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基于SYBR GreenⅡ的BVDV NS3基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：2
1
作者 李阳 张世勋 +4 位作者 赫鸣睿 刘珊珊 岳山 刘宇 朱战波 《黑龙江八一农垦大学学报》 2025年第2期23-31,共9页
为了建立基于SYBR GreenⅡ的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,设计并筛选了BVDV NS3基因的qRT-PCR引物,建立了BVDV NS3 qRT-PCR检测方法,并利用CFX96和猪警-2000 qRT-PCR仪检测了临床牛血清样本。结果显... 为了建立基于SYBR GreenⅡ的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,设计并筛选了BVDV NS3基因的qRT-PCR引物,建立了BVDV NS3 qRT-PCR检测方法,并利用CFX96和猪警-2000 qRT-PCR仪检测了临床牛血清样本。结果显示,筛选出1对特异性好的引物,CFX96和猪警-2000 qRT-PCR的标准品最小检出值分别为1×10^(1)copies·μL^(-1)和1×10^(2) copies·μL^(-1),特异性和重复性均良好,且临床血清样本的检测结果准确、一致。研究为BVDV检测提供了技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 NS3基因 实时荧光定量pcr SYBR GreenⅡ
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鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及遗传进化分析 被引量：1
2
作者 安乐乐 刘倩芸 +2 位作者 蓝秋菊 罗迅 赵永清 《江西农业大学学报》 北大核心 2025年第1期167-177,共11页
【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病... 【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病学调查提供技术平台。【方法】依据GenBank公布鸽腺病毒Ⅰ型Hexon基因保守区设计引物探针并构建重组质粒pCE2-TA-PiAdV-Ⅰ;优化反应体系和程序,绘制标准曲线、特异性、敏感性和重复性评价,建立鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法;扩增测序阳性临床样品的Hexon基因,使用MEGA5.0进行进化树构建及同源性分析。【结果】该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法标准曲线y=-3.1081x+37.374,线性相关系数R2为0.9977,线性关系良好;与鸽疱疹病毒、鸽圆环病毒等鸽子其他常见病毒无交叉反应,具有良好的特异性;最低检测拷贝数为14.6 copies/μL,敏感性是常规PCR方法的10倍,具有高敏感性;组内和组间变异系数均低于1.1%,重复性好。通过检测112份鸽子病料样品,该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法检测阳性率为69.64%(78/112),并且高于常规PCR方法阳性检出率65.18%(73/112)。此外,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法与常规PCR方法的阳性符合率为100%,总体符合率为95.54%。3条测序毒株与Ⅰ型鸽腺病毒参考毒株同源性为99.47%~99.71%,遗传关系高度接近,表明可能由同一个原始毒株进化而来。【结论】研究建立的鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法线性关系良好、特异性强、敏感性高及重复性好,可快速高效检测出临床样品中的PiAdV-Ⅰ。此外,所扩增序列能够用于分析临床毒株遗传进化特征,有助于快速准确诊断鸽腺病毒感染及疫苗研发提供参考依据。 展开更多
关键词 鸽腺病毒Ⅰ型 Hexon基因 TaqMan探针实时荧光定量pcr 遗传进化分析 临床检测 流行病学调查
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唇形后口虫SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用
3
作者 郝文悦 王锦锦 +9 位作者 葛建龙 李彬 王印庚 廖梅杰 荣小军 赵宏晶 江敏棋 赵文广 牛立成 潘娇 《渔业科学进展》 北大核心 2025年第3期183-193,共11页
后口虫病是近年来影响刺参(Apostichopus japonicus)养殖效益的重要病害种类之一。唇形后口虫(Boveria labialis)是刺参后口虫病的病原。由于缺乏针对该物种的快速、准确的检测方法,研究人员难以系统解析该病原体的传播途径。本研究以... 后口虫病是近年来影响刺参(Apostichopus japonicus)养殖效益的重要病害种类之一。唇形后口虫(Boveria labialis)是刺参后口虫病的病原。由于缺乏针对该物种的快速、准确的检测方法,研究人员难以系统解析该病原体的传播途径。本研究以测序获得的唇形后口虫部分线粒体基因组序列为基础,根据nad10基因序列设计唇形后口虫引物,建立其SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并对刺参不同养殖区和不同养殖模式下养殖系统中唇形后口虫载量进行检测分析。结果显示,设计的唇形后口虫引物在质粒标准品4.05×10^(1)~4.05×10^(9) copies/μL范围内建立的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数R^(2)=0.997,熔解曲线呈现单一峰,无引物二聚体或非特异性扩增;灵敏度实验最低检测限为40.5 copies/μL;所设计的引物仅对唇形后口虫出现特异性扩增,对海洋尾丝虫(Uronema marinum)、贪食纤口虫(Chaenea vorax)、僧帽肾形虫(Colpoda cucullus)和多小核草履虫(Paramecium multi-micronuleatum)无交叉反应;重复性实验中各浓度的批内和批间Ct值均一性较高,批内实验变异系数(CV)值为0.32%~0.82%,批间实验CV值为0.40%~0.88%,稳定性较好。利用本方法对4种刺参养殖模式不同养殖区的环境样品和饲料进行检测,结合镜检结果对比分析发现,海水中唇形后口虫DNA载量与刺参体内唇形后口虫量呈中度正相关(R=0.563),底泥、附着物样品中的唇形后口虫DNA载量与刺参体内唇形后口虫量呈高度正相关(R=0.931)。推测,鲜海泥是唇形后口虫传播的重要载体之一。本研究结果可为唇形后口虫的快速检测、传播途径解析和防控提供参考。 展开更多
关键词 刺参 寄生性疾病 唇形后口虫 实时荧光定量pcr检测 传播途径
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转基因抗虫玉米浙大瑞丰8实时荧光定量PCR检测方法
4
作者 田锦 句荣辉 +7 位作者 蒋红叶 陈子言 张华 李凌燕 孙宇 王颢潜 陈红 梁晋刚 《生物安全学报(中英文)》 北大核心 2025年第2期130-136,共7页
【目的】转基因抗虫玉米浙大瑞丰8是杭州瑞丰生物科技有限公司研发的新型抗虫玉米,于2021年获批农业转基因生物安全证书(生产应用)。本研究旨在为转基因抗虫玉米浙大瑞丰8设计特异性扩增引物和TaqMan探针,并对其转化体成分进行定量检测... 【目的】转基因抗虫玉米浙大瑞丰8是杭州瑞丰生物科技有限公司研发的新型抗虫玉米,于2021年获批农业转基因生物安全证书(生产应用)。本研究旨在为转基因抗虫玉米浙大瑞丰8设计特异性扩增引物和TaqMan探针,并对其转化体成分进行定量检测,为管理部门提供安全监管的依据。【方法】通过体系优化、正确度及精密度检测、稳健性测试等系列研究,设计特异性引物和探针,对浙大瑞丰8转化体成分进行定量检测。【结果】本研究研制的方法能够特异、定量检测出浙大瑞丰8转化体成分,对拷贝数比值在0.1%(20个拷贝数)以上的阳性样品可进行准确定量,对0.05%(10个拷贝数)的阳性样品可特异性检出。【结论】本研究结果为管理部门对浙大瑞丰8的安全监管提供了有效的支撑,说明研制的方法可用于浙大瑞丰8的定量检测和安全监管。 展开更多
关键词 转基因抗虫玉米浙大瑞丰8 实时荧光定量pcr 检测
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香蕉细菌性鞘腐病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立
5
作者 麦桂婉 肖文超 +2 位作者 李云锋 李华平 饶雪琴 《华中农业大学学报》 北大核心 2025年第5期308-313,共6页
为实现香蕉细菌性鞘腐病的早期准确检测,基于香蕉细菌性鞘腐病菌的管家基因fusA设计特异性引物,优化扩增条件,建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并与常规PCR进行比较。结果显示,SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测质粒DNA的灵... 为实现香蕉细菌性鞘腐病的早期准确检测,基于香蕉细菌性鞘腐病菌的管家基因fusA设计特异性引物,优化扩增条件,建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并与常规PCR进行比较。结果显示,SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测质粒DNA的灵敏度为3.3×10^(−5)ng/μL,是常规PCR的100倍。利用建立的方法对接种香蕉细菌性鞘腐病菌XJ5-1的香蕉叶鞘和土样进行检测,结果发现该方法能检测到香蕉叶鞘中拷贝数为4.31×10^(3)copies/μL和土样中拷贝数为1.07×10^(9)copies/μL的XJ5-1;能检测出接种浓度为1×10^(3)CFU/mL的温室土样中的XJ5-1,灵敏度是常规PCR的100倍。结果表明,建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法快速简便、灵敏度高,可实现香蕉细菌性鞘腐病的早期诊断。 展开更多
关键词 香蕉细菌性鞘腐病 Dickeya dadantii SYBR GreenⅠ实时荧光定量pcr
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猫传染性腹膜炎病毒SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用 被引量：3
6
作者 李星颖 谢梓民 +11 位作者 原耀贤 孙铭澮 江文康 赵明明 何诗 何静 赖健仪 白银山 陈胜锋 陈志胜 马骏 王丙云 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第3期44-49,共6页
为了提高猫传染性腹膜炎(FIP)的临床检出率,本试验根据猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)M基因设计特异性引物,将扩增的目的基因连接到p MD19-T载体上,获得重组质粒并作为标准阳性模板,建立针对FIPV的SYBR Green实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法... 为了提高猫传染性腹膜炎(FIP)的临床检出率,本试验根据猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)M基因设计特异性引物,将扩增的目的基因连接到p MD19-T载体上,获得重组质粒并作为标准阳性模板,建立针对FIPV的SYBR Green实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法,并对其特异性、敏感性、重复性和临床检出率进行验证。结果显示,本方法梯度稀释的标准品与Ct值呈良好的线性关系,R^(2)=0.999 9,扩增效率为92.4%;与其他猫常见病毒未发生交叉反应;最低检测限为3.48×10^(2) copies/μL,敏感性是普通PCR检测方法的100倍;该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于2.4%;应用该方法对临床阳性样本的检出率为100%,阴性样本检出率为0。结果表明,本试验建立的SYBR Green q PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、临床检测效果佳,可用于FIPV的临床诊断。 展开更多
关键词 猫传染性腹膜炎病毒 M基因 SYBR Green 实时荧光定量pcr(qpcr)
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猪丹毒杆菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
7
作者 宋前进 刘溪源 +5 位作者 乌吉斯古楞 陈亚飞 路乾 刘维平 张静 曹晓真 《中国动物检疫》 2025年第11期77-82,共6页
为建立猪丹毒杆菌的快速检测方法,根据GenBank数据库中猪丹毒杆菌荚膜多糖基因(cps)序列设计并合成引物及探针,通过对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立检测猪丹毒杆菌的TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏度和重复性进行... 为建立猪丹毒杆菌的快速检测方法,根据GenBank数据库中猪丹毒杆菌荚膜多糖基因(cps)序列设计并合成引物及探针,通过对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立检测猪丹毒杆菌的TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏度和重复性进行验证。结果显示:当质粒标准品拷贝数浓度为2.28×10^(8)~2.28×10^(1) copies/μL时,质粒标准品拷贝数浓度对数和Ct值呈现良好的线性关系;仅对猪丹毒杆菌核酸样品扩增后出现特异性曲线,与其他23种常见猪病病原核酸均无交叉反应;对猪丹毒杆菌的检测灵敏度比普通PCR高100倍,重复性试验组内和组间变异系数均小于2%。结果表明,本研究建立的方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的优点,可用于猪丹毒杆菌感染的早期诊断。 展开更多
关键词 猪丹毒杆菌 TaqMan荧光定量pcr 检测方法
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鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：3
8
作者 张玉霞 董雯雯 +2 位作者 袁小远 孟凯 徐怀英 《山东农业科学》 北大核心 2024年第6期128-132,共5页
鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基... 鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。 展开更多
关键词 鸡喉气管炎病毒 TK基因 实时荧光定量pcr 特异性 敏感性 重复性
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槟榔黄化植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：3
9
作者 林兆威 孟秀利 +2 位作者 唐庆华 牛晓庆 宋薇薇 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第6期1120-1126,共7页
槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并... 槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。 展开更多
关键词 槟榔 槟榔黄化病 植原体 TaqMan实时荧光定量pcr 病害检测
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猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用 被引量：7
10
作者 刘莹 李峰 +3 位作者 殷宗俊 王敬茹 李书光 郑先瑞 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期34-38,共5页
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方... 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 Taq Man探针 实时荧光定量pcr
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西番莲中夜来香花叶病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：2
11
作者 顾佩佩 王莹 +2 位作者 杨之巽 韩俊娜 黄爱军 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期195-202,共8页
夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus, TeMV)是对西番莲危害较大的一种病毒病原。根据病毒末端结合蛋白(VPg)序列设计引物,建立了以Vpg-334F/506R为特异性引物,退火温度54℃,引物浓度0.6μmol/L的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法... 夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus, TeMV)是对西番莲危害较大的一种病毒病原。根据病毒末端结合蛋白(VPg)序列设计引物,建立了以Vpg-334F/506R为特异性引物,退火温度54℃,引物浓度0.6μmol/L的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法可特异性扩增TeMV基因组6 483~6 675 nt区域,所得标准曲线扩增效率为10^(2).77%,决定系数为0.996 1,最低检测浓度为2.370×10^(2)拷贝/μL,灵敏度是普通PCR的1 000倍。应用该方法对接种TeMV的西番莲进行检测,发现接种3 d后可在叶片中检测到TeMV,定量分析不同温度下TeMV在叶片中的积累,发现26~28℃下病毒积累速度最快,且植株症状表现与病毒积累量密切相关。对赣南地区采集的76份西番莲田间样品进行检测,共检出71份阳性样品,检出率为93.4%。综上,本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强,灵敏度高,适于TeMV的快速检测。 展开更多
关键词 夜来香花叶病毒 西番莲 实时荧光定量pcr
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PRRSV、CSFV、PRV和PCV2四重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：4
12
作者 李欣 杨莉 +4 位作者 刘光亮 王文秀 刘海隆 曹宗喜 张艳 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期7-14,共8页
为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的四重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,针对PRRSV的ORF2基因、CSFV的5′UTR基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因设计了引物及Taq Ma... 为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的四重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,针对PRRSV的ORF2基因、CSFV的5′UTR基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因设计了引物及Taq Man探针,并进行反应体系优化,敏感性、特异性验证,建立了同时检测上述4种病原的四重实时荧光定量PCR。结果显示,所建立的四重荧光PCR扩增效率(E)、相关系数(R^(2))及曲线斜率均在正常范围内,检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2 E值、R^(2)、斜率分别为92.9%、0.998、-3.504,90.7%、0.998、-3.566,94.3%、0.996、-3.466,94.2%、0.997及-3.470。PRRSV、CSFV、PRV、PCV2重组质粒最低检出限分别达到10^(2)、10^(2)、10^(2)、10^(3) copies/μL;四重qPCR反应体系中的多条引物间不发生交叉反应,经评价该方法特异性良好;批内和批间重复性试验结果显示,变异系数(CV)均在1%以下,具有良好的重复性。分别使用该方法和相应的国标荧光定量检测法对采集的298份临床样品进行检测对比,两种方法检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2阳性符合率分别为96.08%、96.38%、100%、94.95%,均在94%以上。结果表明,建立的检测方法方便、灵敏、高效、特异性强,适用于猪呼吸道疾病病原学、流行病学研究以及临床病例的诊断,并为猪呼吸道疾病的预防和控制提供技术支撑。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪瘟病毒 猪伪狂犬病病毒 猪圆环病毒2型 四重实时荧光定量pcr
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类NADC34 PRRSV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：1
13
作者 袁丽莉 朱振邦 +5 位作者 刘盼娆 陈南华 李燕华 范娟 陈昌海 李向东 《中国动物传染病学报》 北大核心 2024年第6期81-88,共8页
类NADC34 PRRSV自2018年在我国首次报道以来,流行范围不断扩大,在局部地区已演变为优势毒株。目前尚无针对类NADC34 PRRSV特异性的普通PCR或real-time PCR诊断方法,常规的PRRSV分型与鉴别诊断方法可能导致此类毒株被误诊为类NADC30 PRRS... 类NADC34 PRRSV自2018年在我国首次报道以来,流行范围不断扩大,在局部地区已演变为优势毒株。目前尚无针对类NADC34 PRRSV特异性的普通PCR或real-time PCR诊断方法,常规的PRRSV分型与鉴别诊断方法可能导致此类毒株被误诊为类NADC30 PRRSV。因此,本研究根据类NADC30 PRRSV与类NADC34 PRRSV在Nsp2基因的序列差异,设计特异性引物和探针,建立了类NADC34 PRRSV TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:本研究建立的方法特异性良好;不同稀释度的阳性标准质粒在2.8×10^(1)~2.8×10^(6)copies/μL具有良好的线性范围,标准曲线R^(2)值为0.997;本方法灵敏度高,检测下限为2.8×10^(1)copies/μL;重复性分析结果显示,批内和批间试验的变异系数CV值均小于2.5%,呈现出良好的重复性。综上,本研究成功建立了快速检测类NADC34 PRRSV的实时荧光定量PCR方法,为开展此类毒株在我国流行状况的调查提供了有力的检测工具。 展开更多
关键词 类NADC34 PRRSV TAQMAN探针 实时荧光定量pcr
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针对非洲猪瘟病毒K205R基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
14
作者 乔思娜 李丽薇 +8 位作者 赵款 高飞 周艳君 姜一峰 童武 赵冉 童光志 李国新 董世山 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第4期67-72,共6页
为了快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swin fever virus,ASFV),本文根据我国流行毒株ASFV SY18(GenBank ID:MH766894.1)已公布的K205R基因序列设计并合成特异性引物及探针,建立针对K205R基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法。经过特异... 为了快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swin fever virus,ASFV),本文根据我国流行毒株ASFV SY18(GenBank ID:MH766894.1)已公布的K205R基因序列设计并合成特异性引物及探针,建立针对K205R基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法。经过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测试验分析显示,本文建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法Ct值与标准品在1×10^(11)~1×10^(2)copies/μL范围内具有很好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-2.797,检测下限为10^(2)copies/μL,与其他能引起相似临床症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.53774%,重复性好。本方法适用于临床样品及本实验室构建的表达ASFV K205R基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴定及检测,对ASFV快速检测及ASF早期诊断有重要意义。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) K205R基因 荧光定量pcr 检测方法
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水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
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作者 盛陈艳 麻宝艺 +7 位作者 李健明 宫庆龙 刘菲 时坤 孙志博 刘艺 冷雪 杜锐 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期131-138,共8页
为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关... 为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10^(1) copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^(-2) pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 水貂圆环病毒 Cap基因 SYBR Green II实时荧光定量pcr方法
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鸭坦布苏病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 陈平平 嵇辛勤 +5 位作者 阮涌 王晗晗 罗晓宇 安而立 龙丹丹 段志强 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第10期75-80,共6页
为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性... 为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性、敏感性和重复性,并使用该方法对临床样本进行检测。结果显示,所建立的标准曲线相关系数为0.999 5,有良好的线性关系;该方法可特异检测DTMUV;对标准质粒的最低检测限为2.72×10^(2) copies/μL,是普通PCR的100倍;CT值组内变异系数为0.97%~1.32%,组间变异系数为1.24%~1.79%;人工感染DTMUV的20份鸭胚成纤维细胞样本以及12份人工攻毒2 d的雏鸭脾脏组织样本和12份泄殖腔棉拭子样本阳性率为100%(44/44);疑似感染的12份活鸭泄殖腔棉拭子阳性率为25.00%(3/12),14份病死鸭脾脏组织样本阳性率为28.57%(4/14)。结果表明,本试验建立的TaqMan探针qPCR方法有良好的敏感性、准确性和重复性,能特异检测DTMUV,适用于临床快速检测,为DTMUV的分子流行病学调查和临床疾病诊断提供了技术支撑。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒(DTMUV) TAQMAN探针 实时荧光定量pcr(qpcr)
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鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：4
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作者 陈佳圣 赵天琪 +3 位作者 刘东华 孙祥茹 陈文德 李根 《中国家禽》 北大核心 2024年第1期56-61,共6页
为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×... 为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。 展开更多
关键词 鸡圆环病毒 SYBR GreenⅠ实时荧光定量pcr 检测方法
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木糖葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用 被引量：1
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作者 于灵芝 冯丽萍 +2 位作者 孔志豪 朱琦 魏晓锋 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期73-79,共7页
目的本研究拟建立一种灵敏快速的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)方法,用于检测大、小鼠木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus,S.xylosus)。方法本研究选择特异性gehM基因片段作为靶标合成了一套引物,建立了木糖葡萄... 目的本研究拟建立一种灵敏快速的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)方法,用于检测大、小鼠木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus,S.xylosus)。方法本研究选择特异性gehM基因片段作为靶标合成了一套引物,建立了木糖葡萄球菌检测的qPCR方法。对木糖葡萄球菌标准菌株和其他非目标菌进行特异性分析。将木糖葡萄球菌的DNA进行10倍稀释测定其灵敏度。用送检的样本进行了临床应用并测序验证,同时与培养法进行比较。结果仅木糖葡萄球菌出现特异性扩增曲线,而其他非目标菌未出现,表明设计的引物对木糖葡萄球菌具有特异性,灵敏度为100 fg/μL,组内和组间重复性均小于3%。共检测60份临床样品,有5份样品扩增曲线为典型的S曲线,将该qPCR产物克隆测序并进行同源性比对,该序列与木糖葡萄球菌的同源性为99.63%,表明该样本木糖葡萄球菌核酸阳性,所检测样本阳性率为8.3%,而培养法的阳性率为6.7%,qPCR方法阳性检出率比培养法略高。结论建立的木糖葡萄球菌qPCR方法,具有快速、灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,可用于实验动物木糖葡萄球菌的检测。 展开更多
关键词 木糖葡萄球菌 检测方法 实时荧光定量pcr
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副结核分支杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
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作者 平宇明 张宏莉 +8 位作者 班亚星 刘建奇 任希恩 邬彩丽 刘东霞 徐丽媛 杨雪娇 常华 李劼 《动物医学进展》 北大核心 2024年第7期1-6,共6页
为加强副结核分支杆菌(MAP)的检测、监测与防控,建立MAP荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据国内MAP流行菌株特异性插入序列IS900设计1对特异性引物和探针,构建重组阳性质粒用作建立qPCR的模板,优化反应体系和条件,验证该方法的特异性、敏... 为加强副结核分支杆菌(MAP)的检测、监测与防控,建立MAP荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据国内MAP流行菌株特异性插入序列IS900设计1对特异性引物和探针,构建重组阳性质粒用作建立qPCR的模板,优化反应体系和条件,验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法最低检测限为5拷贝/μL;重复试验中批内和批间变异系数均小于4%;与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛支原体、肺炎克雷伯菌和曼氏杆菌等病原检测无交叉反应,能特异性检出MAP。应用建立的qPCR开展了内蒙古自治区6个市的MAP临床样品检测和流行情况分析,结果显示MAP平均阳性率为0.85%(6/704)。结果表明,成功建立了MAP的实时荧光定量PCR检测方法,可用于临床中MAP的监测和调查,为MAP疾病诊断与监控提供了快捷的方法。 展开更多
关键词 副结核分支杆菌 实时荧光定量pcr 检测方法 感染调查
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 安乐乐 罗迅 +2 位作者 杨宣叶 胡欣妍 赵永清 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第9期1681-1688,共8页
为建立一种快速、高效检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank公布的中国流行PRRSV病毒株基因序列,制备包含PRRSV ORF7基因的重组质粒标准品,同时,针对PRRSV保守区域ORF7基因序列设计特异性引物和探... 为建立一种快速、高效检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank公布的中国流行PRRSV病毒株基因序列,制备包含PRRSV ORF7基因的重组质粒标准品,同时,针对PRRSV保守区域ORF7基因序列设计特异性引物和探针,并优化引物和探针终浓度,建立PRRSV Taq Man实时荧光定量PCR检测方法。以质粒标准品为模板构建检测方法线性模型,评估灵敏度、重复性和特异性,并在疑似临床样品中初步应用。本研究建立的PRRSV Taq Man荧光定量PCR检测方法线性关系良好,线性决定系数为0.9975;病毒载量检测限度为1μL 3.32×10^(1)拷贝;变异系数在组内和组间重复中均小于1.500%;仅与PRRSV发生特异性反应,未与其他病毒发生交叉反应。临床样品qPCR检测阳性率为36.92%,高于PCR检测阳性率(26.15%),阳性符合率为100%。基于PRRSV ORF7基因构建的Taq Man荧光定量PCR检测方法线性关系良好、灵敏度高、重复性好、特异性强,可快速、高效检测临床样品PRRSV,为PRRSV早期诊断、及时防控和流行病学调查提供了科学的技术支撑。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征 ORF7基因 Taq Man实时荧光定量pcr 早期诊断
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