小鼠髓样细胞触发受体-2基因小发卡状RNA慢病毒载体构建 被引量：2

1

作者 冉江霞 石胜良 王成志 《山东医药》 CAS 2018年第43期39-42,共4页

目的构建小鼠髓样细胞触发受体-2(TREM2)基因小发卡状RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,并检测其功能。方法针对小鼠TREM2基因设计合成3对sh RNA序列,将其分别与线性化GV248载体连接,转化至感受态大肠埃希菌DH5α,构建TREM2基因sh RNA重组慢... 目的构建小鼠髓样细胞触发受体-2(TREM2)基因小发卡状RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,并检测其功能。方法针对小鼠TREM2基因设计合成3对sh RNA序列,将其分别与线性化GV248载体连接,转化至感受态大肠埃希菌DH5α,构建TREM2基因sh RNA重组慢病毒载体(TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3)。用重组载体转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光(GFP)后,进行滴度测定。取对数生长期BV2小胶质细胞,分为TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组及空白对照组。TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组分别感染TREM2-sh RNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3、sh RNA空质粒,空白组不做任何处理。感染120 h取各组细胞,Q-PCR法检测各组TREM2 m RNA,计算细胞沉默效率。结果 TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3转染293T后镜下均观察到GFP,包装浓缩的慢病毒滴度分别为(4×108)、(4×108)、(5×108) TU/m L。与空白对照组和阴性对照组比较,TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组TRME2 m RNA相对表达量均降低(P均<0. 05);与TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-3感染组比较,TREM2-shRNA-2感染组TRME2 m RNA相对表达量降低(P均<0. 05)。TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组的沉默效率分别为49. 4%±3. 98%、79. 7%±2. 01、65. 3%±2. 41%和39. 2%±6. 98%,TREM2-shRNA2组沉默效率最高。结论成功构建TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3。TREM2-sh RNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3均可沉默小鼠BV2小胶质细胞中TREM2基因表达,以TREM2-shRNA-2沉默效果最好。 展开更多

关键词 小发卡状rna慢病毒载体 髓样细胞触发受体-2 迟发性阿尔茨海默病 阿尔茨海默病

在线阅读 下载PDF 职称材料

靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默 被引量：1

2

作者 李菁华 刘震雄 +4 位作者 赵曙光 张哲 闻勤生 王景杰 张明鑫 《山西医科大学学报》 CAS 2014年第12期1119-1123,1231,共6页

目的设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体p GL... 目的设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体p GLV3-GFP中,构建p GLV3-GFP-Nrf2-shRNA-1/2/3/4,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染72 h和96 h后大鼠肝星状细胞株HSC-T6 Nrf2基因的表达情况。结果测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109TU/ml,p GLV3-GFP-Nrf2-shRNA转染后72 h和96 h可抑制Nrf2基因mRNA及蛋白的表达。结论成功构建Nrf2基因的shRNA慢病毒载体,可有效抑制大鼠肝星状细胞株HSC-T6中Nrf2基因的表达。 展开更多

关键词 NRF2 短发夹状rna 慢病毒载体 HSC-T6

在线阅读 下载PDF 职称材料

人Notch4基因RNAi慢病毒载体的构建及鉴定 被引量：10

3

作者 陈伟 曹罡 +3 位作者 董震 苏寒 蒋勇 张森林 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2013年第2期116-121,共6页

目的涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是涎腺常见的恶性肿瘤,Notch4基因与SACC的发生、转移有关。文中构建人Notch4基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体并鉴定。方法针对人Notch4基因序列,按照RNAi序... 目的涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是涎腺常见的恶性肿瘤,Notch4基因与SACC的发生、转移有关。文中构建人Notch4基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体并鉴定。方法针对人Notch4基因序列,按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列,通过限制性内切酶MIu l和CIa l双酶切、T4 DNA连接酶连接,将Notch4插入慢病毒载体pLenOR-THM,构建pLenOR-THM-Notch4重组载体。质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒4质粒系统共转染293 T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度、观察感染效率。各组病毒载体转染ACC-M细胞后,用QRT-PCR和Western blot检测Notch4基因mRNA和蛋白的表达水平。结果成功构建慢病毒表达载体pLenOR-THM-Notch4,4质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光。浓缩病毒后测定其滴度为6.2×108TU/ml。以复感染系数MOI(multiplicity of infection)为1感染293T细胞,感染效率在90%以上。结合QRT-PCR和Western blot检测结果,第2组慢病毒载体干扰效果最佳。结论成功构建并鉴定人Notch4 RNAi慢病毒表达载体。 展开更多

关键词 NOTCH4 慢病毒载体 rna干扰

在线阅读 下载PDF 职称材料

STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定 被引量：3

4

作者 赵虹 张惊宇 +2 位作者 徐万海 杨子超 赵庆杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期623-627,共5页

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定。方法:针对筛选确定的人STUB1基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA... 目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定。方法:针对筛选确定的人STUB1基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA慢病毒载体。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒。结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒。结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体。 展开更多

关键词 基因 rna干扰 慢病毒载体 构建与鉴定 rna interference LENTIVIRAL vector 慢病毒颗粒 慢病毒表达载体 构建人 包装 rnai 胶质瘤发生 寡核苷酸链 shrna DNA测序 载体连接 阳性克隆 信号通路 筛选确定 合成

在线阅读 下载PDF 职称材料

Beclin-1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对B16F10细胞自噬及活力的影响 被引量：3

5

作者 贾艳艳 赵莹莹 +6 位作者 余祖华 何雷 廖成水 李静 郁川 张春杰 李银聚 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期2609-2616,共8页

利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系,分析稳转细胞系的自噬水平和活力,为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体,转染至293T细胞,获得慢病毒颗粒,将病毒颗粒感... 利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系,分析稳转细胞系的自噬水平和活力,为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体,转染至293T细胞,获得慢病毒颗粒,将病毒颗粒感染B16F10细胞,通过加压筛选、有限稀释、细胞驯化得到稳定转染m-Beclin-1-shRNA1的B16F10细胞系。采用RT-PCR和免疫荧光技术检测对Beclin-l的干扰效果,Western blot和透射电镜分析稳转细胞系中自噬标志物LC3蛋白表达及自噬小体形成情况,CCK-8法检测稳转细胞系的活力。结果表明,成功构建了靶向抑制Beclin-l基因表达的shRNA,纯化的慢病毒滴度为1×10^(8) TU·mL^(-1),建立的细胞系中Beclin-1 mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制,mRNA的沉默效率约为75%(P<0.01),发现干预Beclin-1表达能够抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达及自噬小体的形成数量,降低B16F10细胞活力。以上结果表明,干扰Beclin-1表达能够有效降低B16F10细胞自噬活性,促进B16F10细胞死亡,这为探讨Beclin-1基因功能及自噬在抗肿瘤中的作用奠定重要基础。 展开更多

关键词 rna干扰 B16F10细胞 Beclin-1基因 慢病毒载体 细胞自噬

在线阅读 下载PDF 职称材料

大鼠PER2基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率的测定 被引量：2

6

作者 王翔凌 孙宁玲 +4 位作者 马丽萍 郭晓夏 姜娟 王鲁雁 何湘君 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期16-21,共6页

目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体,并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列,插入慢病毒载体质粒pGLV-U6-EGFP中,构建pLentivirus-per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌... 目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体,并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列,插入慢病毒载体质粒pGLV-U6-EGFP中,构建pLentivirus-per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内,利用Real-time PCR方法检测PER2基因的mRNA表达水平,筛选有效沉默钟基因PER2表达的RNAi慢病毒载体。结果经电泳、基因测序证实插入的目的序列正确,有PER2表达,成功构建了pLentivirus-per2-rat表达重组体;转染慢病毒载体pLentivirus-per2-rat至A7r5大鼠胸血管平滑肌细胞,测定转染效率达70%;Real-time PCR检测PER2基因的mRNA相对表达量,筛选出有效干扰大鼠血管平滑肌细胞钟基因Per2表达的siRNA片段,使PER2mRNA表达量下调约84%。结论成功构建了大鼠PER2的RNAi慢病毒载体,为进一步研究时钟基因的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 PER2基因 rna干扰 慢病毒载体 血管平滑肌细胞 时钟基因

在线阅读 下载PDF 职称材料

山羊myostatin基因慢病毒RNA干扰载体的构建及效果验证 被引量：1

7

作者 陆健 张世芳 +6 位作者 张小宁 刘佳森 李碧春 赵福平 张莉 魏彩虹 杜立新 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第9期1-6,共6页

myostatin基因是肌肉生长和发育的关键负调控因子之一,该基因突变或失活的物种都呈现肌肉增大的双肌表型,暗示在家畜中使该基因失活可以增加其产肉量。为了进一步揭示myostatin在山羊胎儿成纤维细胞中的生物学功能以及制备可有效失活myo... myostatin基因是肌肉生长和发育的关键负调控因子之一,该基因突变或失活的物种都呈现肌肉增大的双肌表型,暗示在家畜中使该基因失活可以增加其产肉量。为了进一步揭示myostatin在山羊胎儿成纤维细胞中的生物学功能以及制备可有效失活myostatin基因的工具,将筛选的myostatin基因潜在RNA干扰靶位点连接到慢病毒干扰载体的转移质粒中,构建慢病毒介导的RNA干扰载体,验证其干扰效果。结果表明,干扰序列与转移质粒连接正确,成功构建myostatin基因慢病毒干扰载体,慢病毒三质粒共转293T细胞,获得的慢病毒颗粒可高效转染山羊胎儿成纤维细胞,Real-time PCR检测发现慢病毒干扰载体Lv322有效减少山羊胎儿成纤维细胞中myostatin基因mRNA 75%的表达(P<0.01),Western blotting检测显示myostatin蛋白则有效降低了94%(P<0.01)。本试验为研究myostatin基因的功能及制备失活转基因动物提供有效工具以及理论基础。 展开更多

关键词 MYOSTATIN基因 山羊胎儿成纤维细胞 慢病毒载体 rna干扰

在线阅读 下载PDF 职称材料

人MEF2C基因shRNA慢病毒载体构建及其对Daoy细胞MEF2C mRNA表达的影响

8

作者 付鹏 刘爱华 +3 位作者 王静波 杨宪勇 谭业克 刘兴田 《山东医药》 CAS 2012年第47期18-20,共3页

目的构建人肌细胞增强因子2C(MEF2C)基因短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,观察其对髓母细胞瘤Daoy细胞MEF2C mRNA表达的影响。方法设计MEF2C基因特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pGLV3/H1/GFP/Puro载体,筛选有效shRNA慢病毒载体,继而在293T细... 目的构建人肌细胞增强因子2C(MEF2C)基因短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,观察其对髓母细胞瘤Daoy细胞MEF2C mRNA表达的影响。方法设计MEF2C基因特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pGLV3/H1/GFP/Puro载体,筛选有效shRNA慢病毒载体,继而在293T细胞中包装成病毒颗粒,将其感染髓母细胞瘤Daoy细胞,Real-time PCR检测MEF2C mRNA。结果构建的MEF2C基因shRNA慢病毒载体测序正确,包装获得的shR-NA慢病毒颗粒感染Daoy细胞后其MEF2C mRNA表达量较阴性对照组下降了81.1%。结论成功构建了MEF2C基因shRNA慢病毒表达载体并包装成慢病毒颗粒,其能够有效抑制MEF2C mRNA的表达。 展开更多

关键词 肌细胞增强因子2C 短发卡rna 慢病毒 Daoy细胞株

在线阅读 下载PDF 职称材料

以慢病毒为载体的人骨肉瘤细胞肾上腺髓质素RNA干扰体系的构建

9

作者 戴星 杨康平 +4 位作者 尹战海 马巍 杨益民 周晓玲 姚璐 《山东医药》 CAS 2019年第33期1-4,共4页

目的以人骨肉瘤细胞的肾上腺髓质素(ADM)为作用靶点,建立以慢病毒为载体的RNA干扰体系,以高效抑制ADM基因的表达。方法构建慢病毒载体,设计3条针对ADM基因序列的shRNA序列(shRNA-1、2、3),靶向ADM shRNA与慢病毒载体连接后,挑选LV-ADM-s... 目的以人骨肉瘤细胞的肾上腺髓质素(ADM)为作用靶点,建立以慢病毒为载体的RNA干扰体系,以高效抑制ADM基因的表达。方法构建慢病毒载体,设计3条针对ADM基因序列的shRNA序列(shRNA-1、2、3),靶向ADM shRNA与慢病毒载体连接后,挑选LV-ADM-shRNA阳性克隆进行PCR鉴定并测序。经测序确认寡核苷酸插入部位正确后,提取目的质粒LV-ADM-shRNA 1、2、3,在293T细胞中包装携带目的质粒的慢病毒,然后采用多孔稀释法测定慢病毒滴度。结果构建3条靶向ADM的LV-shRNA慢病毒载体,并获得较高滴度的慢病毒颗粒。结论成功建立以慢病毒为载体的人骨肉瘤细胞ADM RNA干扰体系。 展开更多

关键词 rna干扰体系 肾上腺髓质素 慢病毒载体 骨肉瘤细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

10

作者 李辉 龚燕华 +1 位作者 胡光宇 阴彬 《山西医科大学学报》 CAS 2010年第9期775-779,共5页

目的构建并鉴定NSPc1-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统进一步研究NSPc1的功能。方法设计针对NSPc1mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成带内切酶粘/平末端的双链后,与酶切后的... 目的构建并鉴定NSPc1-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统进一步研究NSPc1的功能。方法设计针对NSPc1mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成带内切酶粘/平末端的双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化。用双酶切及DNA测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆质粒并转染293T细胞,收集细胞全蛋白用Western检测RNAi效果。结果重组克隆经酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,Western检测证实设计的三条RNA干扰序列有效敲低了293T细胞中的内源性NSPc1。结论 3个NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用基于慢病毒系统的RNAi技术来研究NSPc1基因的功能打下了基础。 展开更多

关键词 rna干扰 NSPC1 小发夹状rna 慢病毒载体 多梳家族

在线阅读 下载PDF 职称材料

VASP基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

11

作者 王静 魏蕾 邱堃 《中国医药导报》 CAS 2018年第25期9-12,共4页

目的构建靶向血管扩张刺激磷蛋白(VASP)基因RNA干扰慢病毒表达载体。方法将前期构建的pcDNA6.2-miRVASP进行测序鉴定,筛选阳性克隆。通过Gateway技术中的BP反应及LR反应,将携带miRVASP的表达框克隆至慢病毒目的载体pLenti6/V5-DEST,构... 目的构建靶向血管扩张刺激磷蛋白(VASP)基因RNA干扰慢病毒表达载体。方法将前期构建的pcDNA6.2-miRVASP进行测序鉴定,筛选阳性克隆。通过Gateway技术中的BP反应及LR反应,将携带miRVASP的表达框克隆至慢病毒目的载体pLenti6/V5-DEST,构建靶向VASP基因的RNA干扰慢病毒表达载体pLenti6/V5-miRVASP;接着将其与慢病毒包装混合物共转染293FT细胞,收集病毒颗粒,侵染胃癌BGC-823细胞。结果慢病毒表达载体测序结果表明,构建的载体与预期完全一致。用收集的携带miRVASP表达框的慢病毒颗粒侵染BGC-823细胞,荧光显微镜下可见多量细胞表达强绿色荧光,证明包装产生的慢病毒颗粒能侵染BGC-823细胞。结论成功构建了靶向VASP基因的RNA干扰慢病毒表达载体,并包装产生慢病毒颗粒原液,成功侵染BGC-823细胞,为进一步在体内实验中研究VASP在胃癌侵袭转移中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 血管扩张刺激磷蛋白 rna干扰 慢病毒载体

在线阅读 下载PDF 职称材料

NTE基因ShRNA慢病毒载体的构建与鉴定

12

作者 张银花 李秋明 +1 位作者 孙英健 沈红 《北京农学院学报》 2017年第2期6-9,共4页

【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜... 【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。 展开更多

关键词 pLL3.7 慢病毒载体 短发卡结构rna NTE

在线阅读 下载PDF 职称材料

人乳头状瘤病毒E6和E7蛋白过表达慢病毒载体构建及稳定转染喉上皮细胞系的建立

13

作者 肖洋 周思含 +1 位作者 牛子捷 王军 《中国耳鼻咽喉头颈外科》 CSCD 2022年第12期790-794,共5页

目的分别构建过表达人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6型和11型的E6、E7癌基因的慢病毒载体,建立HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因过表达的SNU-1076喉上皮细胞系模型。方法分别合成表达HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因的片段,构建重... 目的分别构建过表达人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6型和11型的E6、E7癌基因的慢病毒载体,建立HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因过表达的SNU-1076喉上皮细胞系模型。方法分别合成表达HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因的片段,构建重组慢病毒载体pHBLV-CMV-h-HPV6-E6-E7-3FLAG-ZsGreen-Puro和pHBLV-CMV-h-HPV11-E6-E7-3FLAG-ZsGreen-Puro。包装慢病毒后转染进入人喉上皮细胞系SNU-1076,经嘌呤霉素抗性筛选得到阳性克隆。采用实时定量PCR法分别检测HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因过表达的水平。结果通过测序验证质粒构建的成功。实时荧光定量PCR的结果显示,转染HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因的SNU-1076细胞系相较于转染对照空载体的细胞系出现了明显的扩增曲线。其中HPV6-E6-E7的过表达效果为41692倍,HPV11-E6-E7的过表达效果为124957倍。结论利用慢病毒法成功分别建立了过表达HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7的喉上皮SNU-1076细胞系。 展开更多

关键词 人乳头状瘤病毒6 人乳头状瘤病毒11 癌基因 慢病毒表达载体 稳定转染 喉上皮细胞系

在线阅读 下载PDF 职称材料

大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定 被引量：4

14

作者 金婧 包新华 +2 位作者 潘虹 张玉稚 吴希如 《山西医科大学学报》 CAS 2007年第5期393-397,共5页

目的构建并鉴定大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术进一步研究MeCP2功能。方法设计针对大鼠MeCP2mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、... 目的构建并鉴定大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术进一步研究MeCP2功能。方法设计针对大鼠MeCP2mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化。用菌落PCR法、酶切及DNA测序鉴定重组克隆。结果重组克隆经菌落PCR及酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确。结论两个大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用RNAi研究大鼠MeCP2功能打下了基础。 展开更多

关键词 rna干扰 MECP2 小发夹状rna 慢病毒载体 大鼠

在线阅读 下载PDF 职称材料

人SNCG基因shRNA慢病毒载体质粒的构建及鉴定 被引量：3

15

作者 李文怡 范余娟 +2 位作者 徐红 范江涛 孙丹 《山东医药》 CAS 北大核心 2016年第26期13-16,共4页

目的构建人SNCG基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体质粒,并观察用其转染后人子宫内膜癌HEC-1-A和Ishikawa细胞SNCG mRNA和蛋白的表达变化。方法设计3种SNCG基因特异性shRNA序列SNCGKD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3,用脂质体Lipofectamine 2000... 目的构建人SNCG基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体质粒,并观察用其转染后人子宫内膜癌HEC-1-A和Ishikawa细胞SNCG mRNA和蛋白的表达变化。方法设计3种SNCG基因特异性shRNA序列SNCGKD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3,用脂质体Lipofectamine 2000在293T细胞构建成慢病毒载体质粒。用SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒载体质粒转染人子宫内膜癌HEC-1-A和Ishikawa细胞,用实时荧光定量PCR法检测SNCG mRNA,用Western blot法检测SNCG蛋白。结果利用AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切连接转化后的3组阳性转化子,1%琼脂糖凝胶电泳,特异条带与预计结果相符。Chromas Lite比对分析基因测序结果,鉴定结果与Gen Bank数据库一致,表明合成的3对SNCG shRNA序列SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3插入正确。HEC-1-A和Ishikawa细胞转染SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒载体质粒后SNCG mRNA和蛋白的表达均显著降低(P均<0.05)。结论成功构建了3种SNCG shRNA慢病毒载体质粒,用其转染HEC-1-A和Ishikawa细胞后可有效沉默SNCG基因表达。 展开更多

关键词 SNCG基因 短发夹干扰rna 慢病毒载体质粒 子宫内膜癌 基因沉默

在线阅读 下载PDF 职称材料

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子RNAi慢病毒载体的构建 被引量：3

16

作者 涂燕 李振江 +4 位作者 汤爱萍 李慧慧 贺文凤 李洁 张冉 《山东医药》 CAS 北大核心 2011年第33期16-18,共3页

目的构建人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法参照文献设计RNAi靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生RNAi慢病毒载体pGC-LV。PCR鉴定... 目的构建人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法参照文献设计RNAi靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生RNAi慢病毒载体pGC-LV。PCR鉴定阳性克隆并测序,将测序正确的pGC-LV、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒经脂质体2000共转染293T细胞,获得重组慢病毒,用逐孔稀释法测定病毒滴度。结果合成的含EMMPRIN vshRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确;病毒包装后滴度为1×109 TU/ml。结论应用基因工程技术成功构建了可供感染的EMMPRIN基因RNAi慢病毒载体,此为进一步研究EMMPRIN在急性白血病中的作用奠定了实验基础。 展开更多

关键词 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 rna干扰 慢病毒载体

在线阅读 下载PDF 职称材料

Survivin-siRNA慢病毒载体的构建及对裸鼠A549细胞移植瘤生长的影响 被引量：2

17

作者 赵岐刚 司磊 +2 位作者 田小侠 朱桂锋 李鹏 《山东医药》 CAS 北大核心 2009年第39期42-43,共2页

目的为特定类型肿瘤的基因治疗提供新思路。方法将20只移植人肺腺癌模型裸鼠随机分为空白对照组6只、空白载体组6只和慢病毒载体组8只,分别于肿瘤组织局部注射生理盐水、空白病毒载体和Survivin-siRNA的慢病毒载体50μl1次,4周后观察抑... 目的为特定类型肿瘤的基因治疗提供新思路。方法将20只移植人肺腺癌模型裸鼠随机分为空白对照组6只、空白载体组6只和慢病毒载体组8只,分别于肿瘤组织局部注射生理盐水、空白病毒载体和Survivin-siRNA的慢病毒载体50μl1次,4周后观察抑瘤率;每隔3d用游标卡尺测量各组瘤体长径(L))、短径(S),计算瘤体积(V);绘制肿瘤生长曲线。结果慢病毒载体组、空白载体组抑瘤率分别为45.89%、6.28%,P<0.01;慢病毒载体组肿瘤体积明显小于空白对照组和空白载体组(P均<0.01),肿瘤生长曲线示慢病毒载体组肿瘤生长速度明显慢于空白对照组和空白载体组(P均<0.01)。结论慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制裸鼠A549细胞Sur-vivin基因表达,可显著抑制肿瘤生长;本研究为肿瘤的基因治疗提供了新思路。 展开更多

关键词 rna干扰 生存素 慢病毒载体

在线阅读 下载PDF 职称材料

ALR siRNA慢病毒载体最佳干扰序列的筛选及构建

18

作者 郭虹利 吴传新 +3 位作者 郭晖 刘杞 杨超 孙航 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期267-271,共5页

目的筛选并构建肝再生增强因子(ALR)基因的最佳RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体,为研究ALR基因表达下调后对肝癌细胞生物学特性的影响提供依据。方法针对ALR基因序列设计并合成4个siRNA靶点,酶切连接GV118-GFP载体,PCR筛... 目的筛选并构建肝再生增强因子(ALR)基因的最佳RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体,为研究ALR基因表达下调后对肝癌细胞生物学特性的影响提供依据。方法针对ALR基因序列设计并合成4个siRNA靶点,酶切连接GV118-GFP载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定;在包含ALR基因的质粒中以PCR法扩增出ALR基因,克隆至慢病毒载体GV143,构建ALR基因的过表达质粒,将RNAi重组慢病毒载体和ALR的基因表达质粒共转染293T细胞,用western blot检测其对目的基因ALR的敲减效率。结果酶切鉴定证实成功构建了ALR RNAi慢病毒载体及ALR基因过表达载体。不同浓度干扰质粒(0.4μg和0.8μg)的western blot结果显示,相较于阴性对照组,KD1组ALR蛋白的表达水平(0.51±0.02,0.36±0.09)、KD2组ALR蛋白的表达水平(0.65±0.04,0.49±0.02)、KD3组ALR蛋白的表达水平(0.62±0.07,0.52±0.02)均降低(P均<0.05),而以KD1组蛋白表达量最低。结论成功筛选并构建了能有效沉默ALR基因的最佳RNAi重组慢病毒载体,为后续实验奠定基础。 展开更多

关键词 肝再生增强因子基因 rna干扰 慢病毒载体

在线阅读 下载PDF 职称材料

靶向人乳腺癌HPSE基因的shRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

19

作者 陈国利 王烈 《中国现代普通外科进展》 CAS 2011年第1期24-28,共5页

目的:应用RNA干扰技术构建HPSE shRNA重组慢病毒载体,并筛选出最显著抑制HPSE表达的shRNA干扰序列。方法:体外化学合成针对HPSE基因的siRNA序列,在慢病毒载体介导下转染MDA-MB-231细胞,实时定量PCR检测HPSE mRNA表达水平。结果:HPSE sh... 目的:应用RNA干扰技术构建HPSE shRNA重组慢病毒载体,并筛选出最显著抑制HPSE表达的shRNA干扰序列。方法:体外化学合成针对HPSE基因的siRNA序列,在慢病毒载体介导下转染MDA-MB-231细胞,实时定量PCR检测HPSE mRNA表达水平。结果:HPSE shRNA转染MDA-MB-231细胞72 h后,RT-PCR结果表明:所设计的siRNA1组、siRNA4组针对不同靶点的shRNA与对照组相比均可有效抑制HPSE的表达,且成功筛选出最有效抑制HPSE表达的shRNA4序列(P<0.05)。结论:成功构建了HPSE shRNA重组慢病毒载体,其转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后显著抑制了HPSE的表达,为进一步探讨乳腺癌的侵袭转移机制及肿瘤的基因治疗提供了实验基础。 展开更多

关键词 乳腺肿瘤 HPSE SHrna rna干扰 慢病毒载体

在线阅读 下载PDF 职称材料

慢病毒载体构建稳定的maspin表达敲减食管癌细胞株 被引量：4

20

作者 陈静 周园 +2 位作者 郑磊 王前 蔡贞 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2014年第2期138-142,共5页

目的前期研究表明maspin在食管癌组织中表达下调。文中利用慢病毒载体介导短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)感染食管癌细胞株,诱导maspin基因沉默,构建稳定的maspin表达敲减细胞株。方法合成maspin特异shRNA序列(shMas1和shMas2),构... 目的前期研究表明maspin在食管癌组织中表达下调。文中利用慢病毒载体介导短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)感染食管癌细胞株,诱导maspin基因沉默,构建稳定的maspin表达敲减细胞株。方法合成maspin特异shRNA序列(shMas1和shMas2),构建shMas1和shMas2慢病毒表达载体;利用293FT细胞包装病毒后,感染食管癌细胞株HKESC-2;经嘌呤霉素筛选获得稳定感染细胞株。定量PCR和免疫印迹法检测干扰效果。结果成功构建shMaspin的慢病毒表达载体;与野生型HKESC-2细胞比较,获得的稳定maspin表达敲减细胞株shMas1/HK2和shMas2/HK2生长特性无明显变化,其maspin mRNA及蛋白质表达水平均明显降低,maspin mRNA敲减效率分别为37.8%及58.2%,maspin蛋白质表达的相对抑制率分别为49%和53%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了稳定的maspin表达敲减的食管癌细胞株shMas1/HK2和shMas2/HK2。 展开更多

关键词 MASPIN 慢病毒载体 短发夹rna 食管鳞状细胞癌

在线阅读 下载PDF 职称材料