,并观察转IGF-1基因的鼠胚胎神经干细胞(NSC)体内外基因表达情况。方法:通过酶切和连接的方法将IGF-1基因克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN中,感染包装细胞后收集病毒颗粒再感染从胎龄14d的SD大鼠全脑组织中分离出的NSC,RT-PCR检测IGF-1的mRNA,免疫组织化学法检测IGF-1蛋白的表达,并用立体定向法将Brdu标记的转基因NSC移植到大鼠大脑中动脉梗死模型的纹状体缺血半暗区,免疫染色观察移植后1周转基因NSC在脑内的基因表达情况。结果:酶切及序列分析证实重组逆转录病毒载体pLX SN-IGF-1构建正确,RT-PCR能检测到转基因IGF-1的mRNA,免疫组织化学法能检测到IGF-1在转染了逆转录病毒的NSC及其子代细胞内表达,转基因NSC移植后1周在宿主脑内迁徙并表达IGF-1基因产物。结论:成功构建了携带IGF-1基因的逆转录病毒载体,转染了重组逆转录病毒载体的NSC可在体内外表达IGF-1。 展开更多
关键词 神经干细胞 胰岛素样生长因子-1 逆转录病毒 转染 转基因 大鼠
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小鼠肝炎病毒逆转录环介导等温扩增检测技术的建立 被引量：7
16
作者 袁文 刘忠华 +2 位作者 张钰 刘香梅 黄韧 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2009年第5期354-359,I0007,I0008,共8页
目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。方法针对MHV核衣壳蛋白基因序列设计6条特异性引物,以MHV基因... 目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。方法针对MHV核衣壳蛋白基因序列设计6条特异性引物,以MHV基因组RNA为模板,进行RT-LAMP反应。扩增产物通过浊度、SYBR green I荧光染料显色及电泳三种方法观察结果。同时,用限制性内切酶AluI对扩增产物进行酶切鉴定。进行RT-LAMP特异性和敏感性试验。最后用建立的RT-LAMP方法检测55份小鼠临床样本。结果RT-LAMP技术简单快速,等温条件下(65℃)一个小时内即可完成反应。酶切结果证明RT-LAMP产物正确。该技术具有很高的特异性和敏感性,可检测到的MHV RNA最低浓度为0.1 pg/μL,比逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)灵敏10倍。临床样本检测结果显示,与RT-PCR比较RT-LAMP方法的敏感性和特异性分别为100%和83.3%。结论RT-LAMP技术是一种快速、简便诊断方法,该方法检测特异性强、敏感性高,可以成为快速准确检测MHV的有效手段。 展开更多
关键词 小鼠肝炎病毒 逆转录环介导等温扩增 逆转录聚合酶链式反应
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人NF-κB亚基p65、p50基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的建立和鉴定 被引量：2
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作者 桂伶俐 刘志恒 +2 位作者 张传汉 祝畅 高峰 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期97-100,108,共5页
目的构建分别携带人核因子-κB(NF-κB)亚基p65、p50基因的逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株。方法以RcCMV-p65、RcCMV-p50质粒为模板,PCR扩增p65、p50基因编码区全长序列,分别克隆至逆转录病毒空载体pMSCVneo、pMSCVhyg,酶... 目的构建分别携带人核因子-κB(NF-κB)亚基p65、p50基因的逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株。方法以RcCMV-p65、RcCMV-p50质粒为模板,PCR扩增p65、p50基因编码区全长序列,分别克隆至逆转录病毒空载体pMSCVneo、pMSCVhyg,酶切、测序鉴定。将重组载体及空载体分别转染包装细胞系PT67,以G418或潮霉素筛选产毒细胞株。收集病毒悬液,测定病毒滴度,并瞬时感染NIH3T3细胞及人神经干细胞,72h后分别采用RT-PCR和免疫细胞化学观察p65、p50的表达。结果重组逆转录病毒载体pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50的酶切、测序鉴定正确。将筛选所得的高效产毒细胞株分别命名为PT67/pMSCVneo-p65、PT67/pMSCVneo、PT67/pMSCVhyg-p50及PT67/pMSCVhyg,测定病毒滴度分别为4×10^(5)、6×10^(5)、2×10^(5)及1×10^(5)cfu/ml。pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50病毒悬液瞬时感染NIH3T3细胞72h后,细胞p65、p50亚基mRNA的表达明显升高;瞬时感染人神经干细胞(hNSC)72h后,部分细胞胞核呈p65和p50阳性染色。结论成功构建了分别携带人p65、p50基因的逆转录病毒载体,建立了稳定、高效、正确生产逆转录病毒的细胞株。为探讨转NF-κB基因神经干细胞在缺血性卒中的运用前景奠定了实验基础。 展开更多
关键词 干细胞移植 脑缺血 核因子ΚB 逆转录病毒科
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逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子基因转染的肿瘤细胞克隆株的建立及其生物学活性的观察 被引量：2
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作者 修方明 曹雪涛 +2 位作者 周正芳 郑玲莉 叶天星 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1995年第1期39-43,共5页
以逆转录病毒为载体将小鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)基因转染人小鼠黑色素瘤细胞(B16)中,经G418抗性筛选,有限稀释及培养上清中TNF活性测定,从多株阳性克隆中筛选到一株高分泌TNF的克隆株(B16-TNF_a^(+)).B16-TNF_a^(+)细胞的形态,体外增殖... 以逆转录病毒为载体将小鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)基因转染人小鼠黑色素瘤细胞(B16)中,经G418抗性筛选,有限稀释及培养上清中TNF活性测定,从多株阳性克隆中筛选到一株高分泌TNF的克隆株(B16-TNF_a^(+)).B16-TNF_a^(+)细胞的形态,体外增殖能力及集落形成能力与野生型B16细胞无显著差异.体内致瘤性实验表明,B16-TNF_a^(+)细胞致瘤性下降,但致瘤性高低与接种细胞数量有关.小鼠皮下接种1.25×10~4或更多细胞,肿瘤结节形成率与接种细胞数量成负相关;而接种6.25×10~3细胞的小鼠肿瘤结节形成率反而高于2.5×10~4细胞接种的小鼠.接种B16-TNF_a^(+)的荷瘤小鼠长期存活率显著高于对照组.本实验为进行肿瘤细胞靶向的TNF基因治疗奠定了实验基础. 展开更多
关键词 TNF 克隆株 基因转染 小鼠肿瘤 肿瘤细胞 肿瘤坏死因子 逆转录病毒介导 阳性克隆 细胞数量 抗性筛选
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小鼠微小RNA294逆转录病毒载体的构建及鉴定 被引量：1
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作者 许杰 闫秋月 +1 位作者 湛彦强 张苏明 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2011年第1期19-22,共4页
目的:构建小鼠微小RNA294(miR-294)逆转录病毒载体。方法:从小鼠基因组DNA扩增pri-miR-294,克隆连接至pMX-IRES-GFP逆转录病毒载体上,得pMX-miR-294-IRES-GFP,测序鉴定后以转染PLAT-E细胞进行病毒包装,测定病毒滴度。结果:pMX-miR-294-I... 目的:构建小鼠微小RNA294(miR-294)逆转录病毒载体。方法:从小鼠基因组DNA扩增pri-miR-294,克隆连接至pMX-IRES-GFP逆转录病毒载体上,得pMX-miR-294-IRES-GFP,测序鉴定后以转染PLAT-E细胞进行病毒包装,测定病毒滴度。结果:pMX-miR-294-IRES-GFP经PCR扩增及测序鉴定正确,并得到了滴度为(1～5)×106TU/mL的病毒液。结论:成功构建了pMX-miR-294-IRES-GFP逆转录病毒载体。 展开更多
关键词 微小RNA 细胞重编程 逆转录病毒载体 小鼠
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提高逆转录病毒介导造血干细胞基因转染效率的研究策略
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作者 于晓妉 周生 毛宁 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 1999年第1期4-8,共5页
造血干细胞因其具有自我更新和多向分化能力而成为基因治疗的理想靶细胞,但由于逆转录病毒介导的造血干细胞基因转染效率低,外源基因表达时间短等,大大影响了造血干细胞基因治疗的临床应用。为克服上述难点,目前的研究策略主要集中在构... 造血干细胞因其具有自我更新和多向分化能力而成为基因治疗的理想靶细胞,但由于逆转录病毒介导的造血干细胞基因转染效率低,外源基因表达时间短等,大大影响了造血干细胞基因治疗的临床应用。为克服上述难点,目前的研究策略主要集中在构建新型理想的逆转录病毒载体及从不同的方面优化转染体系,从而提高基因转染效率。 展开更多
关键词 逆转录病毒 造血干细胞 基因转染
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