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实时荧光定量PCR技术在动物遗传育种中的应用
1
作者 张海富 籍丁艳 《农业技术与装备》 2012年第23期75-77,共3页
聚合酶链式反应技术（polymerasechainreaction简称PCR）是一项体外基因快速扩增技术。该技术的建立，使定性检测的技术得到改善，达到检测单个靶细胞的水平，以其简便易行、灵敏度高等优点被广泛应用于分子生物学及医学等领域。但其易... 聚合酶链式反应技术（polymerasechainreaction简称PCR）是一项体外基因快速扩增技术。该技术的建立，使定性检测的技术得到改善，达到检测单个靶细胞的水平，以其简便易行、灵敏度高等优点被广泛应用于分子生物学及医学等领域。但其易污染、假阳性及定量不准确等问题也日益突出。而荧光定量PCR技术（FQ—PCR）的出现解决了以上难题，实现了从定性到定量的飞跃。此方法特异性强和可靠性更强，能实现多重反应，且采用完全闭管检测，不需要PCR后处理，有效解决PCR污染问题以及EB对试验人员的伤害； 展开更多
关键词 实时荧光定量PCR技术 动物遗传育种 聚合酶链式反应技术 应用 定性检测 污染问题 分子生物学 扩增技术
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实时荧光PCR检测HBsAg阴性、抗HBc阳性献血者血液中HBV DNA研究 被引量：10
2
作者 叶贤林 刘晓红 +3 位作者 马兰 张红 李活 曾劲峰 《中国感染控制杂志》 CAS 2009年第4期241-244,240,共5页
目的对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性、乙型肝炎核心抗体（抗HBc）阳性的献血者血液进行经输血传播乙型肝炎病毒（HBV）的风险评估，为完善HBV血液筛查模式及确保临床用血安全提供依据。方法对献血者血液常规检测阴性的标本进行8×... 目的对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性、乙型肝炎核心抗体（抗HBc）阳性的献血者血液进行经输血传播乙型肝炎病毒（HBV）的风险评估，为完善HBV血液筛查模式及确保临床用血安全提供依据。方法对献血者血液常规检测阴性的标本进行8×45μL汇集，应用实时荧光聚合酶链反应（PCR）进行混样核酸检测HBVDNA。对血液常规筛查和混样核酸检测合格的标本，进行随机乙型肝炎血清学5项标志物的酶联免疫吸附试验（ELISA）。对获得的HBsAg阴性、混样HBVDNA阴性、抗HBc阳性的标本，进一步采用单份样本（720μL）实时荧光PCR法检测并定量分析。结果混样标本共检测12552份，检出HBsAg阴性、HBVDNA阳性标本2份，阳性率为0．02％。随机筛查混样核酸检测阴性标本614份，检出抗HBc阳性标本320份，对此320份标本进行单份核酸检测，检出阳性标本1份，阳性率为0．31％。结论HBsAg阴性、抗HBc阳性献血者血液存在输血传播HBV的风险，应用核酸扩增技术检测血液HBVDNA能大大提高血液安全性。 展开更多
关键词 输血 献血者 核酸扩增技术 实时荧光聚合酶链反应 肝炎病毒 乙型 乙型肝炎核心抗体
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转录介导扩增技术检测慢性丙型肝炎患者血清中HCV RNA及与RT-PCR的比较 被引量：9
3
作者 吴大先 刘菲 +2 位作者 刘洪波 戴立忠 谭德明 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期664-672,共9页
目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HCV RNA,并与实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)进行比较,探讨TMA系统的稳定性及其与RT... 目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HCV RNA,并与实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)进行比较,探讨TMA系统的稳定性及其与RT-PCR的灵敏性差异和相关性,以及TMA临床应用的意义。方法:利用鼠白血病反转录酶(moloney murine leukemia virus,MMLV)、T7 RNA聚合酶及2条特异性引物等建立TMA扩增体系;通过HCV RNA的扩增曲线的相关性变化,评价不同储存温度对TMA扩增体系的稳定性和重复性的影响;通过扩增一组10倍梯度稀释的HCV RNA体外转录样本,评价TMA体系与RT-PCR的灵敏性差异。收集101份临床诊断为慢性丙型肝炎患者的血清,同时采用TMA试剂和RT-PCR试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用直线相关和回归探讨两种方法检测血清HCV RNA的相关性。结果:成功地建立了TMA扩增体系,该体系在室温下放置24 h,结果影响较大,但在4℃储存6 d,-20℃下储存6个月内扩增效果不受影响,稳定性良好。与湖南圣湘生物技术公司RT-PCR试剂检测结果的比较显示:31份血清标本TMA及RT-PCR均检测到阳性20例,阴性11例,检测一致率为100%。选取其中20例阳性标本进行定量分析,发现两种技术有很好的相关性(r=0.91,P<0.01)。与上海科华公司的RT-PCR试剂检测结果比较,发现在70份血清标本中,TMA检出RNA阳性标本数为34例,阴性标本数为36例,PCR检出RNA阳性标本数为32例,阴性标本数为38例,检测一致率为97.1%,两种检测方法阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中29例PCR检测和TMA检测均有定量结果的血清进行分析,两种技术也有很好的相关性(r=0.96,P<0.01)。结论:TMA检测试剂在-20℃下储存,6个月内稳定性和重复性良好。TMA与RT-PCR均能很好地检出血清中HCV RNA,两种技术有很好的相关性,定量检测有很好的可比性。 展开更多
关键词 转录介导的扩增技术 丙型肝炎 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 丙型肝炎病毒核糖核酸
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转录介导的扩增技术与real-time RT-PCR在人类免疫缺陷病毒检测中的应用
4
作者 吴大先 陶淑慧 +3 位作者 刘水平 周杰斌 谭德明 侯周华 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期776-782,共7页
目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚... 目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚合酶及PCR底物等建立TMA扩增体系。通过扩增一组10倍梯度稀释的HIV RNA转录标准品,评价TMA体系的灵敏性。收集60例HIV感染患者的血浆,同时采用TMA试剂与Cobas Amplicor HIV-1 Monitor 1.5版试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用线性回归和Bland-Altman法分析两种技术的相关性和一致性。结果:成功建立了TMA扩增体系,这种技术可以检测低至10 copies/m L的HIV转录标准品。60份HIV感染者血浆样本中,TMA及Cobas均检测到阳性46份,均阴性12份,TMA检测阴性而Cobas检测阳性样本2份,检测一致率为96.7%。两种技术阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中46份TMA检测和Cobas检测均有定量结果的血浆进行线性回归分析,两种技术有非常好的相关性(r=0.997,P<0.001)。Bland-Altman分析显示两种检测方法定量Lg差值平均值为0.02,44份(95.7%)样本在95%的一致性界限内。结论:TMA技术具有高灵敏性潜能。TMA与real-time RT-PCR检测血浆中HIV RNA具有非常好的相关性与一致性。 展开更多
关键词 转录介导的扩增技术 人类免疫缺陷病毒 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 线性回归
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羊口疮病毒分子生物学检测方法研究进展 被引量：1
5
作者 刘庆伦 孟继彬 +4 位作者 张淑芹 刘冰 蒋福涛 孙百栋 刘守广 《中国动物检疫》 2025年第1期81-88,共8页
羊口疮是一种由羊口疮病毒(ORFV)引起的高度传染性疫病,给养羊业造成了严重经济损失,而及时准确检测病原体有利于减少因其造成的经济损失。现已建立了多种ORFV检测方法,其中分子生物学方法检测准确、灵敏度高、特异性强,可大幅提升ORFV... 羊口疮是一种由羊口疮病毒(ORFV)引起的高度传染性疫病,给养羊业造成了严重经济损失,而及时准确检测病原体有利于减少因其造成的经济损失。现已建立了多种ORFV检测方法,其中分子生物学方法检测准确、灵敏度高、特异性强,可大幅提升ORFV检测能力,在防控羊口疮病发生和流行中发挥了重要作用。常规聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)、叠氮溴化丙啶结合PCR(PMA-PCR)以及环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等分子生物学方法在检测OFRV方面各有优势,但也都存在一定局限性,实际应用时要结合各自的条件和需求以及检测目的因地制宜地选择。随着现代分子生物技术的发展,一些新技术如数字液滴PCR(ddPCR)和第三代测序(TGS)等也将被探索用于ORFV检测研究。本文对ORFV分子生物学检测技术研究进展进行综述,以期为该病原快速检测方法的研制和检测标准制定提供借鉴。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 聚合酶链式反应 实时荧光定量PCR 环介导等温扩增 重组酶聚合酶扩增
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市售食品21种动植物过敏原成分的检测分析 被引量：1
6
作者 何名扬 王鸣秋 +6 位作者 刘艳 李诗瑶 朱必婷 张涛 郭雅晴 周陶鸿 彭青枝 《中国酿造》 CAS 北大核心 2024年第5期255-260,共6页
为进一步明确市售食品动植物过敏原标注情况,该研究建立一种可同时检测21种动植物过敏原成分的多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术,并对其进行灵敏度实验,并结合实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)检测技术对38种市售预包装食品中动... 为进一步明确市售食品动植物过敏原标注情况,该研究建立一种可同时检测21种动植物过敏原成分的多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术,并对其进行灵敏度实验,并结合实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)检测技术对38种市售预包装食品中动植物过敏原成分进行比较分析。结果表明,采用MLPA检测技术可同时对21种动植物过敏原成分进行检测,扩增峰之间不存在交叉干扰,扩增峰实际大小和理论大小相差≤3 bp,检出最低脱氧核糖核酸(DNA)质量浓度为1 ng/μL;RT-fqPCR、MLPA技术检测标注过敏原成分食品的检出率分别为51.5%、44.1%,此外,MLPA检测法检出了6个标注可能含有过敏原成分样品中的过敏原成分,10个样品中未标记的过敏原成分。因此,采用MLPA技术检测21种动植物过敏原成分的灵敏度更高。 展开更多
关键词 动植物过敏原 多重连接依赖性探针扩增 实时荧光定量聚合酶链式反应 多重检测
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桉树焦枯病菌内参基因的筛选 被引量：4
7
作者 陈慧洁 冯丽贞 +3 位作者 李慧敏 杨泽慧 丁奕 郭朦朦 《森林与环境学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期98-103,共6页
为筛选出桉树焦枯病菌在盐胁迫及侵染桉树叶片两种条件下表达稳定的内参基因,采用实时荧光定量聚合酶链式扩增反应(RT-q PCR)技术分析了桉树焦枯病菌中7个常用内参基因(GAPDH、α-tubulin-1、α-tubulin-2、18S rRNA、ubiquitin、β-ac... 为筛选出桉树焦枯病菌在盐胁迫及侵染桉树叶片两种条件下表达稳定的内参基因,采用实时荧光定量聚合酶链式扩增反应(RT-q PCR)技术分析了桉树焦枯病菌中7个常用内参基因(GAPDH、α-tubulin-1、α-tubulin-2、18S rRNA、ubiquitin、β-actin、β-tubulin)的mRNA差异表达情况,并采用ge Norm软件分析了它们在两种条件下的表达稳定性。结果表明,ubiquitin和α-tubulin-2为桉树焦枯病菌在NaCl胁迫下表达最稳定的基因,且不需要引入第3个基因;18S rRNA和α-tubulin-1为侵染桉树叶片下表达最稳定的基因,但需引入第3个基因GAPDH。因此,ubiquitin和α-tubulin-2为桉树焦枯病菌在NaCl胁迫下较适合的内参基因,而18S rRNA、α-tubulin-1和GAPDH为侵染桉树叶片较适合的内参基因。 展开更多
关键词 桉树焦枯病菌 盐胁迫 侵染 实时荧光定量聚合酶链式扩增反应 内参基因
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应用XpertMTB／RIF技术快速诊断膝关节结核 被引量：10
8
作者 唐恺 董伟杰 +4 位作者 兰汀隆 范俊 李元 严广璇 秦世炳 《中国防痨杂志》 CAS 2016年第4期300-304,共5页
目的评价利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（XpertMTB／RIF，简称“Xpert”）在膝关节结核诊断中的临床应用价值。方法连续收集2014年1月至2015年10月在首都医科大学附属北京胸科医院骨科接受手术治疗的49例膝关节病变患者的关... 目的评价利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（XpertMTB／RIF，简称“Xpert”）在膝关节结核诊断中的临床应用价值。方法连续收集2014年1月至2015年10月在首都医科大学附属北京胸科医院骨科接受手术治疗的49例膝关节病变患者的关节积液标本，每份标本同时分别行涂片抗酸杆菌检查、罗氏培养基培养、Xpert检测。以临床诊断为参考标准，评价Xpert检测关节积液标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度。结果以临床诊断为参考标准，涂片、罗氏培养基培养、Xpert检测的敏感度分别为17．2％（5／29）、31．0％（9／29）、69．0％（20／29），差异有统计学意义（X2=8．34，P％0．05）；特异度分别为85．0％（17／20）、100．0％（20／20）、90．O％（18／20）。结论Xpert检测关节积液标本中结核分枝杆菌的敏感度高，并且可同时检测其耐药性，可用于快速诊断膝关节结核。 展开更多
关键词 结核 骨关节 荧光定量核酸扩增检测技术 聚合酶链反应 诊断 耐药性
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流感病毒核酸检测方法研究进展 被引量：13
9
作者 徐敏 向华 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第1期89-92,共4页
流感病毒可以引起人和动物高度接触性传染性疾病,对公共卫生和畜禽养殖业均造成极大的威胁。因此,准确而又快速的诊断方法对流感的防控起着非常重要的作用。近年来,流感病毒的核酸诊断技术发展较快,主要有RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、... 流感病毒可以引起人和动物高度接触性传染性疾病,对公共卫生和畜禽养殖业均造成极大的威胁。因此,准确而又快速的诊断方法对流感的防控起着非常重要的作用。近年来,流感病毒的核酸诊断技术发展较快,主要有RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、基因芯片、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)等。论文对这些诊断技术的基本原理和应用现状进行了综述,并对其发展前景进行了展望。 展开更多
关键词 流感病毒 逆转录-聚合酶链反应 实时荧光定量RT-PCR 基因芯片 环介导等温扩增
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牛轮状病毒RAA-CRISPR/Cas13a快速检测方法的建立
10
作者 袁炫帅 赵琳琳 龙淼 《中国兽医杂志》 2025年第11期70-76,共7页
为建立一种快速检测牛轮状病毒(BRV)的方法,本试验结合重组酶介导等温扩增(RAA)技术和簇状规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白13a(CRISPR/Cas13a)系统,以BRV保守基因序列VP6设计Target RNA、RAA扩增引物和crRNA,并筛选最佳RAA引物和... 为建立一种快速检测牛轮状病毒(BRV)的方法,本试验结合重组酶介导等温扩增(RAA)技术和簇状规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白13a(CRISPR/Cas13a)系统,以BRV保守基因序列VP6设计Target RNA、RAA扩增引物和crRNA,并筛选最佳RAA引物和反应条件,建立BRV的RAA-CRISPR/Cas13a检测方法,同时验证该方法的特异性、敏感性和重复性,并与逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)方法进行临床样本检测对比。结果显示,RAA-CRISPR/Cas13a检测方法与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛星状病毒(BoAstV)和大肠杆菌(Escherichia coli)未发生交叉反应,特异性强;最低检测限为1.9×10^(2) copies/μL,敏感性强;组内、组间变异系数分别为3.9%和7.4%,分别小于5%和10%,重复性良好。检测108份牛粪样本,RAA-CRISPR/Cas13a与RT-qPCR检测的阳性检出率均为44%(47/108),符合率为100%。结果表明,本试验建立的BRV RAA-CRISPR/Cas13a快速检测方法灵敏度高、特异性强,可为BRV临床快速检测提供有力技术支撑。 展开更多
关键词 牛轮状病毒(BRV) 重组酶介导等温扩增(RAA) CRISPR/Cas13a 实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR) 病毒检测
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