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蜂蜜中转基因成分启动子和终止子的多重实时荧光PCR法检测 被引量:1
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作者 林碧莲 张雅薇 +8 位作者 高宇 何孟杭 邱秀玉 韩涛 张芳 傅德江 陈思琪 宋帆 柯振华 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期69-77,共9页
为能高效率定位蜂蜜中的转基因可疑阳性样品,以10种转基因启动子和终止子(花椰菜花叶病毒35S启动子(pCaMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(tNOS)、玄参花叶病毒的35S启动子(p FMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(pNOS)、玉... 为能高效率定位蜂蜜中的转基因可疑阳性样品,以10种转基因启动子和终止子(花椰菜花叶病毒35S启动子(pCaMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(tNOS)、玄参花叶病毒的35S启动子(p FMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(pNOS)、玉米泛素基因的启动子(pUbi)、烟草的花蕊特异性TA29的基因发育调节启动子(pTA29)、豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子(tE9)、章鱼碱合成酶终止子(t OCS)、谷氨酰胺转移酶7终止子(tg7)、花椰菜花叶病毒终止子(tCaMV35S))为研究靶标,进行10种启动子和终止子的引物和探针组合筛选、反应条件优化、灵敏度测定、质控品测试比对等实验,建立3组多重实时荧光PCR反应体系,并将其应用于市售蜂蜜的检测。结果表明:建立的3组多重实时荧光PCR反应体系能精准检出目的基因,其灵敏度分别为0.01、0.04、0.04 ng/μL;14种转基因质控品的测试显示多重实时荧光PCR和单重实时荧光PCR的检测结果一致;40份市售蜂蜜的筛查中,有两份蜂蜜检出pCaMV35S和tNOS,其余未检出,该方法大大提高了检测效率。该方法为蜂蜜中转基因成分的检测提供了快筛快检技术,同时也适用其它产品转基因成分的检测。 展开更多
关键词 蜂蜜 转基因 启动子 终止子 多重实时荧光pcr
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食源性致病菌多重实时荧光PCR检测扩增内标的构建及评价 被引量:8
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作者 索标 滕要辉 +3 位作者 艾志录 王娜 谢新华 潘治利 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期148-151,共4页
多重实时荧光PCR在食源性致病菌检测中具有重要的作用,扩增内标(IAC)可用来指示其检测过程中可能出现的假阴性检测结果。采用来源于人类腺病毒基因的一段序列设计IAC,并对其检测特异性、扩增效率以及与目的致病菌基因组DNA的抗干扰扩增... 多重实时荧光PCR在食源性致病菌检测中具有重要的作用,扩增内标(IAC)可用来指示其检测过程中可能出现的假阴性检测结果。采用来源于人类腺病毒基因的一段序列设计IAC,并对其检测特异性、扩增效率以及与目的致病菌基因组DNA的抗干扰扩增能力进行了评估。结果表明,本IAC引物在供试菌株中均没有非特异性扩增结果,扩增效率达99.44%,而且对供试沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌O157:H7(Escherichiacoli O157:H7)以及单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多重实时荧光PCR扩增没有任何干扰,在食源性致病菌多重检测技术的建立中具有广泛的应用前景。 展开更多
关键词 扩增内标 多重实时荧光pcr 食源性致病菌
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应用多重实时荧光PCR方法对8种动物毛纤维种类鉴别的研究 被引量:6
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作者 刘艳艳 范阳阳 +4 位作者 步迅 胡悦 东野升金 谭晴晴 张全芳 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1540-1549,共10页
本研究旨在利用多重实时荧光PCR方法对水貂、狐狸、骆驼、兔、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物毛纤维进行物种鉴定研究。利用碱裂解法加入二硫苏糖醇,并结合硅珠吸附核酸法来优化动物毛纤维DNA的提取;根据8种动物16S rDNA基因特异核苷酸序列... 本研究旨在利用多重实时荧光PCR方法对水貂、狐狸、骆驼、兔、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物毛纤维进行物种鉴定研究。利用碱裂解法加入二硫苏糖醇,并结合硅珠吸附核酸法来优化动物毛纤维DNA的提取;根据8种动物16S rDNA基因特异核苷酸序列设计通用PCR引物和特异性TaqMan荧光探针;通过优化引物和探针浓度及退火温度等PCR反应体系和条件,建立了多重实时荧光PCR检测体系;并对多重PCR体系的特异性、灵敏度、重复性和适用性进行评估。结果表明,使用SDS-二硫苏糖醇DTT-蛋白酶K结合Chelex-100法,并利用硅珠纯化提取动物毛纤维DNA效果最佳,满足实时荧光PCR检测要求。本方法 DNA灵敏度为0.01ng,混合样本方法检出限为1.0%。因此本方法能够从动物毛纤维提取高质量DNA,建立的多重实时荧光PCR检测体系具有特异性强、重复性好和灵敏度高等优势。本方法可用于水貂、狐狸、骆驼、兔、山羊、绵羊、鸭和鹅8种动物及其混合物毛纤维的鉴定,为拓展动物毛纤维在物种识别、分子进化研究、分子标记辅助育种和遗传资源评价等领域中的应用奠定基础。 展开更多
关键词 动物毛纤维 多重实时荧光pcr 鉴定
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化妆品中动物源性成分多重实时荧光PCR检测方法的研究 被引量:6
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作者 刘艳艳 霍胜楠 +3 位作者 梁水美 卞如如 张卉 步迅 《日用化学工业》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期479-484,共6页
使用优化的Chelex-100结合玻璃奶法提取膏状、液态和固态化妆品中的动物源性DNA;根据驴、马和牛线粒体16S rRNA基因序列设计通用引物和特异性探针,建立了一次性检测化妆品中驴、马和牛3种动物源性成分的多重实时荧光PCR体系,检出限均为0... 使用优化的Chelex-100结合玻璃奶法提取膏状、液态和固态化妆品中的动物源性DNA;根据驴、马和牛线粒体16S rRNA基因序列设计通用引物和特异性探针,建立了一次性检测化妆品中驴、马和牛3种动物源性成分的多重实时荧光PCR体系,检出限均为0.001 ng。并对市售的面霜、洗面奶和面膜进行盲样检测,验证了体系的可靠性和准确性。 展开更多
关键词 化妆品 多重实时荧光pcr 动物源性成分
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多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆及其加工产品 被引量:20
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作者 王凤军 叶素丹 +2 位作者 包永华 周晓红 凌云 《中国粮油学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2018年第9期135-141,共7页
本研究运用多重实时荧光聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)对转基因大豆及其深加工制品进行筛选检测。通过设计大豆内源基因植物凝集素(Lectin)和常用的外源基因花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、根癌农杆菌胭脂碱... 本研究运用多重实时荧光聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)对转基因大豆及其深加工制品进行筛选检测。通过设计大豆内源基因植物凝集素(Lectin)和常用的外源基因花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止(nos)的特异性引物和探针,反应条件和反应体系的优化,特异性、重复性和灵敏性的实验比对分析等开发建立了多重荧光定量PCR检测技术。以10%Roundup Ready转基因大豆标准品为材料,建立并优化转基因大豆的定量检测体系,对大豆中的转基因成分进行定量分析。结果表明:该方法重复性好,检测特异性强,扩增效率在90%~110%,标准曲线相关系数R2≥0. 98,确定了最低检测限为每20μL反应2. 4个拷贝。结论:由于使用多重实时荧光PCR技术,可实现一管多检的实际需要,降低试剂成本,缩短检测时间,为大豆及其深加工产品转基因成分的快速检测提供了有效方法,为促进农产品和食品进出口提供技术保障。 展开更多
关键词 转基因大豆 多重实时荧光pcr 快速检测 加工产品
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金黄色葡萄球菌及毒素多重实时荧光PCR检测技术及其试剂盒性能测试 被引量:4
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作者 周海波 沈宇飞 +2 位作者 陆兆新 胡安妥 别小妹 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1258-1265,共8页
[目的]本文基于自筛的金黄色葡萄球菌特异性靶基因ASL18_04625(sa19)以及2种重要的毒素基因(A型和U型肠毒素,sea344和seu222),建立一种同时检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素的多重实时荧光PCR检测方法。[方法]通过优化引物浓度等因素,确定... [目的]本文基于自筛的金黄色葡萄球菌特异性靶基因ASL18_04625(sa19)以及2种重要的毒素基因(A型和U型肠毒素,sea344和seu222),建立一种同时检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素的多重实时荧光PCR检测方法。[方法]通过优化引物浓度等因素,确定最适多重实时荧光PCR反应体系,并将此检测体系组装成试剂盒,对人工污染样品和实际样品进行检测。[结果]选用1.5×Syto9 Green作为荧光染料,优化后的反应体系为0.015 U·μL^(-1)Taq酶,0.10 mmol·L^(-1)dNTP,终浓度分别为0.05、0.10和0.20μmol·L^(-1)的3对引物。sa19的基因组灵敏度为40.7 pg·μL^(-1),sea344、seu222的基因组灵敏度均为4.07 pg·μL^(-1);sa19的菌液浓度灵敏度为1.19×10^(3)CFU·mL^(-1),sea344、seu222的菌液浓度灵敏度均为1.19×10^(4)CFU·mL^(-1)。构建的试剂盒组内和组间重复率均为100%。在经历60次反复冻融、72 h泡沫箱储藏、-20℃储藏90 d、4℃储藏45 d后,试剂盒检测结果仍没有显著变化,同时具有良好的特异性与抗干扰能力。[结论]本研究针对食源性金黄色葡萄球菌建立的多重实时荧光PCR法,具有快速、特异性强、灵敏度高的优点,并组建成适用于实际检测应用的商品化试剂盒,在食品安全检测方面具有广阔的应用前景。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 毒素基因 多重实时荧光pcr 试剂盒
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基于多重实时荧光PCR技术快速检测海产品异尖线虫 被引量:5
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作者 黄姝玲 《广东海洋大学学报》 CAS 北大核心 2022年第6期122-129,共8页
【目的】构建简单异尖线虫(Anisakis simplex)、费氏宫脂线虫(Hysterothylacium fabri)、内弯宫脂线虫(Hysterothylacium aduncum)、拟地新线虫(Pseudoterranova decipiens)、典型异尖线虫(Anisakis typica)、带鱼针蛔线虫(Raphidascari... 【目的】构建简单异尖线虫(Anisakis simplex)、费氏宫脂线虫(Hysterothylacium fabri)、内弯宫脂线虫(Hysterothylacium aduncum)、拟地新线虫(Pseudoterranova decipiens)、典型异尖线虫(Anisakis typica)、带鱼针蛔线虫(Raphidascaris trichiuri)、厦门宫脂线虫(Hysterothylacium amoyense)和中华宫脂线虫(Hysterothylacium sinense)的快速检测方法,实现对以上8种异尖线虫的高通量检测及准确分型。【方法】采集8种异尖线虫核酸进行凝胶电泳,测序并进行序列对比,设计引物和TaqMan荧光探针;通过优化体系及退火温度,建立多重实时荧光PCR检测体系,并添加海产品核酸背景验证其特异性和灵敏度。【结果】建立了基于多重实时荧光PCR技术针对海产品中异尖线虫的快速检测鉴定方法,可在一个反应体系里同时检测鉴定4种异尖线虫,双通道反应体系可一次性检测鉴定8种异尖线虫。体系中,引物和探针的终浓度分别为0.60、0.20μmol/L,DNA灵敏度为103拷贝/mL;对带鱼(Trichiurus lepturus)、鳕鱼(Gadus)、舟山宫脂线虫(Hysterothylacium zhoushanensis)、棘颚口线虫(Gnathostoma spinigerum)均无荧光信号;针对等量混合的4种异尖线虫模拟样本均可检出,检出限为1.0%。【结论】建立的海产品异尖线虫多重实时荧光PCR快速检测方法操作简便、灵敏度高、特异性强、重复性好,可应用于日常食品检验和异尖线虫分型鉴别研究。 展开更多
关键词 异尖线虫 海产品 快速检测鉴定 多重实时荧光pcr
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多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162 被引量:1
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作者 王凤军 许海锋 +2 位作者 陈强 杨伊平 金浩然 《保鲜与加工》 CAS 2023年第3期56-61,共6页
为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PC... 为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明,转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线,其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线,空白对照无扩增曲线,说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法,用于规范管理转基因产品在市场上的流通。 展开更多
关键词 转基因玉米MIR162 多重实时荧光pcr TaqMan-MGB杂交探针标记法 快速鉴定
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应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒 被引量:8
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作者 郑夔 丁国允 +5 位作者 周惠琼 谢雪妹 李小波 师永霞 苏锦坤 黄吉城 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期242-247,共6页
目的建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体... 目的建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体各类组织细胞中均能稳定表达的RNAse P基因,设计了3套特异性引物和探针,建立了1套能同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒及含有人类基因检测内参的多重实时荧光RT-PCR方法,对其灵敏性和特异性进行了验证,并对临床发热病人标本进行了应用评估。结果该方法对检测体外转录合成的登革病毒和基孔肯雅病毒RNA的灵敏性可达最低每个反应10~100拷贝,对检测登革1型病毒和基孔肯雅病毒的灵敏性分别可达最低每个反应0.1TCID50/mL和1TCID50/mL。用20株登革病毒、4株基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒各1株进行检测,方法的特异性均为100%。方法应用于189份发热病人血清标本检测,可准确地鉴定出其中登革病毒或基孔肯雅病毒核酸阳性的标本,且所有血清标本均能被内参引物和探针有效地扩增和杂交。结论本研究建立了一种高灵敏性、高特异性且含人类基因内参检测的登革病毒和基孔肯雅病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法,可作为登革热或基孔肯雅热病人早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于蚊媒携带登革病毒或基孔肯雅病毒的高通量快速筛查。 展开更多
关键词 登革病毒 基孔肯雅病毒 内参 多重实时荧光RT—pcr
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一种从羊奶中检测牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR方法的建立 被引量:10
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作者 范阳阳 张荦嘉 +5 位作者 刘艳艳 卞如如 霍胜楠 张卉 张全芳 步迅 《山东农业科学》 2016年第6期118-123,共6页
羊奶制品因其良好的营养功效备受消费者的青睐,也是乳制品主要掺假对象。本研究参考市场可能掺假现状,分别根据羊和牛线粒体基因组16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因(GI:510514)序列,设计一对牛和羊特异性引物、一对大豆特异性引物以... 羊奶制品因其良好的营养功效备受消费者的青睐,也是乳制品主要掺假对象。本研究参考市场可能掺假现状,分别根据羊和牛线粒体基因组16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因(GI:510514)序列,设计一对牛和羊特异性引物、一对大豆特异性引物以及相应的Taq Man-MGB探针,建立羊奶中牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR检测方法,并引入内标质控有效保证检测体系的准确性。本检测体系对羊奶、牛奶及豆浆的基因组DNA检测敏感度为0.01 ng;对羊奶中掺入牛奶和豆浆的体积掺假检测灵敏度均为0.1%。因此,本研究建立的羊奶中牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR检测体系具有通量大、灵敏度高、特异性好等优点,实现了对羊奶中其他源性成分快速、准确的检测,对保障相关产品市场安全具有重要意义。 展开更多
关键词 羊奶 牛奶 豆浆 多重实时荧光定量pcr
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辣椒中常见产毒性真菌的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR检测方法 被引量:2
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作者 金燕 张薇薇 +3 位作者 王溯源 叶正茂 张立实 裴晓方 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期23-28,共6页
目的将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用,建立辣椒样品中常见3类(曲霉属、青霉属、镰刀菌属)产毒性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA(r DNA)基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针,联用裸磁珠富集技术... 目的将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用,建立辣椒样品中常见3类(曲霉属、青霉属、镰刀菌属)产毒性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA(r DNA)基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针,联用裸磁珠富集技术,建立多重实时荧光定量PCR体系,并评价所建方法的灵敏度、特异性、重复性和一致性。结果裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法灵敏度高,与本研究优化后的普通实时荧光定量PCR相比提高了10倍,是原报道的100倍,直接检测辣椒样品中3类产毒性真菌的检出限均可达103CFU/ml,即104CFU/g,且特异性良好(与非目标菌无交叉反应)、重复性良好(CV〈1.5%),该方法模拟检测辣椒样品中3类产毒性真菌的计数结果与标准培养法的计数结果相比均无统计学差异(P〉0.05),实验过程仅需7 h(标准培养鉴定法耗时7~14 d)。结论构建的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法能大大缩短产毒性真菌的检测时间,并成功应用于模拟辣椒样品中常见3类产毒性真菌的定量检测,值得进一步研究和推广。 展开更多
关键词 产毒性真菌 裸磁珠富集 多重实时荧光定量pcr 辣椒模型
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多重实时荧光定量PCR鉴别欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV检测方法的建立 被引量:6
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作者 温青娜 周玲玲 +2 位作者 申红 杨菊凤 林祥群 《动物医学进展》 北大核心 2015年第6期1-8,共8页
根据欧洲型N基因、美洲型M基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp2基因的各自保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,... 根据欧洲型N基因、美洲型M基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp2基因的各自保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,建立了能够检测欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV的多重实时荧光定量PCR方法。该方法的重复试验表明其批内和批间的变异系数最高值分别为1.84%和1.76%;灵敏性试验表明其检测下限为10copies/μL;特异性试验表明与其他一些猪源病毒无交叉反应,具有良好的特异性;临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样本中美洲型及高致病性PRRSV的核酸;此外,本研究用欧洲型PRRSV质粒进一步验证了该方法可以检测出欧洲型PRRSV的目的基因。该方法的建立为不同类型的PRRSV快速检测提供了有效手段,可用于猪繁殖与呼吸综合征疫情的监测及防控。 展开更多
关键词 欧洲型 美洲型 高致病性 猪繁殖与呼吸综合征病毒 多重实时荧光定量pcr
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肉串制品中猪牛羊源性成分多重荧光PCR检测方法研究 被引量:1
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作者 姚艳玲 周宇东 +4 位作者 王文宇 朱洪亮 陈婷 翁光灿 孙世元 《安徽农业科学》 CAS 2024年第18期184-187,共4页
[目的]建立畜类肉串产品中常见的黄牛、绵羊和猪源性成分的多重荧光PCR检测方法,实现肉串制品中动物源性成分的快速鉴别。[方法]比较磁珠法和柱膜法对肉糜组织中DNA的提取效果,优化实时荧光PCR多重检测方法,比较58、60℃2个退火温度下... [目的]建立畜类肉串产品中常见的黄牛、绵羊和猪源性成分的多重荧光PCR检测方法,实现肉串制品中动物源性成分的快速鉴别。[方法]比较磁珠法和柱膜法对肉糜组织中DNA的提取效果,优化实时荧光PCR多重检测方法,比较58、60℃2个退火温度下黄牛、绵羊、猪源性成分扩增效果。[结果]试验采用的2种DNA提取方法效果相似,DNA溶液的A_(260)/A_(280)值均能满足PCR检测要求;58℃为最优退火温度,此时黄牛、绵羊、猪源性成分均能有效扩增,且最低检出的DNA浓度均为10^(-3) ng/μL。方法中用到的引物和探针特异性较好,均未产生非特异性扩增。[结论]试验建立的黄牛、绵羊和猪源性成分的多重PCR检测方法能为肉制品中动物源性成分的快速定性分析提供方法参考。 展开更多
关键词 黄牛 绵羊 源性成分 实时荧光多重pcr
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3种常见金银花致病菌多重实时荧光定量PCR检测方法研究 被引量:2
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作者 朱桐杉 刘艳艳 +7 位作者 谭晴晴 刘国霞 陈雪燕 步迅 王文博 于子涵 张全芳 张永清 《山东农业科学》 北大核心 2023年第7期145-151,共7页
为了建立可同时检测炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)、白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)和褐斑病病原菌(Cercospora rhamni)3种金银花重要叶部病原菌的多重实时荧光定量PCR快速检测方法,本试验基于3种病原菌ITS片段序列... 为了建立可同时检测炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)、白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)和褐斑病病原菌(Cercospora rhamni)3种金银花重要叶部病原菌的多重实时荧光定量PCR快速检测方法,本试验基于3种病原菌ITS片段序列分别设计特异引物和TaqMan荧光探针,并制备重组质粒建立标准曲线;对建立的多重实时荧光定量PCR检测方法进行特异性、灵敏度、准确性验证。结果表明,本研究建立的多重实时荧光定量PCR快速检测方法仅针对金银花炭疽病、白粉病和褐斑病病原菌有特异性扩增;最低检测限为2.94×10^(2)copies/μL,比普通PCR法高100倍;利用本方法检测15份有叶部病害症状的金银花病叶,与DNA测序结果完全一致。综之,本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法特异性强、灵敏度高,为金银花炭疽病、白粉病和褐斑病的早期诊断提供了技术支持。 展开更多
关键词 金银花 炭疽病 白粉病 褐斑病 多重实时荧光定量pcr
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WSSV和IHHNV二重实时荧光PCR检测方法的建立 被引量:16
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作者 谢芝勋 谢丽基 +6 位作者 庞耀珊 卢兆发 谢志勤 孙建华 邓显文 刘加波 唐小飞 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期22-27,共6页
根据基因库中对虾白斑综合症病毒W SSV(AF369029)和传染性皮下及造血器官坏死病毒IHHNV(AF218226)基因序列,设计了W SSV和IHHNV的两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqM an探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检... 根据基因库中对虾白斑综合症病毒W SSV(AF369029)和传染性皮下及造血器官坏死病毒IHHNV(AF218226)基因序列,设计了W SSV和IHHNV的两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqM an探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测W SSV和IHHNV的二重实时荧光PCR方法。该方法特异性好,对W SSV和IHHNV的检测敏感性分别达到2和20个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对W SSV和IHHNV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这二个病毒。对保存的30份经常规PCR检测仅为W SSV或IHHNV阳性的样品进行二重实时荧光PCR检测,结果都为阳性,其中1份为W SSV和IHHNV混合感染。本研究建立的二重实时荧光PCR方法用于W SSV和IHHNV的检测具有特异、敏感、快速、定量等优点。 展开更多
关键词 白斑综合征病毒 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 多重实时荧光pcr
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三种转基因大豆品系的多重荧光PCR检测体系建立 被引量:11
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作者 闫伟 龙丽坤 +3 位作者 李葱葱 夏蔚 董立明 李飞武 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期712-718,共7页
转基因大豆MON87701、MON87708、MON87769是我国大豆进口贸易中重点监测的转基因品系,为探讨这3个品系的高效监管技术手段,应用多重实时荧光聚合酶链式反应建立在同一反应体系中同时检测MON87701、MON87708、MON87769的方法。通过分析... 转基因大豆MON87701、MON87708、MON87769是我国大豆进口贸易中重点监测的转基因品系,为探讨这3个品系的高效监管技术手段,应用多重实时荧光聚合酶链式反应建立在同一反应体系中同时检测MON87701、MON87708、MON87769的方法。通过分析转基因大豆MON87701、MON87708、MON87769品系的特性序列及大豆内标准基因lectin序列,在此基础上优化设计1组多重PCR引物/探针,并以转基因大豆MON87701、MON87708和MON87769为测试样品,以其它转基因大豆、玉米、水稻、油菜、棉花及非转基因大豆为对照测试样品,经引物/探针浓度优化、特异性、灵敏度等测试,建立多重实时荧光PCR检测体系。结果显示:该多重PCR方法可从各种复杂样品中准确检出相应的靶标转基因大豆成分,对转基因大豆MON87701、MON87708和MON87769的检测灵敏度达到43个DNA拷贝,相当于比0.05%(w/w)。该方法特异性强、灵敏度高,在转基因大豆成分快速检测和品系鉴定中具有很好的应用前景。 展开更多
关键词 多重实时荧光pcr 转基因大豆 快速检测 品系特异性鉴定
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多重实时荧光串联PCR技术高通量检测生蚝中9种致病菌 被引量:5
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作者 麻春阳 高世珏 +4 位作者 蒋丽婷 杨础华 TANUSHREE B GUPTA NIMA AZARAKHSH 吴希阳 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第21期247-253,共7页
大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、单增李斯特菌和创伤弧菌是贝类食品中常见的食源性致病菌。该文通过设计特异性引物,优化反应参数以建立多重实时荧光串联PCR(multiplexed ... 大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、单增李斯特菌和创伤弧菌是贝类食品中常见的食源性致病菌。该文通过设计特异性引物,优化反应参数以建立多重实时荧光串联PCR(multiplexed tandem PCR,MT-PCR)方法,进一步评估方法的特异性和灵敏度,并用于检测生蚝样品。优化后的MT-PCR方法与常规qPCR具有相同定量能力,可同时检测上述9种致病菌。在对混合菌液的检测中,MT-PCR方法的检测灵敏度最低可达10~2 CFU/mL,且此法对其中6种致病菌的检测灵敏度高于qPCR。应用该技术检测人工染菌的生蚝样品,检测灵敏度为10~2~10~3CFU/g。该研究建立的MT-PCR方法可实现高通量、快速准确地检测生蚝中这9种常见的食源性致病菌,对保障食品安全和评估食源性致病菌污染风险具有重要意义。 展开更多
关键词 食源性致病菌 多重实时荧光串联pcr 高通量检测 生蚝
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多重荧光PCR检测水产品致病菌方法的建立与应用研究 被引量:2
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作者 许如苏 林志雄 +4 位作者 林彩华 陈冠武 蔡颖 陈其生 杨奇志 《广东畜牧兽医科技》 2011年第4期22-27,共6页
根据沙门氏菌invA基因、副溶血性弧菌toxR基因和大肠杆菌O157:H7RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度和特异性,建立了可同时检测上述三种致病菌的多重实时荧光PCR方法。该方法对纯菌的检测灵敏度均低于10c... 根据沙门氏菌invA基因、副溶血性弧菌toxR基因和大肠杆菌O157:H7RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度和特异性,建立了可同时检测上述三种致病菌的多重实时荧光PCR方法。该方法对纯菌的检测灵敏度均低于10cfu/PCR反应体系。人工染菌样品经6h增菌,检测的灵敏度可低于10cfu/25g;对48株标准/参考菌株的检测结果,只有目的菌株呈阳性反应;而定量检测批内和批间的变异系数均小于2%。应用本法检测人工染菌样品和进出口水产品样品,结果与SN标准方法检测结果一致。本法可在8h内完成对水产品中上述三种致病菌的定性或定量检测,可适应于进出口水产品的快速检验。 展开更多
关键词 沙门氏菌 副溶血性弧菌 大肠杆菌O157:H7 多重实时荧光pcr
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5类致泻性大肠埃希氏菌多重荧光PCR检测方法的建立 被引量:30
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作者 胡安妥 王娉 +2 位作者 张彩霞 蔡阳 陈颖 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2018年第22期249-255,共7页
目的:建立快速检测和鉴别5类致泻大肠埃希氏菌的多重实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法:根据5类致泻大肠埃希氏菌的11组毒力基因eae、stx1、stx2、ipaH、uidA、estla、estlb、aggR、pic、elt、astA建立... 目的:建立快速检测和鉴别5类致泻大肠埃希氏菌的多重实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法:根据5类致泻大肠埃希氏菌的11组毒力基因eae、stx1、stx2、ipaH、uidA、estla、estlb、aggR、pic、elt、astA建立多重实时荧光PCR方法,该方法包括A、B 2个反应体系,可分别检测肠致病性大肠埃希氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌、肠产毒大肠埃希氏菌、肠聚集性大肠埃希氏菌,优化反应体系的引物、探针浓度以及PCR反应条件,并对该方法的灵敏度和特异性进行检测。结果:11组基因的探针和引物均可特异性地扩增相应的基因片段,A体系检测下限可达到2.6×10~4 copies/反应,B体系检测下限可到达2.2×10~4 copies/反应。结论:本研究所建立的多重实时荧光PCR方法可以对同一样本同时采用A、B 2个反应体系进行检测,不但可以确定待测样本是否为大肠埃希氏菌,而且还能判定其致病型别。为大肠埃希氏菌的临床检测、疾病预防以及爆发溯源等提供参考。 展开更多
关键词 致泻大肠埃希氏菌 多重实时荧光pcr 毒力基因
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多重荧光定量PCR甄别3种霍乱弧菌相关毒素基因 被引量:2
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作者 金大智 张政 +4 位作者 罗芸 叶菊莲 程苏云 吴方 金郁 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期1065-1070,共6页
目的为了判定霍乱弧菌是否携带相关毒力因子,研发一种快速、准确、特异检测霍乱弧菌3种毒素基因的多重荧光定量PCR方法。方法针对霍乱弧菌ctxA、ace、zot基因设计引物和探针,建立PCR体系,对70株霍乱弧菌分离株进行鉴定,采用直接测序方... 目的为了判定霍乱弧菌是否携带相关毒力因子,研发一种快速、准确、特异检测霍乱弧菌3种毒素基因的多重荧光定量PCR方法。方法针对霍乱弧菌ctxA、ace、zot基因设计引物和探针,建立PCR体系,对70株霍乱弧菌分离株进行鉴定,采用直接测序方法对鉴定结果进行验证。结果建立的多重实时荧光定量PCR方法可同时准确、特异地鉴定霍乱弧菌菌体携带的3种毒素基因,不携带毒素基因的菌株均未出现阳性检测结果。菌体检测的最低检出限度ctxA基因:102 CFU/mL,ace基因和zot基因:10CFU/mL。构建了3种毒素相关基因阳性质粒,ace基因和zot基因的最低检出限度为10copies/μL,ctxA基因的最低检出限度为102 copies/μL,定量检测批间和批内的变异系数均小于5%;对70株霍乱弧菌分离株进行评价,结果显示其中40株(57.2%)携带ctxA毒素基因、31株(44.3%)携带ace毒素基因、46株(65.7%)携带zot毒素基因,通过测序方法验证,符合率达到100%。结论本文建立的多重实时荧光定量PCR方法操作简便、特异性好、灵敏度高,为霍乱弧菌的现场流行病学调查和疫情监测提供了快速、可靠的鉴定工具。 展开更多
关键词 多重实时荧光定量pcr 霍乱弧菌 毒素
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