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犬副流感病毒N蛋白的真核表达及多克隆抗体制备
1
作者 刘敏 程淮 +3 位作者 郑珍珍 张梦思 张贺伟 任静强 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第5期2287-2294,共8页
【目的】通过真核表达系统表达犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)N蛋白,并制备N蛋白多克隆抗体,为后续CPIV N蛋白的鉴定及病毒在生命周期过程中的功能研究提供基础。【方法】构建CPIV N蛋白真核表达质粒pCAGGS-N,经PCR和We... 【目的】通过真核表达系统表达犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)N蛋白,并制备N蛋白多克隆抗体,为后续CPIV N蛋白的鉴定及病毒在生命周期过程中的功能研究提供基础。【方法】构建CPIV N蛋白真核表达质粒pCAGGS-N,经PCR和Western blotting验证质粒功能后,免疫小鼠,制备CPIV N蛋白多克隆抗体;ELISA法测定抗体效价达到理想效价后,终止免疫;通过Western blotting、间接免疫荧光试验对抗体进行鉴定和分析,并测定多克隆抗体的中和活性。【结果】酶切连接、测序验证结果显示,成功构建了CPIV N蛋白真核表达重组质粒pCAGGS-N,且该质粒可在真核细胞中正常转录和翻译;通过DNA免疫成功制备了小鼠抗CPIV N蛋白多克隆抗体,效价为1∶128000。Western blotting结果显示,该抗体可与纯化的CPIV病毒粒子及外源性表达的CPIV N蛋白结合,分子质量约为59 ku。间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别并结合具有空间构象的CPIV N蛋白,但该多克隆抗体不具有病毒中和活性。【结论】本试验成功构建了真核表达质粒pCAGGS-N,并通过DNA免疫方法成功制备了小鼠抗CPIV N蛋白的多克隆抗体,该抗体具有良好的反应性和特异性,但未显示出中和病毒的活性,为进一步研究CPIV N基因的功能及其他细胞免疫学试验提供了研究基础。 展开更多
关键词 犬副流感病毒(CPIV) 核衣壳蛋白 真核表达 DNA免疫 多克隆抗体
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基于二聚体核衣壳蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体iELISA检测方法建立 被引量：1
2
作者 赵啸 乔松林 +3 位作者 孙亚宁 钱祁昇 李睿 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2024年第11期135-146,共12页
为制备稳定性好、免疫反应性佳的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N),设计表达二聚体N蛋白(N-dimer),并基于该蛋白质建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体间接酶联免疫吸附试验... 为制备稳定性好、免疫反应性佳的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N),设计表达二聚体N蛋白(N-dimer),并基于该蛋白质建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体间接酶联免疫吸附试验(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA)检测方法。首先选取当前PRRSV国内优势毒株NADC30-like N蛋白基因序列,通过(GGGGS)3linker将N蛋白基因序列串联,经密码子优化合成后构建N-dimer重组表达载体。利用原核表达系统进行诱导表达,并通过镍离子螯合亲和层析法进行纯化。Western-blot分析其与PRRSV阳性和阴性血清的反应性;冻融法比较N-dimer与单体N蛋白(N-monomer)的沉淀析出情况;ELISA法比较N-dimer与N-monomer的免疫反应性。以N-dimer作为包被抗原建立PRRSV抗体iELISA检测方法,对该方法的反应条件进行优化,验证其特异性、敏感性、重复性,并应用于临床血清样品检测。结果表明,在16℃、0.2 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷条件下诱导16 h,N-dimer获得大量可溶性表达。Western-blot结果表明,N-dimer能够与PRRSV阳性血清发生特异性反应;相较于N-monomer,N-dimer能够稳定保存,并且免疫反应性更佳。成功建立了基于N-dimer的PRRSV抗体iELISA检测方法,且该方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性;与商业试剂盒结果进行比较,其阳性符合率为96.88%,总符合率为96.86%,符合率高。综上,成功制备了稳定性好、免疫反应性佳的N-dimer,并基于N-dimer建立了PRRSV抗体iELISA检测方法。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 核衣壳蛋白 二聚体 间接ELISA 临床检测
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施马伦贝格病毒N蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备
3
作者 仇槿昕 侯辉 +2 位作者 孙法壮 冯耀宇 李维克 《中国草食动物科学》 北大核心 2025年第3期39-45,共7页
施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)是一种新型正布尼亚病毒,主要感染牛、绵羊和山羊等反刍动物。SBV的核衣壳蛋白(N)已被证明是血清学检测的理想靶抗原。本研究将SBV N基因的全长编码序列克隆至pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-2... 施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)是一种新型正布尼亚病毒,主要感染牛、绵羊和山羊等反刍动物。SBV的核衣壳蛋白(N)已被证明是血清学检测的理想靶抗原。本研究将SBV N基因的全长编码序列克隆至pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-SBV-N,转化至Rosseta感受态细胞中,IPTG诱导表达N蛋白。采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析法纯化His-SBV-N蛋白,以获得的N蛋白免疫BALB/c小鼠,3次免疫后取效价高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,制备得到针对SBV N蛋白的单克隆抗体(McAbs),并通过间接ELISA筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。最终获得3株稳定分泌抗N单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2B1、2B2和3F2。抗体亚型鉴定均为IgG2a。Western blot和ELISA检测结果表明,这3株单抗在酶联免疫吸附试验中与重组SBV N蛋白具有良好的反应性,重组N蛋白的表达和单抗的成功制备为SBV的血清学诊断提供了重要材料。 展开更多
关键词 施马伦贝格病毒 核衣壳蛋白 原核表达 细胞融合 单克隆抗体
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鸭病毒性肠炎病毒基因文库的构建及其核衣壳蛋白基因的发现、克隆与鉴定 被引量：22
4
作者 程安春 汪铭书 +6 位作者 文明 周伟光 郭宇飞 贾仁勇 徐超 袁桂萍 刘一尘 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期948-953,共6页
提取鸭病毒性肠炎病毒（DEV）基因组DNA,超声波处理使其片段化,经补平末端后,分级分离并收集各部分DNA片段,与质粒pBluescript Ⅱ SK（＋）连接,转化大肠杆菌DH5α,成功构建了DEV基因文库.随机选取文库中的重组质粒测序分析,DNA序列拼... 提取鸭病毒性肠炎病毒（DEV）基因组DNA,超声波处理使其片段化,经补平末端后,分级分离并收集各部分DNA片段,与质粒pBluescript Ⅱ SK（＋）连接,转化大肠杆菌DH5α,成功构建了DEV基因文库.随机选取文库中的重组质粒测序分析,DNA序列拼接后获得大于100bp以上ORF共187个,将其中一个含完整ORF的DNA片段,以BLASTX软件与Genbank上相应基因进行比对分析,初步确定为一种核衣壳蛋白基因.根据该基因片段序列,设计引物对DEV DNA进行PCR扩增,并克隆到pGEM-T载体上,转化宿主菌JM109,提取阳性重组质粒,经PCR检测、酶切鉴定、测序和生物信息学分析,确定该基因片段为DEV核衣壳蛋白基因. 展开更多
关键词 鸭病毒性肠炎病毒 基因文库 核衣壳蛋白基因
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犬瘟热病毒A株核衣壳蛋白基因的克隆、表达及特性分析 被引量：13
5
作者 周洁 李昌文 +3 位作者 张洪英 陈洪岩 李建伟 曲连东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期485-488,共4页
根据GenBank中A75/14株犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR从病毒总RNA中扩增出1600bp的N基因,将其克隆于pMD18-T载体对其进行序列分析。结果表明A株CDV与其它毒株N基因序列的同源性较高。将N基因... 根据GenBank中A75/14株犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR从病毒总RNA中扩增出1600bp的N基因,将其克隆于pMD18-T载体对其进行序列分析。结果表明A株CDV与其它毒株N基因序列的同源性较高。将N基因定向克隆于原核表达载体pPROEXTMHT,用重组质粒pPROEXTMHT-N转化感受态E.coliDH5a细胞,用IPTG于37℃诱导表达了分子量约63Ku的重组N蛋白,占菌体总蛋白18%。经Westernblot分析证实所表达的重组N蛋白具反应活性,将表达产物用ProBondTM纯化试剂盒进行了纯化。用所获得的重组蛋白免疫家兔制备的多克隆抗体可与CDV全病毒发生特异性反应,经琼扩试验测定其效价为1∶16。本实验为下一步用重组N蛋白作为诊断用抗原,建立特异的CDV抗体检测方法奠定了基础。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 核衣壳蛋白 表达 反应活性 多克隆抗体
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猪传染性胃肠炎病毒核衣壳(N)蛋白基因的克隆与表达 被引量：6
6
作者 唐丽杰 李一经 +2 位作者 贾永清 王君伟 刘宝全 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期611-614,共4页
以猪传染性胃肠炎病毒亚基因组mRNA为模板根据文献设计一对引物 ,通过RT -RCR技术 ,扩增其核衣壳(N)蛋白基因的cDNA ;将其按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pProEXHTb中特异酶切位点 ;将重组质粒PHN转化进大肠杆菌TG1株 ,在浓度为 1 ... 以猪传染性胃肠炎病毒亚基因组mRNA为模板根据文献设计一对引物 ,通过RT -RCR技术 ,扩增其核衣壳(N)蛋白基因的cDNA ;将其按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pProEXHTb中特异酶切位点 ;将重组质粒PHN转化进大肠杆菌TG1株 ,在浓度为 1 0mMIPTG和 37℃条件下诱导 ,PHN基因融合蛋白获得了表达 ;经SDS -PAGE ,Western blot试验 ,确定其表达的融合蛋白产物大小为预期的 47kD。试验结果证明 。 展开更多
关键词 猪 传染性胃肠炎病毒 核衣壳 克隆 蛋白基因 基因表达
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非典型犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因序列分析及其在大肠杆菌中的表达 被引量：5
7
作者 毕振威 王永山 +5 位作者 范红结 王智群 吴晓悠 马金荣 欧阳伟 张海彬 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期625-629,共5页
为分析当地非典型犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性,根据已发表CDV的N基因序列设计引物,用RT-PCR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因,进行克隆和序列分析,结果表明:该非典型CDV的N基因与... 为分析当地非典型犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性,根据已发表CDV的N基因序列设计引物,用RT-PCR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因,进行克隆和序列分析,结果表明:该非典型CDV的N基因与已发表的12个CDV强毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在96.6%～99.2%和97.9%～99.4%之间,与已发表的4个CDV疫苗弱毒株的同源性分别在93.2%～93.6%和96.4%～97.5%之间;在N基因系统发育进化树上,非典型CDV与12个强毒株处在同一亚群,而且与9个中国分离毒株的亲缘关系近于3个国外毒株。N基因在大肠杆菌中表达的重组N蛋白的分子量为62 ku,主要以包涵体的形式存在;用western blot分析,重组N蛋白可与CDV阳性血清发生特异性反应;以纯化的重组N蛋白为抗原建立的CDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 非典型 核衣壳蛋白基因 序列分析 原核表达
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番茄斑萎病毒核衣壳蛋白基因的克隆与分析 被引量：8
8
作者 唐前君 孙书娥 +4 位作者 刘勇 谭新球 肖启明 谢丙炎 张德咏 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期65-69,共5页
从云南表现褪绿黄化症状的番茄上分离到番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)YN-1株系,利用RT-PCR方法克隆了该株系的核衣壳蛋白基因,并测定了该基因的序列,全长为777 bp,编码258个氨基酸。对该基因的氨基酸序列分析结果表明,YN-1 ... 从云南表现褪绿黄化症状的番茄上分离到番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)YN-1株系,利用RT-PCR方法克隆了该株系的核衣壳蛋白基因,并测定了该基因的序列,全长为777 bp,编码258个氨基酸。对该基因的氨基酸序列分析结果表明,YN-1 N基因与韩国3个株系的氨基酸序列相似性均高达97%。 展开更多
关键词 番茄斑萎病毒 核衣壳蛋白 克隆
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传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因克隆及在E.coli中的表达 被引量：6
9
作者 周继勇 丁红梅 +1 位作者 程丽琴 沈行燕 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期450-455,共6页
核衣壳蛋白基因 (N基因 )是传染性支气管炎病毒的重要结构基因 .根据已报道的序列设计引物 ,利用RT PCR技术从病毒RNA中扩增和克隆到了N基因的cDNA ,并测定了核苷酸序列 .克隆的N基因片段ORF全长 12 30bp ,编码 4 0 9个氨基酸 .将该片... 核衣壳蛋白基因 (N基因 )是传染性支气管炎病毒的重要结构基因 .根据已报道的序列设计引物 ,利用RT PCR技术从病毒RNA中扩增和克隆到了N基因的cDNA ,并测定了核苷酸序列 .克隆的N基因片段ORF全长 12 30bp ,编码 4 0 9个氨基酸 .将该片段序列与其他IBV病毒株比较 ,核苷酸的同一性为 87 0 %～ 98 6 %,氨基酸的同一性为 91 0 %～ 98 1%.将该cDNA亚克隆到pBV2 2 0表达载体 ,转化大肠杆菌DH5α菌株 ,Western印迹检测 ,获得了分子量约 4 展开更多
关键词 禽病毒 传染性支气管炎病毒 核衣壳蛋白 基因克隆 E.COLI 表达
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淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白基因片段原核载体的构建及表达 被引量：6
10
作者 吴兴安 胡刚 +6 位作者 李继业 刘勇 张芳琳 于澜 白文涛 孙修勤 徐志凯 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2003年第6期78-80,65,共4页
淋巴囊肿病病毒感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,采用RT-PCR法成功获得了淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白0.6kb基因片段。构建其原核表达载体,IPTG诱导表达。结果表明,该融合蛋白分子量约48kD,可与抗LCDV多克隆血清特异反应。为LCDV... 淋巴囊肿病病毒感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,采用RT-PCR法成功获得了淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白0.6kb基因片段。构建其原核表达载体,IPTG诱导表达。结果表明,该融合蛋白分子量约48kD,可与抗LCDV多克隆血清特异反应。为LCDV基因工程疫苗的研制奠定了实验基础。 展开更多
关键词 淋巴囊肿病病毒 主要衣壳蛋白 基因片段 原核载体 虹彩病毒 诱导表达
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犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆和表达 被引量：4
11
作者 杨敬 范薇 +4 位作者 隋丽华 李俊梅 刘永梅 李文龙 陈振文 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2002年第3期165-168,共4页
目的　构建pMal N重组表达载体 ,转化E .coliDH5α ,诱导表达犬瘟热病毒 (CDV)重组核衣壳 (N)蛋白。方法　采用RT PCR技术 ,从CDVRNA中扩增编码N蛋白的基因片段 ,通过连接反应 ,构建重组克隆载体和重组表达载体 ,转化感受态。E .coliDH... 目的　构建pMal N重组表达载体 ,转化E .coliDH5α ,诱导表达犬瘟热病毒 (CDV)重组核衣壳 (N)蛋白。方法　采用RT PCR技术 ,从CDVRNA中扩增编码N蛋白的基因片段 ,通过连接反应 ,构建重组克隆载体和重组表达载体 ,转化感受态。E .coliDH5α细胞。通过IPTG诱导表达CDV重组N蛋白。结果　扩增出约 1 7kbCDV全长的主要结构蛋白N蛋白基因 ,通过PCR获得 5 36bpN蛋白基因片段。将N蛋白基因片段克隆入原核表达载体pMal C2 ,表达产物麦芽糖结合蛋白 (MAP)与N蛋白的融合蛋白的相对分子质量约 6 0× 10 3,与预期大小一致。结论　构建的pMal N重组载体所表达的CDVN蛋白为进一步研究CDV的特异。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 核衣壳蛋白 基因片段 克隆 表达
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鸭肠炎病毒核衣壳蛋白质互作蛋白质基因荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：7
12
作者 赵碧 熊朝丽 +3 位作者 徐茂文 周碧君 程振涛 文明 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第2期389-393,共5页
为进一步阐明鸭肠炎病毒(DEV)的致病机理,本试验建立检测鸭肠炎病毒核衣壳蛋白质(NP)的互作蛋白质(PKCI)基因荧光定量PCR方法。针对PKCI基因设计特异性引物,经PCR扩增目的基因构建重组质粒p MD18-T-PKCI,将其作为阳性标准品构建荧光定量... 为进一步阐明鸭肠炎病毒(DEV)的致病机理,本试验建立检测鸭肠炎病毒核衣壳蛋白质(NP)的互作蛋白质(PKCI)基因荧光定量PCR方法。针对PKCI基因设计特异性引物,经PCR扩增目的基因构建重组质粒p MD18-T-PKCI,将其作为阳性标准品构建荧光定量PCR标准曲线,并对建立的荧光定量PCR方法进行重复性、特异性和敏感性试验。结果显示:标准曲线的线性关系为Y=-3.31x+42.00,相关系数为-1.00,扩增效率为100%,熔解曲线仅出现单特异峰,对H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒、鸭肝炎病毒均未检测到荧光信号。表明本试验建立的方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏性。 展开更多
关键词 鸭肠炎病毒 核衣壳蛋白质 蛋白质激酶C抑制蛋白质 荧光定量PCR
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H5N1亚型禽流感病毒核衣壳蛋白(NP)基因的进化及原核表达 被引量：4
13
作者 邬成业 王爱萍 +4 位作者 郝慧芳 史平玲 游雷鸣 李培培 张改平 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2010年第3期19-22,共4页
参考GenBank上H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计引物,PCR扩增NP基因,对其进行序列分析并构建分子进化树。将克隆的NP基因插入原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中进行诱导表达,对诱导表达的NP重组蛋白进行纯化、Wester... 参考GenBank上H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计引物,PCR扩增NP基因,对其进行序列分析并构建分子进化树。将克隆的NP基因插入原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中进行诱导表达,对诱导表达的NP重组蛋白进行纯化、Western-Blot鉴定及免疫原性分析。结果表明,克隆的NP基因与GenBank上发表的另外2个河南AIV毒株亲缘关系较近,诱导表达的NP重组蛋白主要以可溶性形式存在,分子量约为70 kDa,并且能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H5亚型 核衣壳蛋白(NP) 原核表达
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传染性支气管炎病毒T株核衣壳蛋白(N)基因的克隆及部分序列分析 被引量：3
14
作者 陈丽君 陈丽君 +12 位作者 蔡学忠 王英 王英 张平 张平 张鸣 张鸣 陈波 陈波 沈建英 沈建英 王建荣 王建荣 《上海农业学报》 CSCD 1999年第1期22-27,共6页
人工合成一双对应于ＩＢＶ－Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｎ基因ＯＲＦ两侧序列的引物，应用ＲＴ－ＰＣＲ方法，获得肾型传染性支气管炎病毒Ａｕｓｔｒａｌｉａ－Ｔ株核衣壳蛋白基因，长度１．２３ｋｂ，利用引物设计中的ＥｃｏＲ　Ｉ位点将其... 人工合成一双对应于ＩＢＶ－Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｎ基因ＯＲＦ两侧序列的引物，应用ＲＴ－ＰＣＲ方法，获得肾型传染性支气管炎病毒Ａｕｓｔｒａｌｉａ－Ｔ株核衣壳蛋白基因，长度１．２３ｋｂ，利用引物设计中的ＥｃｏＲ　Ｉ位点将其克隆至载体ｐＳＫ（＋）中，对该基因进行限制性酶切分析，结果与已报道的相一致。通过Ｎ基因的Ｃ端部分序列分析及与Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株、Ｍ４１标准株和日本分离株相比较，结果表明该部分的序列有一定的差异，其同源率分别为８６．８％、８６．８％和８７．３％，推测的氨基酸同源率分别为８７．２％、８７．２％和８８．７％。 展开更多
关键词 RT-PCR 核衣壳蛋白基因 序列分析 IBV
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淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白基因片段在真核细胞中的初步表达 被引量：5
15
作者 吴兴安 李继业 +6 位作者 胡刚 刘勇 张芳琳 于澜 白文涛 孙修勤 徐志凯 《科学技术与工程》 2003年第3期234-236,共3页
将淋巴囊肿病病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)主要衣壳蛋白(Majoy capsid protein,MCP)0.6kb基因片段克隆入真核表达载体pEGFP-N_2,得到阳性重组质粒pEGFP-N_2-LCDV0.6,用脂质体法将其转染入真核细胞CHO,并进行瞬时表达,荧光显... 将淋巴囊肿病病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)主要衣壳蛋白(Majoy capsid protein,MCP)0.6kb基因片段克隆入真核表达载体pEGFP-N_2,得到阳性重组质粒pEGFP-N_2-LCDV0.6,用脂质体法将其转染入真核细胞CHO,并进行瞬时表达,荧光显微镜观察及特异性RT-PCR检测结果表明:已成功将目的片断LCDV MCP 0.6kb转染到CHO细胞,并得到了初步表达。此研究为LCDV基因工程疫苗的研制提供了实验资料。 展开更多
关键词 淋巴囊肿病病毒 主要衣壳蛋白基因 真核细胞 基因克隆 基因表达 鱼类病毒
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兔出血症病毒YL株衣壳蛋白VP60基因在原核系统中的高效表达 被引量：3
16
作者 李传山 任力刚 +2 位作者 李维英 杨增岐 郭蔼光 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2007年第11期24-28,共5页
为了在原核系统中高效表达兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60,应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL中克隆出了衣壳蛋白VP60基因并测序,结果显示,YL株VP60基因全长1740 bp,GC含量为55.3%,已在GenBank中注册(登录号为DQ530363),... 为了在原核系统中高效表达兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60,应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL中克隆出了衣壳蛋白VP60基因并测序,结果显示,YL株VP60基因全长1740 bp,GC含量为55.3%,已在GenBank中注册(登录号为DQ530363),VP60基因与中国RHDV最早期分离株WX84的VP60基因核苷酸序列同源性为93.0%,氨基酸序列同源性为95.8%。构建成功YL株VP60基因原核表达载体VP60-pET32a,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。1 mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示,VP60融合蛋白分子质量约为75 ku,其表达量占总菌体蛋白的39.8%。Western blot检测结果表明,VP60融合蛋白可以和RHDV抗血清发生特异反应。本研究结果显示,兔出血症病毒在干旱半干旱条件下的遗传变异和免疫学特征无较大变化。 展开更多
关键词 兔出血症病毒(RHDV) 衣壳蛋白(VP60)基因 原核表达 WESTERN BLOT
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猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达 被引量：2
17
作者 刘成倩 肖长峰 +4 位作者 易建中 关平原 吴双林 陈斌 张天庆 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第22期10429-10430,10513,共3页
[目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计1对引物,用RT-PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白(N)基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4... [目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计1对引物,用RT-PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白(N)基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N。将重组质粒转化大肠杆菌BL31(DE3)感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。[结果]PRRSV肺组织所提取的RNA,经RT-PCR扩增,得到一段392 bp的片段,与预期结果一致。SDS-PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约39.866 Da,与预期结果相同。重组菌体超声裂解后,经10%的SDS-PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白。[结论]该研究为重组蛋白的纯化奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 核衣壳蛋白 克隆 表达
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家蚕核型多角体病毒ODV囊膜蛋白基因的融合表达及引导外源蛋白进入多角体的研究 被引量：2
18
作者 相兴伟 陈琳 +2 位作者 于少芳 杨锐 吴小锋 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期785-791,共7页
为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-E... 为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。 展开更多
关键词 家蚕核型多角体病毒 包涵体衍生病毒囊膜蛋白 多角体 蛋白质固定
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传染性支气管炎病毒腺胃青岛株(SD/97/02)核衣壳蛋白基因的克隆与鉴定 被引量：2
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作者 潘杰彦 陈德胜 +2 位作者 王忠田 陈溥言 蔡宝祥 《南京农业大学学报》 CSCD 北大核心 2000年第3期118-120,共3页
关键词 鸡 传染性支气管病毒 核衣壳蛋白基因
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犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性分析 被引量：2
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作者 毕振威 王永山 范红结 《中国动物传染病学报》 CAS 2011年第5期21-26,共6页
将非典型犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)的核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)基因克隆到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建含N基因的重组供体质粒pFastBac-N,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经筛选获得含N基因的重... 将非典型犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)的核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)基因克隆到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建含N基因的重组供体质粒pFastBac-N,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经筛选获得含N基因的重组Bacmid DNA(rBacmid-N),脂质体法转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒vBacmid-N。用vBacmid-N感染昆虫细胞Sf9,免疫印迹(Western blot)分析,在62kDa处出现一条特异蛋白条带,与重组N蛋白的理论值相符合;间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescent assay,IFA)检测,vBacmid-N感染的昆虫细胞sf9出现特异绿色荧光。以纯化的重组N蛋白为抗原建立CDV抗体间接ELISA检测方法,犬CDV阳性血清A450大于0.40,而犬CDV阴性血清A450小于0.05,显示了良好的抗原特异性与稳定性。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 核衣壳蛋白基因 昆虫细胞 真核表达 杆状病毒
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