新型冠状病毒实时荧光双重逆转录RPA的建立及其在食品检测中的应用 被引量：5

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作者 吕继洲 吴绍强 +5 位作者 张舟 邓俊花 袁向芬 王彩霞 冯春燕 林祥梅 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期238-244,共7页

旨在建立一种新型冠状病毒实时荧光逆转录重组酶聚合酶恒温快速的检测技术(RT-RPA)用于新型冠状病毒的检测与监测。根据新型冠状病毒保守的特异性S基因以及N基因序列,设计了两套RPA引物、探针;同时基于N基因等靶标序列构建重组载体,构... 旨在建立一种新型冠状病毒实时荧光逆转录重组酶聚合酶恒温快速的检测技术(RT-RPA)用于新型冠状病毒的检测与监测。根据新型冠状病毒保守的特异性S基因以及N基因序列,设计了两套RPA引物、探针;同时基于N基因等靶标序列构建重组载体,构建新型冠状病毒假病毒颗粒(VLPs)作为阳性质控品。经验证,筛选出一套基于S基因以及N基因的双重RPA引物、探针组合,其分析敏感度S基因引物探针可达10 copies/reaction,N基因引物探针分析敏感度可达102 copies/reaction;分析特异性良好,与H1N1流感病毒、PEDV、TGEV、FMDV、PPRV以及RV病毒无交叉反应。该方法建立后,应用于食品、动物组织器官及临床样本的检测。该方法可特异性从上述样本中检测到新型冠状病毒,表明其具有速度快(20 min)、双靶标、灵敏度高、操作简便,对仪器设备要求低等优点,可用于新型冠状病毒在食品、动物产品以及临床样本中的快速筛查。 展开更多

关键词 新型冠状病毒 实时荧光反转录rpa 假病毒颗粒

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应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性 被引量：3

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作者 许炎 张晨 +5 位作者 徐庆文 黄江平 刘亚楠 邹凯南 平原 周怀谷 《法医学杂志》 CAS CSCD 2013年第4期259-262,共4页

目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse tr... 目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术反转录成cDNA,根据3种生物检材不同的目标基因设计3对特异性引物,进行实时荧光定量PCR扩增,通过熔解曲线测定不同的熔解温度(Tm)和不同长度的扩增片段来区分生物检材。结果血液(斑)的Tm值为(84.5±0.2)℃,片段长度177 bp;唾液(斑)的Tm值为(76.9±0.3)℃,片段长度134 bp;精液(斑)的Tm值为(88.5±0.2)℃,片段长度294 bp。结论与常规检验法比较,联合应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术判定检材的生物属性特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠,可应用于日常法医物证检验。 展开更多

关键词 法医遗传学 反转录PCR 实时荧光定量PCR 血液 唾液 精液

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犬瘟热病毒实时荧光RT-RPA检测方法的建立及应用 被引量：4

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作者 张启龙 傅彩霞 +6 位作者 张玮 高晓龙 王林 程敏姮 郑雪莹 刘海莹 周德刚 《动物医学进展》 北大核心 2020年第11期19-23,共5页

为建立犬瘟热病毒(CDV)临床快速检测方法,针对CDV保守N基因依据重组酶聚合酶等温扩增(RPA)引物设计原理进行RPA引物探针设计,通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和临床样品检测,建立了CDV实时荧光RT-RPA检测方法。结果显示,反应... 为建立犬瘟热病毒(CDV)临床快速检测方法,针对CDV保守N基因依据重组酶聚合酶等温扩增(RPA)引物设计原理进行RPA引物探针设计,通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和临床样品检测,建立了CDV实时荧光RT-RPA检测方法。结果显示,反应体系中M-MLV反转录酶最适浓度为4 U/μL,所建CDV实时荧光RT-RPA检测方法特异性较好,敏感性最低可检测到5.68×102 copies/μL,高于国标RT-PCR(GB/T 27532-2011)检测方法。建立的CDV实时荧光RT-RPA检测方法具有较高的敏感性和特异性、操作简便、20 min内判定结果,可用于临床犬瘟热快速诊断,对犬瘟热的防控具有重要意义。 展开更多

关键词 犬瘟热病毒 实时荧光 反转录-重组酶聚合酶等温扩增 检测

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人端粒酶催化亚单位mRNA的实时荧光RT-PCR定量检测 被引量：7

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作者 郭颖 刘军 +2 位作者 薛采芳 吴静 宋天保 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期618-620,共3页

目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定... 目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定量测定人 β 肌动蛋白 (hBA)的mRNA作为内对照。用梯度稀释的克隆的人 β 肌动蛋白基因制作标准曲线。结果 :标准曲线的相关系数为 1.0 0。实时荧光反转录PCR方法的平均变异系数为 7.1%。HepG2细胞hTERTmRNA与hBAmRNA的比值为 (1.3± 0 .3)× 10 -4。结论 :建立了可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。 展开更多

关键词 RNA 端粒酶催化亚单位 实时荧光PCR 反转录PCR HepG2细胞 定量测定 Β-肌动蛋白 BA 稀释 特异引物

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新城疫病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立 被引量：7

5

作者 陈兵 胡运发 +12 位作者 孙洁 陈书琨 刘建利 曾少灵 曹琛福 张彩虹 阮周曦 林庆燕 吕建强 杨俊兴 花群义 卢体康 秦智锋 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第7期11-14,共4页

新城疫是影响家禽养殖业的重大动物疫病,建立现场快速分子学检测方法是其防控关键。借助热裂解法抽提病毒RNA,在筛选出最佳核酸染料Calcein的基础上,建立新城疫病毒(NDV)实时荧光反转录环介导等温扩增(rRT-LAMP)检测法,并对该法进行特... 新城疫是影响家禽养殖业的重大动物疫病,建立现场快速分子学检测方法是其防控关键。借助热裂解法抽提病毒RNA,在筛选出最佳核酸染料Calcein的基础上,建立新城疫病毒(NDV)实时荧光反转录环介导等温扩增(rRT-LAMP)检测法,并对该法进行特异性、敏感性及准确性分析。试验结果显示,本试验所建立的NDV-rRT-LAMP方法可有效鉴别NDV,其敏感性可检测至50个基因拷贝,与国家标准实时荧光定量RT-PCR检测法一致;该法特异性强,与AIV、IBV等常见禽呼吸道传染病病原无交叉反应。小规模田间试验显示,该法用于NDV的普查监测,结果可靠。结果表明,建立的NDV-rRT-LAMP检测法可满足NDV现场快速分子检测需求。 展开更多

关键词 新城疫病毒 实时荧光反转录环介导等温扩增 现场检测

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SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立 被引量：1

6

作者 孙秀静 朱圣韬 +1 位作者 徐有青 张澍田 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2009年第6期821-826,共6页

目的构建含有c-myc基因的重组质粒并以其为模板,建立以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测c-myc的标准曲线,为FQ-PCR准确检测c-myc奠定基础。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人食管鳞癌组织的总mRNA... 目的构建含有c-myc基因的重组质粒并以其为模板,建立以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测c-myc的标准曲线,为FQ-PCR准确检测c-myc奠定基础。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人食管鳞癌组织的总mRNA中反转录扩增c-myc cDNA,将纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后挑选阳性克隆重组质粒,分别用PCR扩增、限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切进行鉴定并测序分析。用紫外分光光度计测质粒浓度,计算拷贝数制备FQ-PCR浓度梯度标准品。最后对质粒标准品进行FQ-PCR检测。结果PCR扩增、酶切鉴定及测序分析均证实c-myc重组到pGEM-T Easy载体上。建立了人c-myc标准曲线,其对数与相应的Ct值(循环阈值)具有良好的相关性,相关系数r2=-0.99～-1,斜率为-3.1～-3.6。结论所构建的人c-myc质粒标准品应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏性和特异性高,准确可靠,此方法可作为FQ-PCR检测c-myc基因的标准方法。 展开更多

关键词 SYBR GreenⅠ染料 实时荧光定量 反转录聚合酶链反应 C-MYC基因

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苏太猪肌内脂肪沉积相关基因SRC-1的差异显示反转录PCR鉴定 被引量：1

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作者 薛春阳 汪秀星 +4 位作者 王晓娜 刘红林 徐银学 程占军 陈杰 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期126-129,共4页

采取90头180日龄去势苏太猪的背最长肌组织测定肌内脂肪含量,从中选取肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01)的最高和最低各6头组成RNA池,采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)鉴定两组间差异表达的基因,结果共获得14条表达序列标签(expressed ... 采取90头180日龄去势苏太猪的背最长肌组织测定肌内脂肪含量,从中选取肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01)的最高和最低各6头组成RNA池,采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)鉴定两组间差异表达的基因,结果共获得14条表达序列标签(expressed sequence tags),即EST序列,通过GenBank比对发现其中3条为已知序列。为进一步验证这3个已知基因与肌内脂肪之间的关系,从90个个体中选取肌内脂肪最高和最低各15个个体进行实时定量PCR检测。结果表明,细胞核受体共激活因子1基因(SRC-1)mRNA表达水平与肌内脂肪含量存在负相关关系(r=-0.38,P<0.05)。提示:SRC-1蛋白有可能参与了肌内脂肪沉积的调节。 展开更多

关键词 差异显示反转录PCR 肌内脂肪 实时荧光定量PCR 细胞核受体共激活因子1基因(SRC-1) 苏太猪

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樱桃病毒A实时荧光定量PCR检测技术的建立与应用 被引量：1

8

作者 刘欢 刘格 李锐 《湖北农业科学》 2023年第7期163-169,共7页

在樱桃病毒A(CVA)mp基因保守区域设计了3对检测引物,经特异性筛选后,获得可用于病毒定量研究的引物。制备质粒标准品,建立标准曲线,同时验证该方法的灵敏度和特异性,并应用于田间果树样品CVA定量检测。最终成功筛选出1对检测效率高、特... 在樱桃病毒A(CVA)mp基因保守区域设计了3对检测引物,经特异性筛选后,获得可用于病毒定量研究的引物。制备质粒标准品,建立标准曲线,同时验证该方法的灵敏度和特异性,并应用于田间果树样品CVA定量检测。最终成功筛选出1对检测效率高、特异性强的引物(CVA-dF2、CVA-dR2),基于SYBR Green I荧光染料建立反转录实时荧光定量PCR检测CVA的方法。该方法重复性好、灵敏度高,无需借助内参基因即可准确检测目的病毒载量,绝对定量标准曲线斜率为-3.5746,决定系数R2为0.9986,扩增效率为0.9044,比常规RT-PCR检测灵敏度高10倍。该方法的建立为CVA定量研究提供了有力工具,可用于果树中CVA批量检测或低丰度病毒样品检测。 展开更多

关键词 樱桃病毒A(CVA) 反转录实时荧光定量PCR 快速检测

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转录介导的扩增技术与real-time RT-PCR在人类免疫缺陷病毒检测中的应用

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作者 吴大先 陶淑慧 +3 位作者 刘水平 周杰斌 谭德明 侯周华 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期776-782,共7页

目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚... 目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚合酶及PCR底物等建立TMA扩增体系。通过扩增一组10倍梯度稀释的HIV RNA转录标准品,评价TMA体系的灵敏性。收集60例HIV感染患者的血浆,同时采用TMA试剂与Cobas Amplicor HIV-1 Monitor 1.5版试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用线性回归和Bland-Altman法分析两种技术的相关性和一致性。结果:成功建立了TMA扩增体系,这种技术可以检测低至10 copies/m L的HIV转录标准品。60份HIV感染者血浆样本中,TMA及Cobas均检测到阳性46份,均阴性12份,TMA检测阴性而Cobas检测阳性样本2份,检测一致率为96.7%。两种技术阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中46份TMA检测和Cobas检测均有定量结果的血浆进行线性回归分析,两种技术有非常好的相关性(r=0.997,P<0.001)。Bland-Altman分析显示两种检测方法定量Lg差值平均值为0.02,44份(95.7%)样本在95%的一致性界限内。结论:TMA技术具有高灵敏性潜能。TMA与real-time RT-PCR检测血浆中HIV RNA具有非常好的相关性与一致性。 展开更多

关键词 转录介导的扩增技术 人类免疫缺陷病毒 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 线性回归

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不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒的动态监测

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作者 徐凤霞 孙万里 +3 位作者 张亚文 常爽 王一新 赵鹏 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第4期11-17,共7页

为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感... 为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感染REV模型,同时设置空白对照组,在不同日龄记录各组鸡的体重和死亡情况,并综合运用反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)3种检测方法对各感染组进行REV的动态监测。结果显示:(1)与空白对照组相比,腹腔感染组和卵黄囊感染组SPF鸡体重增长在感染后第21~70天均受到显著抑制(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡的死亡率在感染后第49和63天显著升高(P<0.05),腹腔感染组SPF鸡的死亡率在感染后第42天显著升高(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡血浆中REV病毒载量在感染后第21天显著高于腹腔感染组(P<0.05);(2)卵黄囊感染组SPF鸡自出壳即可检测到病毒血症阳性,并在感染后第21天时达到排毒高峰,腹腔感染组SPF鸡在感染后第14天时达到排毒高峰;(3)卵黄囊感染同居组的10只SPF鸡在感染后第7天时即检测到2只鸡呈病毒血症阳性,腹腔感染同居组SPF鸡在感染后第21天时检测到1只鸡呈阳性;(4)3种检测方法中,RT-qPCR和IFA检出REV效果更好。本试验通过分析不同途径感染REV后鸡群血浆中的带毒状态,为REV感染的科学防控和净化提供参考数据。 展开更多

关键词 禽网状内皮组织增殖病病毒(REV) 排毒规律 反转录PCR(RT-PCR) 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 间接免疫荧光试验(IFA)

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蟾酥醇提物对多重耐药铜绿假单胞菌头孢他啶敏感性的影响

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作者 周鸿威 王成祥 +8 位作者 吕思缘 林英 张悦 刘国星 李磊 王玉婷 郭雨菲 薛贝 于会勇 《世界中医药》 北大核心 2024年第23期3592-3596,共5页

目的:探讨蟾酥醇提物通过铜绿假单胞菌主动外排系统(MexABOprM)对多重耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)头孢他啶敏感性的影响。方法:筛选MexAB-OprM阳性的铜绿假单胞菌菌株,通过肉汤稀释法建立MDRPA体外抑菌实验模型,测定蟾酥醇提物及其联合头... 目的:探讨蟾酥醇提物通过铜绿假单胞菌主动外排系统(MexABOprM)对多重耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)头孢他啶敏感性的影响。方法:筛选MexAB-OprM阳性的铜绿假单胞菌菌株,通过肉汤稀释法建立MDRPA体外抑菌实验模型,测定蟾酥醇提物及其联合头孢他啶时的最小抑菌浓度;蟾酥醇提物干预前后用实时荧光反转录PCR检测MDRPA铜绿假单胞菌主动外排系统MexAB-OprM中mexB、mexR、oprM基因mRNA表达量。结果:蟾酥醇提物对MDRPA的最小抑菌浓度值是6.25 mg/mL。蟾酥醇提物联合头孢他啶的联合指数低于1,两药联合应用时存在相加作用。随蟾酥醇提物浓度升高,MDRPA外排泵MexAB-OprM的mexB、oprM相对表达量降低(P<0.05),mexR相对表达量升高(P<0.05)。结论:蟾酥醇提物通过抑制MexABOprM外排泵的表达提高MDRPA对头孢他啶的敏感性。 展开更多

关键词 蟾酥醇提物 多重耐药铜绿假单胞菌 体外抑菌 肉汤稀释法 实时荧光反转录聚合酶链反应 铜绿假单胞菌主动外排系统 抗耐药作用 逆转外排泵机制

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蓝莓叶总黄酮的体外抗炎功效评价 被引量：21

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作者 赵丹 苏宁 +3 位作者 杨丽 郑洪艳 霍彤 王昌涛 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第17期231-235,共5页

目的:通过体外实验方法从分子水平对蓝莓叶总黄酮的抗炎功效进行评价。方法:建立人永生化表皮细胞HaCaT与蓝莓叶总黄酮的共培养体系,利用反转录实时荧光定量聚合酶链式反应检测在不同培养时间点(0、15、30、60、120 min)白细胞介素-6(in... 目的:通过体外实验方法从分子水平对蓝莓叶总黄酮的抗炎功效进行评价。方法:建立人永生化表皮细胞HaCaT与蓝莓叶总黄酮的共培养体系,利用反转录实时荧光定量聚合酶链式反应检测在不同培养时间点(0、15、30、60、120 min)白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-8、干扰素诱导蛋白-10(interferon-inducible protein-10,IP-10)等炎症细胞因子相关基因表达情况,观察蓝莓叶总黄酮的添加对这些基因表达的影响,并探讨蓝莓叶总黄酮在分子水平上的抗炎机理。结果:蓝莓叶总黄酮的添加能够提高抗炎因子IL-6、CXCR-2基因的表达量(P<0.05),降低促炎因子IL-8、IP-10基因的表达量(P<0.05),对CXCR-1基因的表达呈复杂型调节。结论:蓝莓叶总黄酮通过对炎症相关因子表达量产生影响,从而减弱促炎症反应,增强抗炎症反应,最终发挥抗炎功效。 展开更多

关键词 蓝莓叶总黄酮 炎症因子 反转录实时荧光定量聚合酶链式反应 抗炎

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豇豆花叶病毒和黑眼豇豆花叶病毒RT-Realtime PCR及IC-RT-Realtime PCR检测方法研究 被引量：3

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作者 李彬 粟寒 +3 位作者 李艳华 缪爱斌 吴翠萍 安榆林 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期105-109,共5页

建立了豇豆两种种传病毒豇豆花叶病毒(CPMV)和黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)RT-Realtime PCR检测方法以及双重RT-Realtime PCR检测方法。在此基础上,根据免疫学抗原抗体特异性吸附的特点,建立了CPMV和BlCMV免疫捕获反转录荧光定量(IC-RT-Real... 建立了豇豆两种种传病毒豇豆花叶病毒(CPMV)和黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)RT-Realtime PCR检测方法以及双重RT-Realtime PCR检测方法。在此基础上,根据免疫学抗原抗体特异性吸附的特点,建立了CPMV和BlCMV免疫捕获反转录荧光定量(IC-RT-Realtime)PCR检测方法以及双重IC-RT-Realtime PCR检测方法。该单重及双重IC-RT-Real-time PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点,适用于豆类种苗中对CPMV和BlCMV的检测。 展开更多

关键词 豇豆花叶病毒 黑眼豇豆花叶病毒 免疫捕获反转录实时荧光PCR 双重反转录实时荧光PCR

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碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外排泵和外膜孔蛋白表达水平的研究 被引量：12

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作者 李红玲 廖康 +2 位作者 陈亚岗 俞云松 李兰娟 《中国感染与化疗杂志》 CAS 2008年第6期414-418,共5页

目的探讨我国临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外排泵MexAB-OprM和外膜孔蛋白OprD2表达水平及其与碳青霉烯类抗生素耐药性之间的关系。方法收集我国15个省市28所医院临床分离的铜绿假单胞菌655株,琼脂稀释法测定该菌加入外... 目的探讨我国临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外排泵MexAB-OprM和外膜孔蛋白OprD2表达水平及其与碳青霉烯类抗生素耐药性之间的关系。方法收集我国15个省市28所医院临床分离的铜绿假单胞菌655株,琼脂稀释法测定该菌加入外排泵抑制剂羟基氰氯苯腙(CCCP)前后对亚胺培南和美罗培南的MIC;RT-PCR检测外排泵MexAB-OprM和孔蛋白OprD2的表达水平;十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western-blot)检测外膜孔蛋白OprD2。结果收集到的655株铜绿假单胞菌菌株对亚胺培南和美罗培南敏感率分别为52.5%和59.2%,加入CCCP前后其对亚胺培南和美罗培南的敏感率无明显变化;52.0%(51/98)美罗培南耐药株MexAB-OprM显著高表达(P<0.05),43.7%(59/135)亚胺培南耐药株OprD2显著低表达(P<0.05),14.8%(20/135)亚胺培南耐药株OprD2表达缺失;SDS-PAGE和Western-blot显示与标准菌株PAO1相比,OprD2表达水平减低菌株ZZ20显影减低,表达缺失菌株BJ1不显影。结论MexAB-OprM表达升高和OprD2表达降低甚至缺失是我国铜绿假单胞菌对美罗培南和亚胺培南耐药的重要机制。 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 外排泵 外膜孔蛋白 羟基氰氯苯腙 实时荧光定量反转录聚合酶链反应

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一种豇豆重花叶病毒IC-RT real-time PCR检测方法的建立 被引量：3

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作者 李彬 粟寒 +2 位作者 吴翠萍 周明华 安榆林 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期491-496,共6页

为建立豇豆重花叶病毒(Cowpeasevere mosaic virus,CPSMV)免疫捕获-反转录-实时荧光(IC-RTreal-time)PCR分子检测方法,利用从ATCC和DSMZ引进的CPSMV标准毒株,先建立CPSMVRTreal-time PCR检测方法;在此基础上,建立用于CPSMV检测的IC-RTre... 为建立豇豆重花叶病毒(Cowpeasevere mosaic virus,CPSMV)免疫捕获-反转录-实时荧光(IC-RTreal-time)PCR分子检测方法,利用从ATCC和DSMZ引进的CPSMV标准毒株,先建立CPSMVRTreal-time PCR检测方法;在此基础上,建立用于CPSMV检测的IC-RTreal-time PCR方法.结果表明:IC-RTreal-time PCR方法的灵敏度可达500 pg叶组织;该方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便等优点,省去了RNA的提取过程,适用于豇豆等豆类种子及种苗中对豇豆重花叶病毒的快速检测. 展开更多

关键词 豇豆重花叶病毒 免疫捕获反转录 实时荧光PCR

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18srDNA为内参照的Real-Time-PCR方法检测半夏病毒 被引量：2

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作者 何煜波 陈集双 +2 位作者 陈海敏 冯俊丽 高必达 《湖南师范大学自然科学学报》 EI CAS 北大核心 2006年第3期103-106,共4页

利用实时荧光PCR方法,以18srRNA为内参照,对半夏植株及相应组培苗携带的黄瓜花叶病毒(Cu-cumber Mosaic Virus,CMV)含量进行了相对定量检测.并以DAS-ELISA和RT-PCR方法检测结果相比较.结果表明,相比原始植株,组培苗的病毒含量大大降低.... 利用实时荧光PCR方法,以18srRNA为内参照,对半夏植株及相应组培苗携带的黄瓜花叶病毒(Cu-cumber Mosaic Virus,CMV)含量进行了相对定量检测.并以DAS-ELISA和RT-PCR方法检测结果相比较.结果表明,相比原始植株,组培苗的病毒含量大大降低.以带病毒半夏母株为外植体培养的组培苗,其病毒含量以叶片中的相对较高,在块茎和愈伤组织中病毒相对较低.而ELISA方法在检测病毒含量低的样品时有假阴性结果;RT-PCR方法灵敏度可靠但不适宜精确量化. 展开更多

关键词 实时荧光PCR 黄瓜花叶病毒 反转录-PCR 双夹心酶联免疫反应 半夏

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湿疹患者外周血白细胞介素-21和B细胞淋巴瘤因子-6 mRNA的表达和临床意义 被引量：4

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作者 常晓萍 陈宏 温静 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期660-663,共4页

目的:探讨滤泡性辅助性T细胞的主要效应因子白细胞介素(IL)-21和B细胞淋巴瘤因子(Bcl)-6在湿疹患者外周血中的表达及意义。方法:采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),检测60例湿疹患者和40例健康者外周血IL-21和Bcl-6 mRNA的... 目的:探讨滤泡性辅助性T细胞的主要效应因子白细胞介素(IL)-21和B细胞淋巴瘤因子(Bcl)-6在湿疹患者外周血中的表达及意义。方法:采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),检测60例湿疹患者和40例健康者外周血IL-21和Bcl-6 mRNA的表达量并进行临床分析。结果:湿疹患者外周血中IL-21和Bcl-6 mRNA的表达水平明显低于健康者(P<0.05),与湿疹面积及严重度指数(EASI)评分及嗜酸性粒细胞计数呈负相关(P<0.001),与患者年龄、白细胞计数无明显相关性(P>0.05)。不同性别的湿疹患者外周血中IL-21和Bcl-6 mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)。不同分型湿疹患者外周血中IL-21和Bcl-6 mRNA的表达水平差异均有统计学意义,其中急性湿疹组低于亚急性湿疹组和慢性湿疹组,亚急性湿疹组低于慢性湿疹组(P<0.05)。经过综合治疗2周及4周后,湿疹患者外周血中IL-21和Bcl-6 mRNA的表达水平比治疗前及治疗后2周均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。湿疹患者外周血中IL-21和Bcl-6 m RNA的表达呈正相关(P=0.001)。结论:湿疹患者中存在IL-21和Bcl-6 mRNA的表达异常,提示这2个细胞因子可能参与了湿疹的发病过程。 展开更多

关键词 湿疹 白细胞介素-21 B细胞淋巴瘤因子6 Tfh细胞 实时荧光定量反转录聚合酶链式反应 EASI评分

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米蛾β-actin基因cDNA片段的克隆及表达量检测

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作者 丛斌 张明珠 +4 位作者 胡志凤 段立佳 王晓静 张统书 董辉 《沈阳农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期24-28,共5页

为克隆米蛾[Corcyra cephalonica(Stainton)]β-actin基因cDNA片段,建立米蛾β-actin基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,并评估其在实时荧光定量研究中作为内参基因的可靠性,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得米蛾β-actin基因cDNA片段... 为克隆米蛾[Corcyra cephalonica(Stainton)]β-actin基因cDNA片段,建立米蛾β-actin基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,并评估其在实时荧光定量研究中作为内参基因的可靠性,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得米蛾β-actin基因cDNA片段,采用SYBR GreenⅠ染料法建立qRT-PCR方法,检测在米蛾卵、幼虫、蛹和成虫4个虫态中β-actin基因的表达量。获得了长为822bp的米蛾β-actin基因片段(Gen Bank accession:KJ599569),编码273个氨基酸残基;荧光定量标准曲线的Ct值检测范围为13~28,扩增效率为90.1%,相关系数R^2=0.992,溶解曲线分析结果显示产物为特异的单峰,其Tm值为(84±0.5)℃,符合定量要求;实时荧光定量结果表明,β-actin基因在米蛾不同发育历期中的表达水平无显著性差异(p>0.05)。成功建立了米蛾β-actin基因qRT-PCR方法 ,β-actin基因可以作为米蛾基因表达定量研究中的可靠内参基因。研究结果为β-actin作内参基因进行米蛾功能基因表达差异研究奠定了分子基础。 展开更多

关键词 米蛾 Β-ACTIN基因 反转录PCR 实时荧光定量PCR

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阿魏酸对粪肠球菌和屎肠球菌产酪胺机制的影响 被引量：9

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作者 薛林林 王远 +2 位作者 李彬彬 王庆玲 卢士玲 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第22期33-38,共6页

研究阿魏酸对高产酪胺的粪肠球菌XL-M66和屎肠球菌XL-M76生长、基因表达以及产酪胺的影响。利用反转录实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析2株菌在阿魏酸作用下的酪氨酸脱羧途径相关基因表达情况,并使用高效液相色谱法检测2株肠球菌培养... 研究阿魏酸对高产酪胺的粪肠球菌XL-M66和屎肠球菌XL-M76生长、基因表达以及产酪胺的影响。利用反转录实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析2株菌在阿魏酸作用下的酪氨酸脱羧途径相关基因表达情况,并使用高效液相色谱法检测2株肠球菌培养48 h期间酪胺积累量。结果表明:未添加酪氨酸底物时,阿魏酸对酪氨酸脱羧酶(tyrosine decarboxylase,tyrDC)和酪氨酸/酪胺透性酶(tyrosine/tyramine permease,tyrP)基因的转录影响不大(P>0.05),但能促进酪氨酰-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase,tyrS)基因的转录(P<0.05)。反之存在酪氨酸时,阿魏酸对tyrS基因表达的影响不大(P>0.05),却能显著抑制tyrDC和tyrP基因的表达(P<0.05)。同时,阿魏酸能显著抑制粪肠球菌XL-M66和屎肠球菌XL-M76的生长(P<0.05),最终使得酪胺产量分别降低27.0%和19.9%。 展开更多

关键词 阿魏酸 屎肠球菌 粪肠球菌 酪胺 酪氨酸脱羧酶 反转录实时荧光定量聚合酶链式反应

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嗜酸乳杆菌在初始弱酸碱条件下对HT-29细胞免疫因子的调节作用 被引量：7

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作者 张秋月 王刚 +4 位作者 陈坤朋 潘道东 曾小群 吴振 郭宇星 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第19期191-197,共7页

为探究嗜酸乳杆菌对人体肠道细胞的免疫调节作用,将pH 5.5和pH 7.5条件下培养的具有不同黏附特性的嗜酸乳杆菌与人结肠癌细胞HT-29共同培养,测定其免疫因子的变化。通过反转录实时荧光定量聚合酶链式反应检测了热休克蛋白70(heat shock ... 为探究嗜酸乳杆菌对人体肠道细胞的免疫调节作用,将pH 5.5和pH 7.5条件下培养的具有不同黏附特性的嗜酸乳杆菌与人结肠癌细胞HT-29共同培养,测定其免疫因子的变化。通过反转录实时荧光定量聚合酶链式反应检测了热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)、白细胞介素(interleukin,IL)-8、IL-10、核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)、Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR-4)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因的相对表达量,采用酶联免疫吸附测定了免疫因子IL-8、IL-10和TNF-α蛋白的表达情况。结果表明,HT-29细胞与两种pH值条件下的嗜酸乳杆菌共同培养后,在转录水平上,较空白对照组均呈现出Hsp70和TNF-α基因表达的极显著上调,IL-8、NF-κB和TLR-4基因表达的极显著下调(P<0.01)。pH 7.5组与pH 5.5组对比,Hsp70、IL-10和TNF-α的基因表达显著上调,NF-κB和TLR-4的基因表达显著下调(P<0.05);在两种pH值条件下,HT-29细胞的TNF-α质量浓度极显著高于空白对照组,而IL-8的质量浓度极显著降低,并且pH 7.5组的IL-10质量浓度极显著高于pH 5.5组(P<0.01)。综上,弱酸、弱碱性肠道条件下的嗜酸乳杆菌能促进肠道细胞免疫,且pH 7.5的弱碱性肠道环境与pH 5.5的弱酸性肠道环境相比,更能显著增强嗜酸乳杆菌对肠道的免疫效应,维护肠道健康。 展开更多

关键词 嗜酸乳杆菌 HT-29细胞 免疫因子 反转录实时荧光定量聚合酶链式反应 酶联免疫吸附测定

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