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新型大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体的构建及卡那霉素抗性基因表达的研究
被引量：
9
1
作者
路艳艳
冯作化
+1 位作者
皇甫永穆
郑波
《同济医科大学学报》
CSCD
1998年第2期89-93,共5页
用 PCR（polymerase chain reaction）技术克隆了卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,BCG）热休克蛋白 65（heat shock Protein 65, hsp65）启动子序列,构建成穿梭载体ME-65。该载体含有分枝杆菌和大肠杆菌的质粒复制基因、BCG的hsp65高...
用 PCR（polymerase chain reaction）技术克隆了卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,BCG）热休克蛋白 65（heat shock Protein 65, hsp65）启动子序列,构建成穿梭载体ME-65。该载体含有分枝杆菌和大肠杆菌的质粒复制基因、BCG的hsp65高效启动子序列以及在分枝杆菌和大肠杆菌中都能表达的卡那霉素抗性基因。将其转化到耻垢分枝杆菌和BCG中均可稳定复制并表达卡那霉素抗性。质粒对宿主菌的生长无明显的影响,未观察到质粒的丢失和突变。该载体具有分子量小、容量大、转化效率高、复制稳定、含有多克隆位点等优点,将外源基因插入到hsp65启动子的下游,可望在BCG中获得高效表达。为BCG和其它分枝杆菌发展成多价重组疫苗开辟了新途径。
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关键词
分枝杆菌
穿梭
质粒
卡介苗
基因工程
大肠杆菌
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职称材料
表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究
被引量：
5
2
作者
李岩
鲍朗
+2 位作者
张会东
李娅莎
朱海龙
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第7期923-926,共4页
目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将...
目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组(P<0.05)。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。
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关键词
ESAT
-
6
大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒
重组耻垢
分枝杆菌
巨噬细胞
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职称材料
重组穿梭质粒pIMP1-eHER2/neu的构建及其生孢梭菌稳定转化株的筛选与鉴定
3
作者
张艳丽
张文卿
+3 位作者
王秋波
丁守怡
吕锐
孟林
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2011年第11期1184-1187,共4页
目的:制备人原癌基因HER2/neu的细胞外区域(ECD)基因修饰的重组生孢梭菌,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法:利用SOE-PCR将HER2/neu ECD基因连接到厌氧菌的内β1,4-葡聚糖酶的启动子和信号肽基因(eg-lAp)下游,构建融合基因eglAp-H...
目的:制备人原癌基因HER2/neu的细胞外区域(ECD)基因修饰的重组生孢梭菌,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法:利用SOE-PCR将HER2/neu ECD基因连接到厌氧菌的内β1,4-葡聚糖酶的启动子和信号肽基因(eg-lAp)下游,构建融合基因eglAp-HER2/neu;将其插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,构建重组质粒;首先将重组质粒导入大肠杆菌DH5α内并进行鉴定;然后用电穿孔法将重组质粒导入生孢梭菌。利用红霉素抗性筛选重组生孢梭菌;采用菌液PCR鉴定阳性克隆。结果:酶切和测序结果显示,插入质粒pIMP1内的eglAp-HER2/neu融合基因序列及读框正确。菌液PCR结果表明,重组质粒pIMP1-eHER2/neu成功转化生孢梭菌;经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带pIMP1-eHER2/neu。结论:成功制备了重组质粒pIMP1-eHER2/neu生孢梭菌的稳定转化株,为其进一步的抗肿瘤作用研究奠定基础。
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关键词
大肠杆菌
-
厌氧菌
穿梭
质粒
生孢梭菌
HER2/NEU
ECD
pIMP1
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职称材料
题名
新型大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体的构建及卡那霉素抗性基因表达的研究
被引量：
9
1
作者
路艳艳
冯作化
皇甫永穆
郑波
机构
同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室
出处
《同济医科大学学报》
CSCD
1998年第2期89-93,共5页
基金
卫生部基金(No.94-1-144)
国家自然科学基金( No.39480022)
湖北省卫生厅基金(No.W-940303007)资助项目
文摘
用 PCR（polymerase chain reaction）技术克隆了卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,BCG）热休克蛋白 65（heat shock Protein 65, hsp65）启动子序列,构建成穿梭载体ME-65。该载体含有分枝杆菌和大肠杆菌的质粒复制基因、BCG的hsp65高效启动子序列以及在分枝杆菌和大肠杆菌中都能表达的卡那霉素抗性基因。将其转化到耻垢分枝杆菌和BCG中均可稳定复制并表达卡那霉素抗性。质粒对宿主菌的生长无明显的影响,未观察到质粒的丢失和突变。该载体具有分子量小、容量大、转化效率高、复制稳定、含有多克隆位点等优点,将外源基因插入到hsp65启动子的下游,可望在BCG中获得高效表达。为BCG和其它分枝杆菌发展成多价重组疫苗开辟了新途径。
关键词
分枝杆菌
穿梭
质粒
卡介苗
基因工程
大肠杆菌
Keywords
mycobacteria
shuttle plasmid
BCG
genetic engineering
E.coli
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
R378.91 [医药卫生—病原生物学]
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职称材料
题名
表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究
被引量：
5
2
作者
李岩
鲍朗
张会东
李娅莎
朱海龙
机构
四川大学华西医学中心基础与法医学院感染免疫研究室
出处
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第7期923-926,共4页
基金
国家自然科学基金(30271172)~~
文摘
目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组(P<0.05)。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。
关键词
ESAT
-
6
大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒
重组耻垢
分枝杆菌
巨噬细胞
Keywords
ESAT
-
6
E.coli
-
mycobacterium shuttle vector
recombinant Mycobacterium smegmatis
macrophages
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
R392 [医药卫生—免疫学]
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职称材料
题名
重组穿梭质粒pIMP1-eHER2/neu的构建及其生孢梭菌稳定转化株的筛选与鉴定
3
作者
张艳丽
张文卿
王秋波
丁守怡
吕锐
孟林
机构
青岛大学医学院病原生物学实验室
出处
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2011年第11期1184-1187,共4页
基金
山东省医药卫生科技发展计划项目(2009HD005)
文摘
目的:制备人原癌基因HER2/neu的细胞外区域(ECD)基因修饰的重组生孢梭菌,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法:利用SOE-PCR将HER2/neu ECD基因连接到厌氧菌的内β1,4-葡聚糖酶的启动子和信号肽基因(eg-lAp)下游,构建融合基因eglAp-HER2/neu;将其插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,构建重组质粒;首先将重组质粒导入大肠杆菌DH5α内并进行鉴定;然后用电穿孔法将重组质粒导入生孢梭菌。利用红霉素抗性筛选重组生孢梭菌;采用菌液PCR鉴定阳性克隆。结果:酶切和测序结果显示,插入质粒pIMP1内的eglAp-HER2/neu融合基因序列及读框正确。菌液PCR结果表明,重组质粒pIMP1-eHER2/neu成功转化生孢梭菌;经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带pIMP1-eHER2/neu。结论:成功制备了重组质粒pIMP1-eHER2/neu生孢梭菌的稳定转化株,为其进一步的抗肿瘤作用研究奠定基础。
关键词
大肠杆菌
-
厌氧菌
穿梭
质粒
生孢梭菌
HER2/NEU
ECD
pIMP1
Keywords
E. cofi
-
clostridia shuttle plasmid
Clostridium sporogenes
HER2/neu
ECD
pIMP1
分类号
R392.12 [医药卫生—免疫学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
新型大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体的构建及卡那霉素抗性基因表达的研究
路艳艳
冯作化
皇甫永穆
郑波
《同济医科大学学报》
CSCD
1998
9
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究
李岩
鲍朗
张会东
李娅莎
朱海龙
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006
5
在线阅读
下载PDF
职称材料
3
重组穿梭质粒pIMP1-eHER2/neu的构建及其生孢梭菌稳定转化株的筛选与鉴定
张艳丽
张文卿
王秋波
丁守怡
吕锐
孟林
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2011
0
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