利用双重实时荧光重组酶辅助扩增技术快速检测肉制品中鼠源性成分 被引量：1

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作者 刘明明 周朝旭 +2 位作者 颜海燕 田碧英 李根容 《肉类研究》 北大核心 2024年第9期15-20,共6页

为实现肉制品中大鼠和小鼠源性成分的同步检测,基于实时荧光重组酶辅助扩增(real-time recombinase-aided amplification,Rt-RAA)技术,以大鼠COX3基因和小鼠16S rRNA基因序列保守区域为靶标,分别设计相应的Rt-RAA引物和探针,通过反应参... 为实现肉制品中大鼠和小鼠源性成分的同步检测,基于实时荧光重组酶辅助扩增(real-time recombinase-aided amplification,Rt-RAA)技术,以大鼠COX3基因和小鼠16S rRNA基因序列保守区域为靶标,分别设计相应的Rt-RAA引物和探针,通过反应参数的优化确定最佳双重Rt-RAA检测反应条件。进一步对建立的双重Rt-RAA检测方法进行特异性、灵敏度及稳定性评估,并应用该方法对模拟市售肉制品进行检测。结果表明,所建立的双重RtRAA检测方法特异性强、稳定性好,大鼠和小鼠源性成分的检出限分别为0.5%和0.2%,同步检测2种源性成分检出限为0.5%,同步检测混合模拟市售样品检出限仍低至0.5%,双重Rt-RAA与实时荧光定量聚合酶链式反应对市售样品和模拟样品检测结果高度一致。因此,本研究建立的双重Rt-RAA检测方法适用于大鼠和小鼠源性成分的检测,为肉制品掺假检测提供了一种快捷、高效及准确的新方法。 展开更多

关键词 大鼠 小鼠 肉制品 实时荧光重组酶辅助扩增技术 肉制品掺假

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实时重组酶辅助扩增技术快速检测狗源性成分

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作者 刘明明 颜海燕 +3 位作者 周朝旭 叶语桦 李志刚 肖昭竞 《肉类研究》 北大核心 2025年第4期24-29,共6页

为快速检测狗源性成分,针对cytb基因保守区域设计3对重组酶辅助扩增(recombinaseaided amplification,RAA)引物和1条核酸外切酶(exonuclease,exo)探针,通过引物和探针浓度的筛选,构建一种实时RAA(real-time RAA,Rt-RAA)方法。利用交叉... 为快速检测狗源性成分,针对cytb基因保守区域设计3对重组酶辅助扩增(recombinaseaided amplification,RAA)引物和1条核酸外切酶(exonuclease,exo)探针,通过引物和探针浓度的筛选,构建一种实时RAA(real-time RAA,Rt-RAA)方法。利用交叉反应和重复性实验对该检测方法的特异性和稳定性进行评估,并将Rt-RAA方法灵敏度以及对混合模拟样品和市售样品的检测结果与相应的国标检测方法进行对比。结果表明,Rt-RAA检测方法特异性强、稳定性好,在30 min内可检测到目的序列,对狗源性成分的检出限为0.2%,明显优于实时荧光聚合酶链式反应检测方法,应用Rt-RAA方法与国标方法对模拟样品和市售实际样品检测结果完全一致。因此,本研究建立的Rt-RAA检测方法适用于狗源性成分的检测,为肉源性成分鉴定提供了另一种快速、准确的新方法。 展开更多

关键词 实时荧光重组酶辅助扩增技术 狗源性成分 肉制品掺假

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猪肺炎支原体实时荧光重组酶介导的等温扩增快速检测方法的建立和应用

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作者 康浩然 黄雨薇 +7 位作者 宋程 高鹏 张永宁 周磊 盖新娜 韩军 郭鑫 杨汉春 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第9期1-9,共9页

猪肺炎支原体(Mhp)是引起猪支原体肺炎(MPS)的病原,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。早期快速诊断和实时监测对该病的防控至关重要,目前常用的核酸检测方法难以满足临床上即时检测(POCT)的实际需求。本试验针对Mhp细胞膜表面脂蛋白基... 猪肺炎支原体(Mhp)是引起猪支原体肺炎(MPS)的病原,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。早期快速诊断和实时监测对该病的防控至关重要,目前常用的核酸检测方法难以满足临床上即时检测(POCT)的实际需求。本试验针对Mhp细胞膜表面脂蛋白基因p46,通过序列比对和系统性的引物筛选设计了exo探针及其对应的重组酶介导的等温扩增(RAA)技术引物对,建立了Mhp实时荧光(real-time)RAA快速检测方法;随后,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检测,并使用该方法和实时荧光定量PCR(qPCR)对比检测临床样本。结果显示,该方法与猪链球菌、肺炎克雷伯氏菌、猪格拉瑟氏菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌均无交叉反应,特异性好;Mhp real-time RAA及其可视化方法的检测敏感性分别为18和29 copies/μL(95%置信区间),敏感性强;组内和组间重复性试验变异系数均小于8.0%,重复性好;对108份猪临床样本的检测结果显示,该方法及其可视化方法与Mhp qPCR方法的符合率分别为98.15%和99.07%。本试验所建立Mhp real-time RAA方法可以通过便捷式蓝光仪器实现结果的可视化,更适用于资源匮乏的诊断实验室和基层现场,为MPS的防控提供了技术手段。 展开更多

关键词 重组酶介导的等温扩增技术 猪肺炎支原体 实时荧光定量PCR 快速检测

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塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术(RPA)实时荧光检测方法的建立 被引量：18

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作者 樊晓旭 哈登楚日亚 +7 位作者 王英丽 王姣 刘春菊 迟田英 赵永刚 张志诚 吴晓东 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2017年第8期81-86,共6页

塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)可感染猪,引起类似口蹄疫病毒感染造成的水疱性病变,新生仔猪病死率达30%~70%。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对SVV 3D基因设计了引物和探针,并进行筛选、反应条件优化以及敏感性、特... 塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)可感染猪,引起类似口蹄疫病毒感染造成的水疱性病变,新生仔猪病死率达30%~70%。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对SVV 3D基因设计了引物和探针,并进行筛选、反应条件优化以及敏感性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,本方法在40℃、10 min内检测的最低浓度为28拷贝/μL;与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应;通过3次重复试验检测2.8×10~6~2.8×10~1拷贝/μL的6个稀释度样品,在荧光强度达1500 mV所需时间变异系数范围在2.44%~14.95%。该等温、快速扩增方法为猪群出现水疱性疾病的鉴别诊断提供了技术支持,对及时采取适当防控措施具有重要意义。 展开更多

关键词 塞尼卡谷病毒 实时 荧光 重组酶聚合酶扩增

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非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法的建立 被引量：23

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作者 哈登楚日亚 樊晓旭 +6 位作者 赵永刚 王淑娟 张志诚 戈胜强 李林 吴晓东 王志亮 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第11期3270-3277,共8页

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对ASFVB646L(p72)基因设计... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对ASFVB646L(p72)基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×106至5.5×100拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) 实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA) 灵敏性 特异性 重复性

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酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用 被引量：7

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作者 胡海洋 应婉琴 +3 位作者 何军 吕芷贤 谢小平 邓仲良 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期264-270,共7页

利用酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术建立快速检测肺炎支原体的实时荧光检测方法。针对肺炎支原体P1基因设计特异性引物和探针,优化反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。ERA实时荧光法... 利用酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术建立快速检测肺炎支原体的实时荧光检测方法。针对肺炎支原体P1基因设计特异性引物和探针,优化反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。ERA实时荧光法在25-40℃均具有扩增能力,在35℃条件下对肺炎支原体的扩增效果最好,20 min内可完成扩增;该法对肺炎支原体的检出限为10^(3) copies/μL;并对其他6种呼吸道病原体进行检测,均无扩增曲线产生,有较好的特异性;以荧光定量PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法对34份临床样本的检测结果的诊断敏感度为96.15%、特异度为100%、阳性预测值为100%、阴性预测值为88.89%。本研究构建的ERA实时荧光法可以快速简单、灵敏和特异地检测出肺炎支原体,满足现场检测的需求。 展开更多

关键词 酶促重组等温扩增技术 实时荧光检测 肺炎支原体

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建立仙台病毒实时荧光重组酶等温扩增检测方法 被引量：2

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作者 冯丽萍 熊炜 +1 位作者 高诚 魏晓锋 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第12期94-97,121,共5页

目的国标标准规定清洁级和SPF级小鼠必须排除仙台病毒(Sendai virus,SeV)。为了提升效率,简化操作步骤,本研究建立了一种新型分子检测方法——实时荧光重组酶等温扩增技术(real-time RPA)用于检测SeV。方法针对SeV融合蛋白编码基因的保... 目的国标标准规定清洁级和SPF级小鼠必须排除仙台病毒(Sendai virus,SeV)。为了提升效率,简化操作步骤,本研究建立了一种新型分子检测方法——实时荧光重组酶等温扩增技术(real-time RPA)用于检测SeV。方法针对SeV融合蛋白编码基因的保守序列,设计特异性扩增引物及探针并建立检测方法,并评价该检测方法的特异性、敏感性、稳定性和可靠性。最后将该检测方法和团标PCR方法进行优势比较。结果该方法具有很好的特异性,与小鼠肝炎病毒等六种病原微生物无交叉反应。其敏感性、稳定性和可靠性均可,并能够在25 min内完成,远远快于PCR方法。结论本研究建立的SeV实时荧光RPA是一种操作简单,高效直观且特异性好的检测方法。 展开更多

关键词 实时荧光重组酶等温扩增 仙台病毒 快速可视化监测

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非洲猪瘟病毒可视化重组酶辅助扩增检测方法的建立与初步应用 被引量：4

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作者 岳怀宁 李艳蕊 +6 位作者 张亚楠 苏恺 袁晨 逯纪成 孙泰然 薛文阁 宋勤叶 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第5期19-25,共7页

为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)重组酶辅助扩增(RAA)与核酸检测试纸条相结合的可视化RAA检测方法,本试验根据ASFV的B646L基因(编码p72蛋白)保守区设计特异性的引物和探针,通过优化引物和探针浓度、反应温度和反应时间,确定反应的最佳体系... 为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)重组酶辅助扩增(RAA)与核酸检测试纸条相结合的可视化RAA检测方法,本试验根据ASFV的B646L基因(编码p72蛋白)保守区设计特异性的引物和探针,通过优化引物和探针浓度、反应温度和反应时间,确定反应的最佳体系和扩增条件;检测建立的可视化RAA方法的特异性和灵敏性,分析建立方法与非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒对临床样品检测结果的符合率。结果显示,建立的可视化RAA方法的反应体系为25μL,在38℃恒温条件下反应20 min即可在5 min内读取结果;与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等均不发生交叉反应;单个反应可检测到48.75拷贝的病毒核酸。初步临床应用结果显示,建立的可视化RAA方法与商品化的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒检测结果一致,其阴性和阳性符合率均为100%。本试验成功建立的基于ASFV B646L基因的可视化恒温扩增方法具有反应时间短、特异性和灵敏度高、操作便捷等优势,适合现场快速检测和诊断,具有进一步开发潜力。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 B646L基因 重组酶辅助扩增技术 可视化 核酸检测试纸条

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黄颡鱼实时荧光RPA及侧向流RPA试纸条快速现场鉴定方法的建立与应用

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作者 林玉 张旻 +11 位作者 王娜 何舜平 张辉 唐永凯 方成池 景宏丽 张浪 沙航 段志强 王宽 吕继洲 吴绍强 《水生生物学报》 北大核心 2025年第4期120-128,共9页

研究以黄颡鱼为目标对象,基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等温扩增技术,开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先,... 研究以黄颡鱼为目标对象,基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等温扩增技术,开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先,通过对黄颡鱼及其近缘物种的鱼类线粒体基因组序列进行对比分析,针对COI基因保守区域,设计了特异性探针和引物。测试结果显示,在37℃条件下,实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条都具有良好的特异性。实时荧光型RPA方法能够在20min内完成黄颡鱼DNA的检测,且最低检测限可以达到102拷贝数/反应;而侧向流RPA试纸条的操作更加便捷,能够在10min内可完成对102低拷贝数的黄颡鱼DNA的扩增和鉴定。应用这两种RPA检测技术对149份长江流域常见鱼类进行现场检测,两种方法均显示出较高的准确性(准确率100%)。因此,研究开发的两种用于检测黄颡鱼的实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条方法,拥有操作简便、结果直观、准确率高、不依赖实验室仪器设备等优势,具有良好的现场快速检测应用前景。此外,其克服了形态学物种鉴定专业门槛高、难以鉴定残破组织样品的问题,检测靶标可跨越卵、鱼苗、成鱼等全生命周期,为水产品监管执法提供技术手段。 展开更多

关键词 快速物种鉴定 重组酶聚合酶扩增 实时荧光型RPA 侧向流RPA试纸条 黄颡鱼

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ERA实时荧光法快速检测乙肝病毒的建立与应用 被引量：1

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作者 翁兴墉 邹林涛 +3 位作者 周璇 唐红花 何军 邓仲良 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期112-117,共6页

基于酶促重组等温扩增(ERA)技术构建一种快速检测乙肝病毒的实时荧光检测方法。根据乙肝病毒聚合酶编码区(P区)保守序列设计引物和探针,对引物、温度、荧光探针浓度等反应条件进行优化,建立ERA实时荧光法最佳反应体系,再对其敏感性、特... 基于酶促重组等温扩增(ERA)技术构建一种快速检测乙肝病毒的实时荧光检测方法。根据乙肝病毒聚合酶编码区(P区)保守序列设计引物和探针,对引物、温度、荧光探针浓度等反应条件进行优化,建立ERA实时荧光法最佳反应体系,再对其敏感性、特异性、抗干扰能力、临床样本检出效果进行验证。结果显示:ERA实时荧光法在42℃、20 min内可完成对乙肝病毒的检测,最低检出限为102 copies/μL;除乙肝病毒外,其他4种病毒(甲肝病毒、丙肝病毒、EB病毒、巨细胞病毒)均未产生荧光扩增曲线,具有良好的特异性和抗干扰能力;以实时荧光PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法检测58份乙肝病毒临床样本的灵敏度为97.37%、特异度为100%、阴性预测值为95.24%、阳性预测值为100%、Kappa值为0.96。成功建立了一种简单、快速、灵敏、特异、低成本的乙肝病毒早期检测方法,满足乙肝病毒快速检测的需要。 展开更多

关键词 酶促重组等温扩增技术 快速检测 乙肝病毒 ERA实时荧光法 早期诊断

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转录介导扩增技术检测慢性丙型肝炎患者血清中HCV RNA及与RT-PCR的比较 被引量：9

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作者 吴大先 刘菲 +2 位作者 刘洪波 戴立忠 谭德明 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期664-672,共9页

目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HCV RNA,并与实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)进行比较,探讨TMA系统的稳定性及其与RT... 目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HCV RNA,并与实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)进行比较,探讨TMA系统的稳定性及其与RT-PCR的灵敏性差异和相关性,以及TMA临床应用的意义。方法:利用鼠白血病反转录酶(moloney murine leukemia virus,MMLV)、T7 RNA聚合酶及2条特异性引物等建立TMA扩增体系;通过HCV RNA的扩增曲线的相关性变化,评价不同储存温度对TMA扩增体系的稳定性和重复性的影响;通过扩增一组10倍梯度稀释的HCV RNA体外转录样本,评价TMA体系与RT-PCR的灵敏性差异。收集101份临床诊断为慢性丙型肝炎患者的血清,同时采用TMA试剂和RT-PCR试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用直线相关和回归探讨两种方法检测血清HCV RNA的相关性。结果:成功地建立了TMA扩增体系,该体系在室温下放置24 h,结果影响较大,但在4℃储存6 d,-20℃下储存6个月内扩增效果不受影响,稳定性良好。与湖南圣湘生物技术公司RT-PCR试剂检测结果的比较显示:31份血清标本TMA及RT-PCR均检测到阳性20例,阴性11例,检测一致率为100%。选取其中20例阳性标本进行定量分析,发现两种技术有很好的相关性(r=0.91,P<0.01)。与上海科华公司的RT-PCR试剂检测结果比较,发现在70份血清标本中,TMA检出RNA阳性标本数为34例,阴性标本数为36例,PCR检出RNA阳性标本数为32例,阴性标本数为38例,检测一致率为97.1%,两种检测方法阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中29例PCR检测和TMA检测均有定量结果的血清进行分析,两种技术也有很好的相关性(r=0.96,P<0.01)。结论:TMA检测试剂在-20℃下储存,6个月内稳定性和重复性良好。TMA与RT-PCR均能很好地检出血清中HCV RNA,两种技术有很好的相关性,定量检测有很好的可比性。 展开更多

关键词 转录介导的扩增技术 丙型肝炎 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 丙型肝炎病毒核糖核酸

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转录介导的扩增技术与real-time RT-PCR在人类免疫缺陷病毒检测中的应用

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作者 吴大先 陶淑慧 +3 位作者 刘水平 周杰斌 谭德明 侯周华 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期776-782,共7页

目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚... 目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚合酶及PCR底物等建立TMA扩增体系。通过扩增一组10倍梯度稀释的HIV RNA转录标准品,评价TMA体系的灵敏性。收集60例HIV感染患者的血浆,同时采用TMA试剂与Cobas Amplicor HIV-1 Monitor 1.5版试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用线性回归和Bland-Altman法分析两种技术的相关性和一致性。结果:成功建立了TMA扩增体系,这种技术可以检测低至10 copies/m L的HIV转录标准品。60份HIV感染者血浆样本中,TMA及Cobas均检测到阳性46份,均阴性12份,TMA检测阴性而Cobas检测阳性样本2份,检测一致率为96.7%。两种技术阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中46份TMA检测和Cobas检测均有定量结果的血浆进行线性回归分析,两种技术有非常好的相关性(r=0.997,P<0.001)。Bland-Altman分析显示两种检测方法定量Lg差值平均值为0.02,44份(95.7%)样本在95%的一致性界限内。结论:TMA技术具有高灵敏性潜能。TMA与real-time RT-PCR检测血浆中HIV RNA具有非常好的相关性与一致性。 展开更多

关键词 转录介导的扩增技术 人类免疫缺陷病毒 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 线性回归

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禽肾炎病毒荧光RT-RAA检测方法的建立与应用

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作者 赵俊柯 余丹 +7 位作者 喻华英 尹文巧 张艳芳 谢志勤 李小凤 吴嫒琼 谢芝勋 韦英益 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第3期258-263,共6页

为建立禽肾炎病毒(ANV)的荧光重组酶介导的等温扩增(RT-RAA)快速检测方法,本研究根据ANV ORF 1b基因保守序列设计3对特异性引物和探针,在探针中间分别标记FAM荧光基团、BHQ1淬灭基团。提取ANV的总RNA反转录为cDNA作为模板,以PEGBF/R作... 为建立禽肾炎病毒(ANV)的荧光重组酶介导的等温扩增(RT-RAA)快速检测方法,本研究根据ANV ORF 1b基因保守序列设计3对特异性引物和探针,在探针中间分别标记FAM荧光基团、BHQ1淬灭基团。提取ANV的总RNA反转录为cDNA作为模板,以PEGBF/R作为引物,采用PCR扩增ANV ORF 1b基因保守序列,并克隆于pMD18-T载体中,构建重组质粒标准品pANV-ORF1b并采用双酶切和测序鉴定正确后作为模板,采用矩阵法筛选确定最优的引物和探针组合,并对反应条件进行优化。结果显示:在39℃恒温,引物和探针浓度分别为0.64μmol/L和0.48μmol/L条件下20 min内可实现对目的片段的有效扩增,并且扩增结果可直接观察,由此初步建立了ANV荧光RTRAA检测方法。利用建立的方法检测ANV、鸡星状病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒和禽腺病毒等16种禽类常见病原,结果显示该方法仅能检测到ANV,与其他病原均无交叉反应;以10倍倍比稀释后的重组质粒标准品pANV-ORF1b作为模板,采用本研究建立的荧光RT-RAA方法扩增,分析该方法的敏感性,结果显示对pANV-ORF1b的检测限为1.5×10^(1)拷贝/μL;对3个不同浓度的pANV-ORF1b在同一时间和3个不同时间点利用建立的荧光RT-RAA进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。对200份采自广西南宁不同地区的临床样品采用本实验建立的荧光RT-RAA方法以及RT-PCR和RT-qPCR方法检测。荧光RT-RAA方法检测结果显示:阳性样品为43份(21.5%),阴性样品为157份(78.5%);RT-qPCR检测结果显示,阳性样品为45份(22.5%),阴性样品为155份(77.5%);RT-PCR检测结果显示,阳性样品为38份(19%),阴性样品为162份(81%),荧光RT-RAA检测结果与RT-qPCR和RT-PCR的总符合率分别为95.55%和88.37%。综上所述,本研究建立的ANV荧光RT-RAA检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,适用于ANV的临床大规模检测,为ANV所致疫病的监控提供了有力的技术支持。 展开更多

关键词 禽肾炎病毒 重组酶介导的等温扩增技术 快速检测 荧光法 ORF 1b基因

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实时荧光定量PCR技术在动物遗传育种中的应用

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作者 张海富 籍丁艳 《农业技术与装备》 2012年第23期75-77,共3页

聚合酶链式反应技术（polymerasechainreaction简称PCR）是一项体外基因快速扩增技术。该技术的建立，使定性检测的技术得到改善，达到检测单个靶细胞的水平，以其简便易行、灵敏度高等优点被广泛应用于分子生物学及医学等领域。但其易... 聚合酶链式反应技术（polymerasechainreaction简称PCR）是一项体外基因快速扩增技术。该技术的建立，使定性检测的技术得到改善，达到检测单个靶细胞的水平，以其简便易行、灵敏度高等优点被广泛应用于分子生物学及医学等领域。但其易污染、假阳性及定量不准确等问题也日益突出。而荧光定量PCR技术（FQ—PCR）的出现解决了以上难题，实现了从定性到定量的飞跃。此方法特异性强和可靠性更强，能实现多重反应，且采用完全闭管检测，不需要PCR后处理，有效解决PCR污染问题以及EB对试验人员的伤害； 展开更多

关键词 实时荧光定量PCR技术 动物遗传育种 聚合酶链式反应技术 应用 定性检测 污染问题 分子生物学 扩增技术

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实时荧光PCR检测HBsAg阴性、抗HBc阳性献血者血液中HBV DNA研究 被引量：10

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作者 叶贤林 刘晓红 +3 位作者 马兰 张红 李活 曾劲峰 《中国感染控制杂志》 CAS 2009年第4期241-244,240,共5页

目的对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性、乙型肝炎核心抗体（抗HBc）阳性的献血者血液进行经输血传播乙型肝炎病毒（HBV）的风险评估，为完善HBV血液筛查模式及确保临床用血安全提供依据。方法对献血者血液常规检测阴性的标本进行8×... 目的对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性、乙型肝炎核心抗体（抗HBc）阳性的献血者血液进行经输血传播乙型肝炎病毒（HBV）的风险评估，为完善HBV血液筛查模式及确保临床用血安全提供依据。方法对献血者血液常规检测阴性的标本进行8×45μL汇集，应用实时荧光聚合酶链反应（PCR）进行混样核酸检测HBVDNA。对血液常规筛查和混样核酸检测合格的标本，进行随机乙型肝炎血清学5项标志物的酶联免疫吸附试验（ELISA）。对获得的HBsAg阴性、混样HBVDNA阴性、抗HBc阳性的标本，进一步采用单份样本（720μL）实时荧光PCR法检测并定量分析。结果混样标本共检测12552份，检出HBsAg阴性、HBVDNA阳性标本2份，阳性率为0．02％。随机筛查混样核酸检测阴性标本614份，检出抗HBc阳性标本320份，对此320份标本进行单份核酸检测，检出阳性标本1份，阳性率为0．31％。结论HBsAg阴性、抗HBc阳性献血者血液存在输血传播HBV的风险，应用核酸扩增技术检测血液HBVDNA能大大提高血液安全性。 展开更多

关键词 输血 献血者 核酸扩增技术 实时荧光聚合酶链反应 肝炎病毒 乙型 乙型肝炎核心抗体

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产气荚膜梭菌实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法的建立和比较 被引量：15

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作者 刘立兵 李睿文 +4 位作者 陈志敏 王金凤 孙晓霞 袁万哲 王建昌 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第4期268-272,共5页

根据产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)高度保守的plc基因,设计特异性引物和探针,建立产气荚膜梭菌的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光聚合酶重组酶扩增(recombinase polymerase amplification,R... 根据产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)高度保守的plc基因,设计特异性引物和探针,建立产气荚膜梭菌的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光聚合酶重组酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法。特异性分析结果表明,建立的两种检测方法特异性强,仅对产气荚膜梭菌有特异性扩增,对其他细菌均无扩增;两种方法的检出限均为1.3 pg/μL。在人工污染模拟样品的检测中,两种方法的检出限均为1.0×102 CFU/mL;实时荧光RPA需要3~13 min即可实现对所有阳性样品的检测,而实时荧光PCR则需要24~46 min(Ct值为17.45~33.65)。实时荧光RPA方法在检测时间、操作方便性和仪器便携性方面,明显优于实时荧光PCR方法。本研究建立的实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法特异性强、灵敏性高、操作方便,为实验设备装备较差的基层检测实验室和疫情突发现场产气荚膜梭菌的快速检测提供有效技术手段。 展开更多

关键词 产气荚膜梭菌 plc基因 实时荧光聚合酶重组酶扩增 实时荧光聚合酶链式反应

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双重荧光RT-ERA技术快速检测贝类食品中诺如病毒 被引量：5

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作者 吴占文 王帅 +6 位作者 康婕 李涛 李红娜 蔡杰 张昊 杨艳歌 袁飞 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2023年第18期355-363,共9页

目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别... 目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别将GI、GII NoV参考靶序列克隆到带有T7启动子的载体中,通过体外转录的方式获得高纯度NoV RNA参考样品。以设计的MS2噬菌体引物探针,与实验室前期筛选的GI、GII NoV引物探针进行双重荧光RT-ERA实验,并对反应体系和反应程序进行优化,分析方法的灵敏度。最后,采用建立的方法开展真实样本检测,以GB 4789.42-2016《食品微生物学检验诺如病毒检验》为参比方法进行检测结果对比,确定方法的准确性和可行性。结果:建立MS2与GI、MS2与GII两组双重荧光RT-ERA检测方法,最佳引物及探针体积分别为4.1μL与1.8μL,检测时间可缩短至10 min左右,且最低可检出102拷贝/μL的NoV核酸样品。应用所建立的方法对29份真实样品进行检测,检测结果与GB 4789.42-2016一致。结论:本研究建立的双重荧光RT-ERA检测方法可实现对MS2、GI和GII NoV的同时检测,且灵敏度高、准确性强,为今后NoV现场快速检测提供一定基础。 展开更多

关键词 诺如病毒 逆转录-酶促重组等温扩增技术 双重荧光 快速检测 贝类

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梨火疫病菌的RPA快速检测技术的研发 被引量：2

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作者 蒲姝旸 张瑾逸 +4 位作者 暴晓阳 孟青青 田茜 蔡璐璐 赵文军 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期242-249,282,共9页

梨火疫病菌Erwinia amylovora是我国进境植物检疫性有害生物,主要侵染梨、苹果、山楂、海棠等多种蔷薇科植物引起梨火疫病。该病自1780年在美国被发现以来,已经传播到世界多个国家,对我国的果树生产也构成一定的威胁。严格植物检疫是全... 梨火疫病菌Erwinia amylovora是我国进境植物检疫性有害生物,主要侵染梨、苹果、山楂、海棠等多种蔷薇科植物引起梨火疫病。该病自1780年在美国被发现以来,已经传播到世界多个国家,对我国的果树生产也构成一定的威胁。严格植物检疫是全球防控梨火疫病菌扩散危害的重要方法之一,目前我国植物检疫部门主要从实验室分离鉴定、分子检测和田间症状识别及快速检测方面开展工作。本研究基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术和E.amylovora 16S-23S ITS区间的保守序列设计的引物和探针,建立了实时荧光RPA和侧流层析试纸条RPA两种检测方法。经测试,在39℃条件下,这两种检测方法都具有良好的特异性,分别能在20 min和10 min内完成扩增。实时荧光RPA对E.amylovora菌株DNA的检测阈值为1.38×10^(-2)ng/μL;侧流层析试纸条RPA对E.amylovora菌悬液和DNA的检测阈值分别为10^(4)cfu/mL和1.38×10^(-3)ng/μL。侧流层析试纸条RPA体系因反应快速、读取结果方便、不需要复杂仪器操作可以满足现场快速检测的需求。 展开更多

关键词 梨火疫病 快速检测 重组酶聚合酶扩增(RPA) 实时荧光型RPA 侧流层析试纸条型RPA

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犬瘟热病毒实时荧光RT-RPA检测方法的建立及应用 被引量：4

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作者 张启龙 傅彩霞 +6 位作者 张玮 高晓龙 王林 程敏姮 郑雪莹 刘海莹 周德刚 《动物医学进展》 北大核心 2020年第11期19-23,共5页

为建立犬瘟热病毒(CDV)临床快速检测方法,针对CDV保守N基因依据重组酶聚合酶等温扩增(RPA)引物设计原理进行RPA引物探针设计,通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和临床样品检测,建立了CDV实时荧光RT-RPA检测方法。结果显示,反应... 为建立犬瘟热病毒(CDV)临床快速检测方法,针对CDV保守N基因依据重组酶聚合酶等温扩增(RPA)引物设计原理进行RPA引物探针设计,通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和临床样品检测,建立了CDV实时荧光RT-RPA检测方法。结果显示,反应体系中M-MLV反转录酶最适浓度为4 U/μL,所建CDV实时荧光RT-RPA检测方法特异性较好,敏感性最低可检测到5.68×102 copies/μL,高于国标RT-PCR(GB/T 27532-2011)检测方法。建立的CDV实时荧光RT-RPA检测方法具有较高的敏感性和特异性、操作简便、20 min内判定结果,可用于临床犬瘟热快速诊断,对犬瘟热的防控具有重要意义。 展开更多

关键词 犬瘟热病毒 实时荧光 反转录-重组酶聚合酶等温扩增 检测

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羊口疮病毒分子生物学检测方法研究进展 被引量：1

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作者 刘庆伦 孟继彬 +4 位作者 张淑芹 刘冰 蒋福涛 孙百栋 刘守广 《中国动物检疫》 2025年第1期81-88,共8页

羊口疮是一种由羊口疮病毒(ORFV)引起的高度传染性疫病,给养羊业造成了严重经济损失,而及时准确检测病原体有利于减少因其造成的经济损失。现已建立了多种ORFV检测方法,其中分子生物学方法检测准确、灵敏度高、特异性强,可大幅提升ORFV... 羊口疮是一种由羊口疮病毒(ORFV)引起的高度传染性疫病,给养羊业造成了严重经济损失,而及时准确检测病原体有利于减少因其造成的经济损失。现已建立了多种ORFV检测方法,其中分子生物学方法检测准确、灵敏度高、特异性强,可大幅提升ORFV检测能力,在防控羊口疮病发生和流行中发挥了重要作用。常规聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)、叠氮溴化丙啶结合PCR(PMA-PCR)以及环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等分子生物学方法在检测OFRV方面各有优势,但也都存在一定局限性,实际应用时要结合各自的条件和需求以及检测目的因地制宜地选择。随着现代分子生物技术的发展,一些新技术如数字液滴PCR(ddPCR)和第三代测序(TGS)等也将被探索用于ORFV检测研究。本文对ORFV分子生物学检测技术研究进展进行综述,以期为该病原快速检测方法的研制和检测标准制定提供借鉴。 展开更多

关键词 羊口疮病毒 聚合酶链式反应 实时荧光定量PCR 环介导等温扩增 重组酶聚合酶扩增

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