猪肺炎支原体实时荧光重组酶介导的等温扩增快速检测方法的建立和应用

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作者 康浩然 黄雨薇 +7 位作者 宋程 高鹏 张永宁 周磊 盖新娜 韩军 郭鑫 杨汉春 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第9期1-9,共9页

猪肺炎支原体(Mhp)是引起猪支原体肺炎(MPS)的病原,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。早期快速诊断和实时监测对该病的防控至关重要,目前常用的核酸检测方法难以满足临床上即时检测(POCT)的实际需求。本试验针对Mhp细胞膜表面脂蛋白基... 猪肺炎支原体(Mhp)是引起猪支原体肺炎(MPS)的病原,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。早期快速诊断和实时监测对该病的防控至关重要,目前常用的核酸检测方法难以满足临床上即时检测(POCT)的实际需求。本试验针对Mhp细胞膜表面脂蛋白基因p46,通过序列比对和系统性的引物筛选设计了exo探针及其对应的重组酶介导的等温扩增(RAA)技术引物对,建立了Mhp实时荧光(real-time)RAA快速检测方法;随后,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检测,并使用该方法和实时荧光定量PCR(qPCR)对比检测临床样本。结果显示,该方法与猪链球菌、肺炎克雷伯氏菌、猪格拉瑟氏菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌均无交叉反应,特异性好;Mhp real-time RAA及其可视化方法的检测敏感性分别为18和29 copies/μL(95%置信区间),敏感性强;组内和组间重复性试验变异系数均小于8.0%,重复性好;对108份猪临床样本的检测结果显示,该方法及其可视化方法与Mhp qPCR方法的符合率分别为98.15%和99.07%。本试验所建立Mhp real-time RAA方法可以通过便捷式蓝光仪器实现结果的可视化,更适用于资源匮乏的诊断实验室和基层现场,为MPS的防控提供了技术手段。 展开更多

关键词 重组酶介导的等温扩增技术 猪肺炎支原体 实时荧光定量PCR 快速检测

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实时重组酶辅助扩增技术快速检测狗源性成分

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作者 刘明明 颜海燕 +3 位作者 周朝旭 叶语桦 李志刚 肖昭竞 《肉类研究》 北大核心 2025年第4期24-29,共6页

为快速检测狗源性成分,针对cytb基因保守区域设计3对重组酶辅助扩增(recombinaseaided amplification,RAA)引物和1条核酸外切酶(exonuclease,exo)探针,通过引物和探针浓度的筛选,构建一种实时RAA(real-time RAA,Rt-RAA)方法。利用交叉... 为快速检测狗源性成分,针对cytb基因保守区域设计3对重组酶辅助扩增(recombinaseaided amplification,RAA)引物和1条核酸外切酶(exonuclease,exo)探针,通过引物和探针浓度的筛选,构建一种实时RAA(real-time RAA,Rt-RAA)方法。利用交叉反应和重复性实验对该检测方法的特异性和稳定性进行评估,并将Rt-RAA方法灵敏度以及对混合模拟样品和市售样品的检测结果与相应的国标检测方法进行对比。结果表明,Rt-RAA检测方法特异性强、稳定性好,在30 min内可检测到目的序列,对狗源性成分的检出限为0.2%,明显优于实时荧光聚合酶链式反应检测方法,应用Rt-RAA方法与国标方法对模拟样品和市售实际样品检测结果完全一致。因此,本研究建立的Rt-RAA检测方法适用于狗源性成分的检测,为肉源性成分鉴定提供了另一种快速、准确的新方法。 展开更多

关键词 实时荧光重组酶辅助扩增技术 狗源性成分 肉制品掺假

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塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术(RPA)实时荧光检测方法的建立 被引量：18

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作者 樊晓旭 哈登楚日亚 +7 位作者 王英丽 王姣 刘春菊 迟田英 赵永刚 张志诚 吴晓东 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2017年第8期81-86,共6页

塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)可感染猪,引起类似口蹄疫病毒感染造成的水疱性病变,新生仔猪病死率达30%~70%。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对SVV 3D基因设计了引物和探针,并进行筛选、反应条件优化以及敏感性、特... 塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)可感染猪,引起类似口蹄疫病毒感染造成的水疱性病变,新生仔猪病死率达30%~70%。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对SVV 3D基因设计了引物和探针,并进行筛选、反应条件优化以及敏感性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,本方法在40℃、10 min内检测的最低浓度为28拷贝/μL;与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应;通过3次重复试验检测2.8×10~6~2.8×10~1拷贝/μL的6个稀释度样品,在荧光强度达1500 mV所需时间变异系数范围在2.44%~14.95%。该等温、快速扩增方法为猪群出现水疱性疾病的鉴别诊断提供了技术支持,对及时采取适当防控措施具有重要意义。 展开更多

关键词 塞尼卡谷病毒 实时 荧光 重组酶聚合酶扩增

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非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法的建立 被引量：23

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作者 哈登楚日亚 樊晓旭 +6 位作者 赵永刚 王淑娟 张志诚 戈胜强 李林 吴晓东 王志亮 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第11期3270-3277,共8页

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对ASFVB646L(p72)基因设计... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对ASFVB646L(p72)基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×106至5.5×100拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) 实时荧光重组酶聚合酶扩增(rpa) 灵敏性 特异性 重复性

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利用双重实时荧光重组酶辅助扩增技术快速检测肉制品中鼠源性成分 被引量：1

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作者 刘明明 周朝旭 +2 位作者 颜海燕 田碧英 李根容 《肉类研究》 北大核心 2024年第9期15-20,共6页

为实现肉制品中大鼠和小鼠源性成分的同步检测,基于实时荧光重组酶辅助扩增(real-time recombinase-aided amplification,Rt-RAA)技术,以大鼠COX3基因和小鼠16S rRNA基因序列保守区域为靶标,分别设计相应的Rt-RAA引物和探针,通过反应参... 为实现肉制品中大鼠和小鼠源性成分的同步检测,基于实时荧光重组酶辅助扩增(real-time recombinase-aided amplification,Rt-RAA)技术,以大鼠COX3基因和小鼠16S rRNA基因序列保守区域为靶标,分别设计相应的Rt-RAA引物和探针,通过反应参数的优化确定最佳双重Rt-RAA检测反应条件。进一步对建立的双重Rt-RAA检测方法进行特异性、灵敏度及稳定性评估,并应用该方法对模拟市售肉制品进行检测。结果表明,所建立的双重RtRAA检测方法特异性强、稳定性好,大鼠和小鼠源性成分的检出限分别为0.5%和0.2%,同步检测2种源性成分检出限为0.5%,同步检测混合模拟市售样品检出限仍低至0.5%,双重Rt-RAA与实时荧光定量聚合酶链式反应对市售样品和模拟样品检测结果高度一致。因此,本研究建立的双重Rt-RAA检测方法适用于大鼠和小鼠源性成分的检测,为肉制品掺假检测提供了一种快捷、高效及准确的新方法。 展开更多

关键词 大鼠 小鼠 肉制品 实时荧光重组酶辅助扩增技术 肉制品掺假

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柑桔黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测 被引量：1

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作者 段玉 马志敏 +3 位作者 许建建 宾羽 宋震 周常勇 《中国南方果树》 北大核心 2021年第5期11-15,20,共6页

为了建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)快速检测体系,丰富柑桔黄龙病的高效简便检测方法,以黄龙病菌株psy62全基因组中的单拷贝tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB基因簇序列和5拷贝核糖核苷酸还原... 为了建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)快速检测体系,丰富柑桔黄龙病的高效简便检测方法,以黄龙病菌株psy62全基因组中的单拷贝tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB基因簇序列和5拷贝核糖核苷酸还原酶β亚基基因(nrdB)序列设计并筛选特异性引物,经灵敏度比较和检测特异性验证,建立该病的RPA检测体系,并经PCR、RPA和实时荧光PCR对87份柑桔样品的黄龙病菌进行对比检测,验证RPA检测体系的适用性。结果表明,建立的黄龙病菌RPA检测方法能特异性检测柑桔黄龙病;灵敏度与实时荧光PCR相当,是PCR的100倍;扩增过程只需20 min,大幅提高检测效率;对田间疑似柑桔黄龙病的送检样品检测结果与实时荧光PCR一致,比PCR的检出率高。 展开更多

关键词 柑桔黄龙病 重组酶聚合酶恒温扩增(rpa) 快速检测

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酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用 被引量：7

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作者 胡海洋 应婉琴 +3 位作者 何军 吕芷贤 谢小平 邓仲良 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期264-270,共7页

利用酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术建立快速检测肺炎支原体的实时荧光检测方法。针对肺炎支原体P1基因设计特异性引物和探针,优化反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。ERA实时荧光法... 利用酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术建立快速检测肺炎支原体的实时荧光检测方法。针对肺炎支原体P1基因设计特异性引物和探针,优化反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。ERA实时荧光法在25-40℃均具有扩增能力,在35℃条件下对肺炎支原体的扩增效果最好,20 min内可完成扩增;该法对肺炎支原体的检出限为10^(3) copies/μL;并对其他6种呼吸道病原体进行检测,均无扩增曲线产生,有较好的特异性;以荧光定量PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法对34份临床样本的检测结果的诊断敏感度为96.15%、特异度为100%、阳性预测值为100%、阴性预测值为88.89%。本研究构建的ERA实时荧光法可以快速简单、灵敏和特异地检测出肺炎支原体,满足现场检测的需求。 展开更多

关键词 酶促重组等温扩增技术 实时荧光检测 肺炎支原体

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建立仙台病毒实时荧光重组酶等温扩增检测方法 被引量：2

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作者 冯丽萍 熊炜 +1 位作者 高诚 魏晓锋 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第12期94-97,121,共5页

目的国标标准规定清洁级和SPF级小鼠必须排除仙台病毒(Sendai virus,SeV)。为了提升效率,简化操作步骤,本研究建立了一种新型分子检测方法——实时荧光重组酶等温扩增技术(real-time RPA)用于检测SeV。方法针对SeV融合蛋白编码基因的保... 目的国标标准规定清洁级和SPF级小鼠必须排除仙台病毒(Sendai virus,SeV)。为了提升效率,简化操作步骤,本研究建立了一种新型分子检测方法——实时荧光重组酶等温扩增技术(real-time RPA)用于检测SeV。方法针对SeV融合蛋白编码基因的保守序列,设计特异性扩增引物及探针并建立检测方法,并评价该检测方法的特异性、敏感性、稳定性和可靠性。最后将该检测方法和团标PCR方法进行优势比较。结果该方法具有很好的特异性,与小鼠肝炎病毒等六种病原微生物无交叉反应。其敏感性、稳定性和可靠性均可,并能够在25 min内完成,远远快于PCR方法。结论本研究建立的SeV实时荧光RPA是一种操作简单,高效直观且特异性好的检测方法。 展开更多

关键词 实时荧光重组酶等温扩增 仙台病毒 快速可视化监测

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黄颡鱼实时荧光RPA及侧向流RPA试纸条快速现场鉴定方法的建立与应用

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作者 林玉 张旻 +11 位作者 王娜 何舜平 张辉 唐永凯 方成池 景宏丽 张浪 沙航 段志强 王宽 吕继洲 吴绍强 《水生生物学报》 北大核心 2025年第4期120-128,共9页

研究以黄颡鱼为目标对象,基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等温扩增技术,开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先,... 研究以黄颡鱼为目标对象,基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等温扩增技术,开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先,通过对黄颡鱼及其近缘物种的鱼类线粒体基因组序列进行对比分析,针对COI基因保守区域,设计了特异性探针和引物。测试结果显示,在37℃条件下,实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条都具有良好的特异性。实时荧光型RPA方法能够在20min内完成黄颡鱼DNA的检测,且最低检测限可以达到102拷贝数/反应;而侧向流RPA试纸条的操作更加便捷,能够在10min内可完成对102低拷贝数的黄颡鱼DNA的扩增和鉴定。应用这两种RPA检测技术对149份长江流域常见鱼类进行现场检测,两种方法均显示出较高的准确性(准确率100%)。因此,研究开发的两种用于检测黄颡鱼的实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条方法,拥有操作简便、结果直观、准确率高、不依赖实验室仪器设备等优势,具有良好的现场快速检测应用前景。此外,其克服了形态学物种鉴定专业门槛高、难以鉴定残破组织样品的问题,检测靶标可跨越卵、鱼苗、成鱼等全生命周期,为水产品监管执法提供技术手段。 展开更多

关键词 快速物种鉴定 重组酶聚合酶扩增 实时荧光型rpa 侧向流rpa试纸条 黄颡鱼

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基于RPA辅助增强荧光偏振的沙门氏菌检测

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作者 薛鹏鹏 陈伟 +2 位作者 徐建国 涂佳 屈玮 《食品与机械》 北大核心 2025年第6期44-50,共7页

[目的]提出一种新型荧光偏振(FP)检测策略,通过整合重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,实现对沙门氏菌(Salmonella)的高灵敏度检测。[方法]该检测机制依赖于靶标DNA与特异性引物的同源序列识别:当沙门氏菌靶标存在时,引物与靶DNA结合并触发链... [目的]提出一种新型荧光偏振(FP)检测策略,通过整合重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,实现对沙门氏菌(Salmonella)的高灵敏度检测。[方法]该检测机制依赖于靶标DNA与特异性引物的同源序列识别:当沙门氏菌靶标存在时,引物与靶DNA结合并触发链置换反应,进而启动DNA扩增过程。为提高检测灵敏度,系统采用两项关键设计:在引物5'端修饰6-羧基荧光素(6-FAM)作为荧光报告基团;引入核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)选择性水解未结合的引物。[结果]在RPA扩增过程中,由于扩增产物的相对分子质量显著增加,6-FAM标记的DNA复合物的旋转自由度受到限制,导致荧光偏振信号显著增强。经条件优化后,该方法对沙门氏菌的检测限可达11 CFU/mL,且表现出优异的特异性。[结论]该方法可高效检测沙门氏菌,其模块化设计原理还可拓展应用于其他食源性病原体的快速诊断。 展开更多

关键词 沙门氏菌 重组酶聚合酶扩增(rpa) 引物修饰 荧光偏振 定量检测

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猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增快速诊断方法的建立和应用 被引量：9

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作者 张森豪 王雪莹 +12 位作者 蔡李萌 解伟纯 匡虹迪 王晓娜 李佳璇 崔文 姜艳平 周晗 单智夫 王丽 乔薪瑗 李一经 唐丽杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2498-2508,共11页

旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶... 旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物,优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)反应体系,检测了反应的特异性和敏感性,确定了反应的最佳温度和时间,通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为102 copies·μL^(-1),且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述,通过对RPA反应条件的摸索与优化,成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法,两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性,对仪器、场地和检测环境的要求更低,为今后PEDV的临床诊断及快速检测提供了更多的选择和更有效的技术支持。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 重组酶聚合酶扩增(rpa) 侧流层析(LFD) 快速诊断方法

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基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测鲤疱疹病毒2型的方法研究

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作者 韩进刚 王菁 +3 位作者 徐赟霞 刘群 罗璋 冯守明 《河北渔业》 2022年第6期29-34,共6页

为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法... 为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法,并将样品简易处理方法运用于该方法对实验室保存的鲫组织样品进行检测。结果显示,该RPA-LFD检测方法最佳反应条件为40℃20 min,最低检出限为6×10^(0) copies/μL,与荧光PCR的灵敏度相当,与其他鲤疱疹病毒等无交叉反应;运用该方法并结合待检样品简易处理方法(直接RPA法)对50份鲫组织样品进行处理和检测,其结果与运用国家标准(GB/T 36194-2018)中荧光PCR方法检测结果一致。本文建立的RPA-LFD检测方法具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、特异性强的优点,适于在水产养殖场和基层部门用于鲤疱疹病毒病的辅助诊断和监测。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒2型(CyHV-2) 重组酶聚合酶扩增(rpa) 侧流层析试剂条(LFD) 直接rpa法

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开发RPA⁃Cas12a荧光检测法用于快速可靠检测人类博卡病毒1型

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《中国比较医学杂志》 北大核心 2025年第9期49-49,共1页

人类博卡病毒1型(HBoV1)被视为一种主要影响6~24月龄婴儿的重要病原体,然而,在资源有限地区,通过快速且经济的现场诊断手段来预防HBoV1早期感染者的病毒传播仍颇具挑战。在此,提出了一种新型的更快、成本更低且可靠的HBoV1检测方法,该... 人类博卡病毒1型(HBoV1)被视为一种主要影响6~24月龄婴儿的重要病原体,然而,在资源有限地区,通过快速且经济的现场诊断手段来预防HBoV1早期感染者的病毒传播仍颇具挑战。在此,提出了一种新型的更快、成本更低且可靠的HBoV1检测方法,该方法将重组酶聚合酶扩增(RPA)检测技术与CRISPR/Cas12a系统相结合,命名为RPA⁃Cas12a荧光检测法。 展开更多

关键词 rpa-Cas12a荧光检测法 HBoV1 重组酶聚合酶扩增

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猪流行性腹泻病毒实时荧光RPA等温检测方法的建立 被引量：11

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作者 吕继洲 范燕茹 +2 位作者 冯春燕 袁向芬 吴绍强 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第12期3434-3439,共6页

为建立一种简单、快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)分子检测方法,本研究基于PEDV病毒M基因保守序列,设计一系列扩增引物及其荧光探针,以包含PEDV病毒M基因片段的pUC57质粒为模板,同时以包含猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病... 为建立一种简单、快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)分子检测方法,本研究基于PEDV病毒M基因保守序列,设计一系列扩增引物及其荧光探针,以包含PEDV病毒M基因片段的pUC57质粒为模板,同时以包含猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)及古典猪瘟病毒(CSFV)等病毒膜蛋白或核衣壳蛋白基因序列的质粒作为对照,建立了一种PEDV实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法,测定了方法的特异性与敏感性。结果表明,该实时荧光RPA方法可在39℃恒温反应20min特异性扩增PEDV病毒M基因,与TGEV、PRRSV等对照病毒基因无交叉反应,其检测限为10拷贝/μL。应用该实时荧光RPA方法可有效检测出血浆及血浆蛋白粉中的PEDV核酸。本研究建立的实时荧光RPA检测方法简单、快速、灵敏度高,可为PEDV的检测防控提供一种新的、可靠的技术支持。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 分子检测 重组酶聚合酶扩增(rpa) 等温扩增

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ERA实时荧光法快速检测乙肝病毒的建立与应用 被引量：1

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作者 翁兴墉 邹林涛 +3 位作者 周璇 唐红花 何军 邓仲良 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期112-117,共6页

基于酶促重组等温扩增(ERA)技术构建一种快速检测乙肝病毒的实时荧光检测方法。根据乙肝病毒聚合酶编码区(P区)保守序列设计引物和探针,对引物、温度、荧光探针浓度等反应条件进行优化,建立ERA实时荧光法最佳反应体系,再对其敏感性、特... 基于酶促重组等温扩增(ERA)技术构建一种快速检测乙肝病毒的实时荧光检测方法。根据乙肝病毒聚合酶编码区(P区)保守序列设计引物和探针,对引物、温度、荧光探针浓度等反应条件进行优化,建立ERA实时荧光法最佳反应体系,再对其敏感性、特异性、抗干扰能力、临床样本检出效果进行验证。结果显示:ERA实时荧光法在42℃、20 min内可完成对乙肝病毒的检测,最低检出限为102 copies/μL;除乙肝病毒外,其他4种病毒(甲肝病毒、丙肝病毒、EB病毒、巨细胞病毒)均未产生荧光扩增曲线,具有良好的特异性和抗干扰能力;以实时荧光PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法检测58份乙肝病毒临床样本的灵敏度为97.37%、特异度为100%、阴性预测值为95.24%、阳性预测值为100%、Kappa值为0.96。成功建立了一种简单、快速、灵敏、特异、低成本的乙肝病毒早期检测方法,满足乙肝病毒快速检测的需要。 展开更多

关键词 酶促重组等温扩增技术 快速检测 乙肝病毒 ERA实时荧光法 早期诊断

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产气荚膜梭菌实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法的建立和比较 被引量：15

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作者 刘立兵 李睿文 +4 位作者 陈志敏 王金凤 孙晓霞 袁万哲 王建昌 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第4期268-272,共5页

根据产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)高度保守的plc基因,设计特异性引物和探针,建立产气荚膜梭菌的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光聚合酶重组酶扩增(recombinase polymerase amplification,R... 根据产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)高度保守的plc基因,设计特异性引物和探针,建立产气荚膜梭菌的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光聚合酶重组酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法。特异性分析结果表明,建立的两种检测方法特异性强,仅对产气荚膜梭菌有特异性扩增,对其他细菌均无扩增;两种方法的检出限均为1.3 pg/μL。在人工污染模拟样品的检测中,两种方法的检出限均为1.0×102 CFU/mL;实时荧光RPA需要3~13 min即可实现对所有阳性样品的检测,而实时荧光PCR则需要24~46 min(Ct值为17.45~33.65)。实时荧光RPA方法在检测时间、操作方便性和仪器便携性方面,明显优于实时荧光PCR方法。本研究建立的实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法特异性强、灵敏性高、操作方便,为实验设备装备较差的基层检测实验室和疫情突发现场产气荚膜梭菌的快速检测提供有效技术手段。 展开更多

关键词 产气荚膜梭菌 plc基因 实时荧光聚合酶重组酶扩增 实时荧光聚合酶链式反应

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新型番鸭细小病毒荧光RPA恒温检测方法的建立

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作者 陈炜 梁齐章 +7 位作者 张佳雪 焦文龙 林永强 刘荣昌 傅秋玲 傅光华 朱婷 黄瑜 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1044-1050,共7页

【目的】建立新型番鸭细小病毒(New-genotype muscovy duck parvovirus,N-MDPV)荧光RPA恒温检测方法,为基层提供可视化快速检测技术手段。【方法】以N-MDPV的VP3基因保守片段为靶点,使用EXO荧光探针特定结合VP3基因保守片段,设计特异的... 【目的】建立新型番鸭细小病毒(New-genotype muscovy duck parvovirus,N-MDPV)荧光RPA恒温检测方法,为基层提供可视化快速检测技术手段。【方法】以N-MDPV的VP3基因保守片段为靶点,使用EXO荧光探针特定结合VP3基因保守片段,设计特异的RPA扩增引物并利用重组酶聚合酶扩增技术扩增目的基因,从而建立一种荧光RPA恒温检测N-MDPV的方法,确定反应体系的最佳反应时间和温度,分析该方法特异性和灵敏性;对收集的病料进行核酸检测,并与传统PCR和病毒分离鉴定方法检测结果进行比较。【结果】建立的荧光RPA恒温检测方法最佳反应温度为39℃,最佳反应时间为30 min;灵敏性高,最低核酸检测限度可达10 fg·μL^(−1);对新型番鸭细小病毒核酸进行特异性扩增,结果显示对鸭腺病毒3型(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)、禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)、鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)、鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)、鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)、鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)和新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)的核酸均未有发生交叉反应,特异性良好。利用本研究建立的RPA快检方法、传统PCR方法以及病毒分离鉴定方法对收集的38份鸭组织病料核酸样品进行检测,结果显示阳性率分别为36.8%(14/38)、36.8%(14/38)和31.6%(12/38);RPA检测后呈阳性的样品经PCR方法检测与病毒分离鉴定方法检测均呈现阳性,阳性符合率为100%。【结论】该方法可以很好地应用于缺乏相应检测设备的基层进行新型番鸭细小病毒的大规模临床样本检测,为新型番鸭细小病毒的可视化快速检测提供技术手段。 展开更多

关键词 新型番鸭细小病毒 rpa恒温检测 重组酶聚合酶扩增技术

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基于RPA-CRISPR/Cas12a的杰克贝尔氏粉蚧可视化快速检测体系建立 被引量：1

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作者 陈燕婷 史梦竹 +4 位作者 胡美玲 陈彦 杨秀娟 赵建伟 李建宇 《昆虫学报》 北大核心 2025年第6期830-839,共10页

【目的】本研究旨在利用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)-CRISPR/Cas12a技术建立一套对杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcus jackbeardsleyi进行快速、灵敏、便捷和可视化的荧光检测和侧向流层析检测(lateral f... 【目的】本研究旨在利用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)-CRISPR/Cas12a技术建立一套对杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcus jackbeardsleyi进行快速、灵敏、便捷和可视化的荧光检测和侧向流层析检测(lateral flow assay)体系,以实现在田间或者口岸等资源受限场所的现场实时检测。【方法】基于杰克贝尔氏粉蚧28S rDNA基因序列设计RPA特异性引物和crRNA,分别对杰克贝尔氏粉蚧与其他9种粉蚧(木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus、石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani、扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis、柑橘臀纹粉蚧Planococcus citri、南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacinus、新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes、大洋臀纹粉蚧Planococcus minor、柑橘棘粉蚧Pseudococcus cryptus和奥德曼粉蚧Pseudococcus odermatti)进行RPA和CRISPR/Cas12a检测,验证该体系的特异性。对RPA-CRISPR/Cas12a检测体系进行条件优化,包括RPA反应时间、Cas12a和crRNA的浓度比及其浓度、荧光报告分子FQ Reporter的浓度、试纸条报告分子LF Reporter的浓度以及CRISPR/Cas12a体系反应时间,筛选获得最佳检测体系。【结果】利用设计的RPA特异性引物的RPA体系可扩增出一条201 bp的杰克贝尔氏粉蚧28S rDNA基因片段,结合CRISPR/Cas12a反应体系,可特异性地将杰克贝尔氏粉蚧与其他9种粉蚧区分开,并呈现可视化结果。通过条件优化建立的对杰克贝尔氏粉蚧的最适RPA-CRISPR/Cas12a检测体系中,RPA反应时间为20 min,Cas12a和crRNA浓度比为1∶1且在体系中的浓度均为50 nmol/L,LF Reporter浓度为500 nmol/L,LF Reporter浓度为800 nmol/L,荧光检测体系和侧向流层析检测体系的反应时间分别为5和20 min。【结论】本研究建立了一套杰克贝尔氏粉蚧RPA-CRISPR/Cas12a检测体系,具有高特异性、快速(25~40 min)、不依赖仪器设备且结果可视化的优点。该检测体系在入侵粉蚧的早期识别和现场检测具有重要的应用价值,为制定合理的管理策略提供了指导。 展开更多

关键词 杰克贝尔氏粉蚧 重组酶聚合酶扩增 CRISPR/Cas12a检测 荧光检测 侧向流层析检测

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狂犬病病毒实时荧光RT-RPA等温检测方法的建立 被引量：3

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作者 谭理琦 郑晓聪 +2 位作者 王翠萍 李汶松 秦智锋 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第5期44-47,I0002,共5页

为了建立一种灵敏、特异、快捷的实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)检测狂犬病病毒的方法,依据狂犬病病毒不分节段单股负链中N基因相对保守的核苷酸序列,设计了4条引物及1条探针,筛选出一套可用于RPA引物与探针组合,建立了狂犬病病毒的荧光... 为了建立一种灵敏、特异、快捷的实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)检测狂犬病病毒的方法,依据狂犬病病毒不分节段单股负链中N基因相对保守的核苷酸序列,设计了4条引物及1条探针,筛选出一套可用于RPA引物与探针组合,建立了狂犬病病毒的荧光RT-RPA检测方法,测试了该方法灵敏度和特异性,并进行了临床验证。结果显示,本研究建立的RPA方法在39℃恒温反应仅需20 min,能够特异的检测狂犬病病毒,最低检测限为1.83×101 Copies/μL,临床样品测试与标准方法结果一致。表明本研究建立的检测狂犬病病毒的荧光RT-RPA方法具有特异,灵敏,快速,简便的特点,适用于现场检测以及在基层实验室推广应用。 展开更多

关键词 重组酶聚合酶扩增技术(rpa) 狂犬病病毒(RV) 检测方法

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双重RT-RPA法快速检测沙门氏菌及其1类整合酶基因 被引量：7

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作者 程辉 梁奕 +3 位作者 俞圣韬 叶仲杜 蒋晗 朱诚 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第4期661-668,共8页

以重组酶聚合酶扩增法(recombinase polymerase amplification, RPA)为技术基础,建立了一种能单管同时快速鉴定沙门氏菌及其耐药相关1类整合酶基因的双重荧光定量重组酶聚合酶扩增(duplex real-time recombinase polymerase amplificati... 以重组酶聚合酶扩增法(recombinase polymerase amplification, RPA)为技术基础,建立了一种能单管同时快速鉴定沙门氏菌及其耐药相关1类整合酶基因的双重荧光定量重组酶聚合酶扩增(duplex real-time recombinase polymerase amplification, RT-RPA)方法。该方法以沙门氏菌特异毒力基因fimY和细菌耐药相关1类整合酶基因intI1为靶标序列,设计特异性RPA引物与exo探针,建立双重RT-RPA方法。结果显示,在fimY引物终浓度320 nmol·L^(-1),intI1引物终浓度400 nmol·L^(-1),fimY探针终浓度60 nmol·L^(-1),intI1探针终浓度100 nmol·L^(-1),反应温度37℃,反应20 min时,双重RT-RPA扩增效率最高,且特异性好。灵敏度试验显示,沙门氏菌检测灵敏度为1.29×10~1 CFU·mL^(-1),intI1检测灵敏度为1.60×10~1 CFU·mL^(-1)。实际样品检测试验中,前期从生猪养殖场、屠宰场、超市和农贸市场筛选到61株沙门氏菌(2株携带intI1基因)、555株大肠埃希菌(均携带intI1基因),用建立的双重RT-RPA方法对上述菌株进行检测,可以同时鉴定出沙门氏菌及intI1基因。该方法与传统培养方法和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)法相比,具有特异性强、灵敏度高、速度快(检测时间20 min)等优点,为快速鉴定携带耐药相关整合酶基因intI1的沙门氏菌提供了准确有效的方法,可为耐药有害微生物的快速鉴定奠定基础。 展开更多

关键词 双重荧光定量重组酶聚合酶扩增 快速检测 沙门氏菌 1类整合酶基因

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