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四步法消除SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR中引物二聚体的影响 被引量：47
1
作者 张驰宇 张高红 +1 位作者 杨敏 贲昆龙 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期387-392,共6页
为建立一种新的SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR方法 ,使之能够有效消除引物二聚体 (PDs)对实时定量结果的影响 .对RT PCR特异性扩增产物和PDs分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析 .依据PDs和扩增产物的熔解温度 (Tm)特点 ,在通用的三步法... 为建立一种新的SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR方法 ,使之能够有效消除引物二聚体 (PDs)对实时定量结果的影响 .对RT PCR特异性扩增产物和PDs分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析 .依据PDs和扩增产物的熔解温度 (Tm)特点 ,在通用的三步法的延伸步骤之后 ,增加一个短暂的 (5s)恒温和荧光检测步骤 ,使这个步骤的温度高于PDs的Tm,但低于扩增产物的Tm,简称该法为四步法 .PDs的Tm 通常高于 72℃ ,但低于扩增产物的Tm .将四步法第四步的温度设置在高于PDs的Tm ,但低于扩增产物的Tm 时 ,四步法能够有效地消除PDs的影响 .对三步法和四步法SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR进行了比较 ,发现三步法根本不能用于RNA的实时定量 ,而四步法能够实现包括低丰度RNA在内的RNA的定量 .选择Tm 值尽可能小的引物 ,使PDs与扩增产物Tm 值之间有足够的差距 ,将更有利于四步法的应用 。 展开更多
关键词 引物二聚体 荧光实时定量rt-pcr SYBR green Ⅰ 四步法 RNA定量
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实时定量RT-PCR方法检测太平洋牡蛎中的诺沃克样病毒 被引量：5
2
作者 岳志芹 汪俊 +5 位作者 梁成珠 雷质文 高宏伟 徐彪 朱来华 薛长湖 《海洋科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期1-4,共4页
建立了Taqman实时定量RT-PCR方法检测诺沃克样病毒(Norwalk-like Virus,NLV)的方法,并对中国的牡蛎样品进行了分析。选取GⅡ型NLV的RNA聚合酶区域,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针,建立了定量RT-PCR反应体系。将含有NLV扩增... 建立了Taqman实时定量RT-PCR方法检测诺沃克样病毒(Norwalk-like Virus,NLV)的方法,并对中国的牡蛎样品进行了分析。选取GⅡ型NLV的RNA聚合酶区域,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针,建立了定量RT-PCR反应体系。将含有NLV扩增片段的质粒10倍梯度稀释,作为标准品进行反应以确定检测灵敏度并制备标准曲线。结果表明,质粒密度在6×106,6×105,6×104,6×103,6×102,6×101,6个拷贝之间,共7个数量级的范围内,定量RT-PCR反应都有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为6个拷贝。制备的标准曲线中,病毒拷贝数(X)与Ct值的关系为Ct=-3.36lgX+37.11,相关系数R2=0.998。对中国37批太平洋牡蛎(Crassostrea gigas Thunberg)样品进行了定量检测,有6批样品为阳性,并根据标准曲线测定了NLV的含量。 展开更多
关键词 牡蛎 诺沃克样病毒(Norwalk-like virus NLV) 实时定量rt-pcr TAQMAN探针
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实时定量RT-PCR监测造血干细胞移植前后CML28mRNA表达 被引量：4
3
作者 张东华 戴敏 +5 位作者 周红升 汪涯雅 张路 张丽 王斌 曹文静 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2005年第5期843-847,共5页
本研究的目的在于建立检测CML28mRNA的SYBRGreenI实时定量PCR(RQPCR)的方法,并探讨CML28表达水平与异基因造血干细胞移植(AlloHSCT)后白血病复发之间的相关性,为此构建了pcDNA3.1HisACML28质粒作为定量模板,选择14例白血病患者进行研究... 本研究的目的在于建立检测CML28mRNA的SYBRGreenI实时定量PCR(RQPCR)的方法,并探讨CML28表达水平与异基因造血干细胞移植(AlloHSCT)后白血病复发之间的相关性,为此构建了pcDNA3.1HisACML28质粒作为定量模板,选择14例白血病患者进行研究。14例患者包括:10例慢性髓系白血病(CML),3例急性髓系白血病(AML),1例Ph阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)。应用RocheLightCyclerPCR仪动态监测患者移植前后不同时间段的50份骨髓单个核细胞中CML28表达水平。研究结果表明:RQPCR的灵敏度为10-4(0.05ng)水平,标准品日间差及日内差均小于10%,重复性好。初治组中AML和CML加速期(CMLAP)与急变期(CMLBC)患者CML28呈高表达(6.58±2.34)×10-2,预处理前组CML28水平为(2.19±0.32)×10-2,移植后1月组CML28水平为(1.35±1.28)×10-2,移植后3月及以后组(以下简称移植后3月组)CML28水平为(4.57±6.39)×10-3。定期随访表明,3例CMLAP或BC患者与1例CML慢性期(CMLCP)患者,在AlloHSCT3个月后检测仍呈阳性,其中2例CML28mRNA的水平<2×10-2,获无病生存;2例CML28水平>2×10-2者,一年内均出现复发,其中1例死亡,另1例行第2次AlloHSCT后CML28水平虽然迅速下降,但仍>2×10-2,2个月后再次复发。结论:CML28水平与疾病的演变过程存在良好的相关性,对于造血干细胞移植受者,动态监测CML28水平比单一的结果价值更大,实时定量检测移植后CML28水平对预测白血病复发有一定的意义。 展开更多
关键词 白血病 ALLO-HSCT CML28 实时定量rt-pcr SYBR Green Ⅰ
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一步法SYBR Green实时定量RT-PCR检测坦布苏病毒方法的建立 被引量：7
4
作者 刘青涛 李银 +5 位作者 赵冬敏 刘宇卓 黄欣梅 杨婧 韩凯凯 安凤娇 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第4期829-833,共5页
为建立快速检测坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）的一步法SYBRGreen实时定量RT-PCR方法，本研究根据TMUVNS2A基因的保守序列，设计并合成了1对特异性引物，以体外转录的NS2A基因作为标准品，采用一步法实时定量RT-PCR方法检测TMUV。... 为建立快速检测坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）的一步法SYBRGreen实时定量RT-PCR方法，本研究根据TMUVNS2A基因的保守序列，设计并合成了1对特异性引物，以体外转录的NS2A基因作为标准品，采用一步法实时定量RT-PCR方法检测TMUV。结果显示该方法标准曲线的决定系数为0．997，具有良好的线性关系；灵敏度为1ul10拷贝，是常规RT-PCR方法的100倍；并且与其他病毒无交叉反应，批内和批间变异系数分别为0．11％～0．30％和0．88％～1．31％，具有良好的特异性和稳定性。该方法对于TMUV人工感染鸭泄殖腔棉拭子的检测阳性率为100％，而常规RT-PCR检测的阳性率只有71％。因此，本研究所建立的一步法实时定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性、特异性好，可以用于TMUV的临床检测。 展开更多
关键词 坦布苏病毒 实时定量rt-pcr NS2A基因
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实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合基因 被引量：7
5
作者 郎丽 李惠民 +2 位作者 刘华 王义民 张学美 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2007年第4期714-719,共6页
本研究旨在建立用实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARa mRNA的方法,探讨APLPML-RARa融合基因表达水平与疗效的关系。用RT-PCR扩增培养的NB4细胞的PML-RARa融合基因,取1μgNB4细胞的总cDNA进行10倍的梯度稀释,作为标准... 本研究旨在建立用实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARa mRNA的方法,探讨APLPML-RARa融合基因表达水平与疗效的关系。用RT-PCR扩增培养的NB4细胞的PML-RARa融合基因,取1μgNB4细胞的总cDNA进行10倍的梯度稀释,作为标准品,建立荧光定量RT-PCR方法,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行了测定。定量检测4例急性早幼粒细胞白血病(APL)患者治疗前后骨髓内PML-RARa融合基因转录本水平,并对1例经治疗完全缓解后又复发的患者PML-RARa转录本水平(拷贝数)进行动态监测。结果表明:用本研究建立的实时定量RT-PCR方法可检测出10-5μgNB4细胞cDNA中的PML-RARa融合基因,其重复性的CT值,管间、批间变异系数(CV)分别为2.1%、3.8%。4例患者初治骨髓PML-RARa基因转录本水平的分别为1884、5533、1803、4677拷贝,平均为3475拷贝。经ATRA+化疗治疗后其PML-RARa基因转录水平下降至40、135、79、229拷贝,平均为121拷贝。还有1例患者治疗前PML-RARa基因转录本水平为8600拷贝,经过4个月治疗,虽然此时患者处于完全缓解期,但其转录水平拷贝数仍有730。3个月后患者出现复发,转录本水平升至为11000拷贝。经过ATRA+化疗治疗后转录本水平又逐渐下降至1200拷贝。结论;建立的实时定量RT-PCR灵敏、重复性好。治疗后APL患者的PML-RARa融合基因转录本水平明显下降,复发时基因转录本水平又升高。融合基因表达水平的改变与临床疾病进展关系一致,这有助于监测白血病微小残留病,评价疗效及判断预后。 展开更多
关键词 实时定量rt-pcr 急性早幼粒细胞白血病 PML/RARa融合基因 微小残留病灶
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对虾Taura综合症病毒Taqman实时定量RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量：4
6
作者 岳志芹 刘荭 +5 位作者 梁成珠 高宏伟 雷质文 徐彪 朱来华 江育林 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期141-144,共4页
建立了Taqman实时定量RT-PCR方法检测对虾的Taura综合症病毒(Taura syndrome virus,TSV)。选取TSV基因组的保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针,扩增产物长度为73bp。以含有TSV目的扩增片段的质粒为标准品,进行实时定量R... 建立了Taqman实时定量RT-PCR方法检测对虾的Taura综合症病毒(Taura syndrome virus,TSV)。选取TSV基因组的保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针,扩增产物长度为73bp。以含有TSV目的扩增片段的质粒为标准品,进行实时定量RT-PCR反应,结果表明质粒DNA在6～6×106个拷贝,共7个数量级的范围内有"S"型扩增曲线。根据病毒拷贝数与Ct值制备了标准曲线,可以用于病毒的定量分析。该方法的检测灵敏度为6个病毒粒子。该方法的重现性好,组内的实验变异系数为0.04%～2.70%,组间实验变异系数为0.92%～4.67%。引物和探针对于对虾基因组RNA、黄头病毒RNA都没有扩增反应,表现出良好的特异性。实时定量RT-PCR检测TSV方法的建立,对于虾病的临床诊断及流行病学研究具有重要意义。 展开更多
关键词 TSV 实时定量rt-pcr TAQMAN探针
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猪捷申病毒TaqMan实时定量RT-PCR方法的建立 被引量：5
7
作者 胡峰 赵亚荣 +4 位作者 吕超超 王贵华 崔玉东 王春仁 崔尚金 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期206-210,共5页
为建立猪捷申病毒(PTV)的早期检测及定量分析方法,本研究基于PTV 11个血清型基因组5'端非编码区保守序列,设计引物和TaqMan探针,建立了检测PTV的TaqMan实时定量RT-PCR方法。应用该方法对PTV、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、... 为建立猪捷申病毒(PTV)的早期检测及定量分析方法,本研究基于PTV 11个血清型基因组5'端非编码区保守序列,设计引物和TaqMan探针,建立了检测PTV的TaqMan实时定量RT-PCR方法。应用该方法对PTV、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒以及猪瘟病毒进行特异性试验,结果除PTV为阳性外其它均为阴性;针对PTV最低可检测到10个拷贝;批内、批间重复试验的变异系数均小于3%。应用建立的方法与病毒分离方法分别对91份临床样品进行检测,检出率分别为79.12%和57.14%,两者的符合率是78.02%。经临床应用表明,该实时定量RT-PCR方法可为PTV的早期诊断及定量分析提供技术手段。 展开更多
关键词 猪捷申病毒 实时定量rt-pcr TAQMAN
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应用实时定量RT-PCR技术检测β地中海贫血珠蛋白基因的表达 被引量：3
8
作者 韩俊英 曾瑞萍 +3 位作者 程钢 胡彬 李虎 赖永榕 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期57-64,共8页
为了定量检测β地中海贫血(β地贫)的α、β和γ珠蛋白基因表达水平,提取正常成人对照组、正常胎儿对照组和β地贫患者组组成的样本DNA,采用反向点杂交法(RDB)分析β地贫各种突变类型;提取样本RNA用于进行针对α、β和γ珠蛋白基因的荧... 为了定量检测β地中海贫血(β地贫)的α、β和γ珠蛋白基因表达水平,提取正常成人对照组、正常胎儿对照组和β地贫患者组组成的样本DNA,采用反向点杂交法(RDB)分析β地贫各种突变类型;提取样本RNA用于进行针对α、β和γ珠蛋白基因的荧光实时定量RT PCR(FQRT PCR)。根据FQRT PCR原理,设计合成分别对应于α、β和γ珠蛋白基因的3对引物和3条荧光探针,FQRT PCR在ABI7700系统进行。用SPSS10.0对实验数据进行统计学分析,分别计算正常对照组(βA/βA,αα/αα),脐带血组(βA/βA,αα/αα),轻型β地贫组(βT/βA,αα/αα),重型β地贫组(βT/βT,αα/αα)的α、β和γmRNA比值,其中α/β分别为4.62±1.20、7.81±2.89、13.51±5.12、188 24±374 04;α/(β+γ)分别为4 43±1 17、0 56±0 49、9 62±4 37、2 14±1 58;γ/(β+γ)分别为0 04±0 03、0 92±0 06、0 28±0 18、0 95±0 04。由于组与组之间均值变异范围较大,将其进行对数转换后再进行方差分析。结果表明:α/β与α/(β+γ)在所有组与组之间均有显著性差异。γ/(β+γ)除了在脐带血组和重型β地贫组之间无显著性差异外,在其他组与组之间均有显著性差异。实验说明。 展开更多
关键词 β地中海贫血/遗传学 珠蛋白基因 基因表达 实时定量rt-pcr
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猪IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的TaqMan实时定量RT-PCR检测体系的建立 被引量：2
9
作者 马玉媛 郭逸 +5 位作者 颜奇坡 叶小丽 张启模 郑霖 田克恭 章金刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期285-288,共4页
为了解猪体内细胞免疫应答机制,本研究建立猪细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的TaqMan实时定量RT-PCR检测体系。以五指山小型猪cDNA为模板,扩增IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的基因保守区,构建相应的重组质粒,并将其作为标准品构建标准... 为了解猪体内细胞免疫应答机制,本研究建立猪细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的TaqMan实时定量RT-PCR检测体系。以五指山小型猪cDNA为模板,扩增IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的基因保守区,构建相应的重组质粒,并将其作为标准品构建标准曲线。结果显示,各标准曲线的相关系数r值均大于0.990,扩增效率为90%～105%;该检测方法的敏感性较高,IL-4检测下限为1copies/μL,IL-2、IL-10及IFN-γ检测下限达为102copies/μL;重复性较好,批内重复试验与批间重复试验变异系数均小于5%。本研究为病毒感染后猪体内免疫应答等研究提供方法。 展开更多
关键词 细胞因子 实时定量rt-pcr 细胞免疫
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实时定量RT-PCR检测肝癌miRNA表达中内参的选择 被引量：2
10
作者 党裔武 陈罡 容敏华 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1102-1106,共5页
目的探讨肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织采用实时定量RT-PCR(RT-qPCR)技术检测miRNA表达最佳内参的选择。方法采用实时RT-qPCR技术检测7个内参RNU6B、RNU48、RNU66、RNU44、RNU43、5s rRNA和18s rRNA在70例HCC及相应癌旁肝组... 目的探讨肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织采用实时定量RT-PCR(RT-qPCR)技术检测miRNA表达最佳内参的选择。方法采用实时RT-qPCR技术检测7个内参RNU6B、RNU48、RNU66、RNU44、RNU43、5s rRNA和18s rRNA在70例HCC及相应癌旁肝组织中的表达。并使用NormFinder及geNorm软件分析最优化的内参。结果 7个内参表达结果存在差异。NormFinder及geNorm软件均显示RNU6B+RNU48组合为肝组织的最佳内参。结论使用实时定量RT-qPCR研究目标miRNA相对定量表达时,为保证数据的精确性和客观性,在实验前对内参进行慎重的筛选是必不可少的。NormFinder及geNorm软件可用于各种实验因素下适宜内参的选择。 展开更多
关键词 肝肿瘤 miRNA 内参 实时定量rt-pcr NORMFINDER GENORM
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拟黑多刺蚁mAchR基因发育表达的荧光实时定量RT-PCR检测 被引量：2
11
作者 吕淑敏 姜鸣 +1 位作者 卜翠萍 奚耕思 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2010年第12期161-166,共6页
【目的】研究毒蕈碱型乙酰胆碱受体(Muscarinic cholinergic receptor,mAchR)在拟黑多刺蚁个体发育中的表达情况,探讨其是否参与拟黑多刺蚁的个体发育行为。【方法】采用SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法,检测拟黑多刺蚁卵、幼虫、蛹和成... 【目的】研究毒蕈碱型乙酰胆碱受体(Muscarinic cholinergic receptor,mAchR)在拟黑多刺蚁个体发育中的表达情况,探讨其是否参与拟黑多刺蚁的个体发育行为。【方法】采用SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法,检测拟黑多刺蚁卵、幼虫、蛹和成虫个体发育阶段mAchR基因mRNA的相对表达量。【结果】mAchR基因在拟黑多刺蚁整个发育过程及各个品级成虫中均有表达。在卵期mAchR mRNA的表达量较幼虫期和蛹期高,而成虫期的表达量最高,可达卵期的3倍以上。3个成虫品级之间,工蚁的表达量最高,雄蚁和雌蚁的表达量在统计学上差异不显著。【结论】mAchR基因参与了拟黑多刺蚁的发育行为,而其主要功能可能是在调节成虫更为复杂的行为中起作用。 展开更多
关键词 拟黑多刺蚁 毒蕈碱型乙酰胆碱受体 实时定量rt-pcr 发育表达
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用裂解法获得有核细胞进行实时定量RT-PCR的可行性研究 被引量：1
12
作者 李玲娣 秦亚溱 +1 位作者 李金兰 刘艳荣 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2011年第2期477-479,共3页
本研究比较裂解法获得的有核细胞与分层法获得的单个核细胞进行实时定量RT-PCR(RQ-PCR)的结果之间是否存在差异性。14例白血病患者(AML-M2 7例,APL 1例,AML M4Eo 1例,AML M4 1例,AML M6 1例,CML 3例)的骨髓标本,分别分成两等份,并分别... 本研究比较裂解法获得的有核细胞与分层法获得的单个核细胞进行实时定量RT-PCR(RQ-PCR)的结果之间是否存在差异性。14例白血病患者(AML-M2 7例,APL 1例,AML M4Eo 1例,AML M4 1例,AML M6 1例,CML 3例)的骨髓标本,分别分成两等份,并分别采用分层法和裂解法获得细胞提取RNA进行实时定量RT-PCR,均检测ABL内参基因,并分别检测3份BCR-ABL(P210)、6份AML-ETO、1份CBFβ-MHY11、5份WT1及6份PRAME mRNA水平。结果显示:①28份样本ABL的拷贝数均>3×104,14对标本之间的内参基因ABL拷贝数没有显著性差异(p>0.05),因此两种方法均能保证RQ-PCR足够的敏感性。②14对标本检测的各目的基因mRNA水平亦没有显著性差异(p>0.05),说明两种方法最终得到的mRNA表达水平基本一致,对RQ-PCR结果没有影响。结论:采用裂解法获得有核细胞提取RNA是一种可行的方法,适用于同时提取大量标本RNA并进行RQ-PCR测定白血病特异基因的临床常规检测中。 展开更多
关键词 裂解法 分层法 实时定量rt-pcr
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猪瘟病毒Taqman实时定量RT-PCR检测方法的建立和临床应用 被引量：1
13
作者 毛立 李文良 +1 位作者 李彬 江杰元 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第4期783-786,共4页
根据猪瘟病毒5'非编码区(5'-UTR)设计特异性引物和Taqman探针,建立Taqman实时定量RT-PCR检测猪瘟病毒法。检测结果显示,该方法的灵敏度为1μl 10拷贝,在病毒拷贝数为1μl 108～101时,循环数(Ct)值与拷贝数对数呈现较好的线性关... 根据猪瘟病毒5'非编码区(5'-UTR)设计特异性引物和Taqman探针,建立Taqman实时定量RT-PCR检测猪瘟病毒法。检测结果显示,该方法的灵敏度为1μl 10拷贝,在病毒拷贝数为1μl 108～101时,循环数(Ct)值与拷贝数对数呈现较好的线性关系,且重复性好,批间变异系数小于1%。用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒,结果均为阴性。用该方法检测采集自江苏和新疆的192份组织和血清样品,猪瘟病毒阳性率为71.9%;检测感染猪的不同脏器,发现在心、肺、肝、肾、脑、脾脏、淋巴结、腹水中均可以检测到猪瘟病毒,与常规RT-PCR方法相比,该方法敏感性更高。该方法的建立为猪瘟病毒的流行病学调查和定量提供了有效手段。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 实时定量rt-pcr 临床应用
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牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-PCR检测技术的建立及初步应用 被引量：4
14
作者 任艳 陈创夫 +5 位作者 乔军 王鹏雁 盛金良 王远志 张沾 李臻 《畜牧兽医杂志》 2010年第5期4-7,共4页
以牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的保守基因5＇-非编码区为参考,设计、优化一对特异的荧光定量PCR引物,应用Smart CycleⅡ分析系统,结合Eva Green荧光染料结合原理,建立一种快速、定量检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范... 以牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的保守基因5＇-非编码区为参考,设计、优化一对特异的荧光定量PCR引物,应用Smart CycleⅡ分析系统,结合Eva Green荧光染料结合原理,建立一种快速、定量检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为101~106copies/μL,相关系数为R2=0.997,扩增效率为E=0.78。灵敏性比常规PCR高102倍。该方法具有良好的特异性,检测变异系数低于1%。应用本实验建立的方法检测25份不同地区采集的临床症状疑似BVDV感染的牛粪样品,阳性检出率为72%（18/25）,与病毒分离培养和电检观察相比,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,为实验室快速、准确检测BVDV奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 实时定量rt-pcr 检测
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实时定量RT-PCR检测鱼类传染性造血器官坏死病毒方法的建立与应用 被引量：26
15
作者 岳志芹 刘荭 +4 位作者 梁成珠 高宏伟 徐彪 邓明俊 江育林 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期91-95,共5页
建立了Taqman实时定量RT-PCR方法检测传染性造血器官坏死病毒(IHNV)。选取IHNV病毒的N蛋白基因保守序列,利用PrimerExpress2.0软件设计引物和探针。以梯度稀释的含有IHNV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量RT-PCR反应以确定检测灵... 建立了Taqman实时定量RT-PCR方法检测传染性造血器官坏死病毒(IHNV)。选取IHNV病毒的N蛋白基因保守序列,利用PrimerExpress2.0软件设计引物和探针。以梯度稀释的含有IHNV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量RT-PCR反应以确定检测灵敏度。病毒浓度在5×106—5个拷贝,共7个数量级的范围内,定量RT-PCR反应有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为5个拷贝。根据病毒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对鲤春血症病毒(SVCV)、病毒性出血性败血症(VHSV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、EPC细胞系、牙鲆的核酸都没有扩增反应。在50批待检样品中,有3批鱼类感染IHNV,利用标准曲线进行了定量分析。实时定量RT-PCR检测IHNV方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,在鱼病的快速检测上具有重要意义。 展开更多
关键词 传染性造血器官坏死病毒(IHNV) 实时定量rt-pcr TAQMAN探针
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开花期水稻颖花实时定量RT-PCR分析中内参基因的选择 被引量：10
16
作者 何永明 曾晓春 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期1086-1092,共7页
实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术现已发展成为基因表达分析的首选方法,然而为了得到精确和可靠的qRT-PCR分析结果,需要应用稳定表达的内参基因对样品进行校正。以粳稻‘武运粳7号’和籼稻‘明恢63’的颖花为试验材料,应用geNorm算法对6个... 实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术现已发展成为基因表达分析的首选方法,然而为了得到精确和可靠的qRT-PCR分析结果,需要应用稳定表达的内参基因对样品进行校正。以粳稻‘武运粳7号’和籼稻‘明恢63’的颖花为试验材料,应用geNorm算法对6个常用的内参基因(ACT1、eEF1-α、β-TUB、UBQ5、GAPDH和UBC)在颖花开放过程中的表达稳定性进行分析。结果发现:eEF1-α和β-TUB在‘武运粳7号’颖花样品中的表达最为稳定,UBC和GAPDH在‘明恢63’颖花样品中的表达最为稳定,而ACT1在2个品种的颖花样品中表达均最不稳定。此外,同时选取2个最稳定表达的内参基因作内参照可获得更精确的校准。分析不同内参基因对JA生物合成关键基因OsAOC表达定量的影响。OsAOC表达的相对定量会随所选内参基因的不同而发生变异,进一步强调选择合适的内参基因进行校准是获得可靠qRT-PCR结果的重要前提。 展开更多
关键词 水稻颖花 基因表达 实时定量rt-pcr 内参基因
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牛病毒性腹泻病毒SYBR Green I实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：6
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作者 韩猛立 黄新 +1 位作者 钟发刚 唐思静 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期333-339,共7页
[目的]在建立一种快速定量的用于检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光定量RT-PCR检测方法.[方法]根据GenBank公布的BVDV 5′端非编码区（5′ UTR）核苷酸序列,软件分析后设计特异性扩增引物,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法.[... [目的]在建立一种快速定量的用于检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光定量RT-PCR检测方法.[方法]根据GenBank公布的BVDV 5′端非编码区（5′ UTR）核苷酸序列,软件分析后设计特异性扩增引物,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法.[结果]建立的方法只能检测到BVDV,而与猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒及牛冠状病毒没有交叉反应,具有高度的特异性;在102～108copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.998,最低可检测下限可达到102 copies/μL,具有灵敏度高的特点;不同情况下3次重复实验,变异系数均小于1.5％,具有重复性好的特点.[结果]成功建立了一种用于检测BVDV的实时荧光定量RT-PCR技术,并可用于临床样品的检测,适用于BVDV的快速诊断和流行病学调查. 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 实时荧光定量rt-pcr SYBR Green Ⅰ
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实时定量RT-PCR检测TCRVγ亚家族基因表达水平 被引量：7
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作者 陈少华 李扬秋 +3 位作者 杨力建 李萡 罗更新 张涛 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期166-168,共3页
目的：建立SYBRGreenI实时定量检测TCRVγ亚家族T细胞表达水平的比较Ct法。方法：利用倍比稀释的成人正常胸腺组织cDNA建立TCRVγⅠ—VγⅢ和B2微球蛋白基因（B2M）基因的相对标准曲线，实验证实靶基因（VγⅠ～VγⅢ）分别和看家基因（... 目的：建立SYBRGreenI实时定量检测TCRVγ亚家族T细胞表达水平的比较Ct法。方法：利用倍比稀释的成人正常胸腺组织cDNA建立TCRVγⅠ—VγⅢ和B2微球蛋白基因（B2M）基因的相对标准曲线，实验证实靶基因（VγⅠ～VγⅢ）分别和看家基因（152M）的扩增效率-致，可采用比较ct法对TCRVγI—VγⅢ的表达进行相对定量，并运用该方法检测20例健康成人外周血TCRVγI—VγⅢ的表达水平。结果：成人外周血TCRVγⅡ的表达量最高，TCRVγ1次之，TCRVγⅢ的表达量最低，三者比较有统计学意义（P〈0．05）。结论：本研究率先建立了利用SYBRGreenI实时荧光定量RT—PCR检测人TCRV7基因mRNA表达水平比较Ct法，并在国内首先提供了健康成人外周血TCRVγ基因各亚家族mRNA表达水平的资料。 展开更多
关键词 实时荧光定量rt-pcr 比较Ct法 TCR
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肠道病毒基因实时定量RT-PCR方法的建立 被引量：3
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作者 牛玉宏 杨英珍 +1 位作者 虞勇 葛均波 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期542-544,共3页
关键词 肠道病毒 基因 实时定量测定 rt-pcr
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一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立 被引量：38
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作者 包静月 李林 +3 位作者 王志亮 李金明 刘春菊 肖肖 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2007年第8期21-23,共3页
建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反... 建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 一步法实时定量RT—PCR 检测
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