多重实时定量PCR快速检测PRRSV、CSFV和PCV2混合感染方法的建立 被引量：7

1

作者 赵绪永 宁豫昌 +1 位作者 赵丽 马辉 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2013年第2期123-127,共5页

根据TaqMan复合荧光探针设计原则,应用Primer 5.0和Oligo 6.0软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的特异性引物和探针,优化反应条件,建立了检测PRRSV、CSFV和PCV2的单项和多重Real-time PC... 根据TaqMan复合荧光探针设计原则,应用Primer 5.0和Oligo 6.0软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的特异性引物和探针,优化反应条件,建立了检测PRRSV、CSFV和PCV2的单项和多重Real-time PCR方法。结果表明,建立的方法具有高度特异性,与其他病原检测无明显交叉反应;对阳性质粒和病毒的最低检测量分别为<101个拷贝和<1TCID50/反应,检测灵敏度比常规PCR检测高100倍。通过对20份临床样本进行检测,多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果一致。建立的多重Real-time PCR方法可用于同时快速检测PRRSV、CSF和PCV2的混合感染,具有灵敏、特异、重复性好并能对样品进行定量检测等优点。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪瘟病毒 猪圆环病毒2型 多重实时定量pcr

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猪主要繁殖障碍疾病病原的多重实时定量PCR快速检测 被引量：1

2

作者 赵绪永 赵丽 +1 位作者 宁豫昌 马辉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1998-2002,共5页

本研究旨在建立多重Real-time PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)。根据GenBank数据库中PRRSV、PCV2、PRV、和PPV的核苷酸序列设计特异性引物和探针,通过优化反应条... 本研究旨在建立多重Real-time PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)。根据GenBank数据库中PRRSV、PCV2、PRV、和PPV的核苷酸序列设计特异性引物和探针,通过优化反应条件,检测系列稀释的纯化阳性质粒,建立检测PRRSV、PCV2、PRV和PPV的单项和多重Real-time PCR方法。灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单项和多重Real-timePCR检测,该方法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对4种病毒的最低检测量为<101拷贝或1TCID50,检测灵敏度比常规PCR高100倍。对40份临床样本进行检测,多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果完全一致。建立的同时检测PRRSV、PCV2、PRV和PPV的多重Real-time PCR方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能对样品进行定量检测等优点。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪圆环病毒2型 猪伪狂犬病毒 猪细小病毒 多重实时定量pcr

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马铃薯黑痣病多重实时定量PCR检测方法的建立 被引量：1

3

作者 陈恩发 卢扬 +2 位作者 彭慧元 雷尊国 邓宽平 《贵州农业科学》 CAS 北大核心 2014年第11期136-139,143,共5页

为建立快速、准确、可靠的马铃薯黑痣病鉴定和检测方法,以黑痣病病原菌立枯丝核菌核糖体基因簇间的保守序列—转录间隔区（Internal transcribed spacer,ITS）为靶区域,同时引入马铃薯细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase gene,Cox）作... 为建立快速、准确、可靠的马铃薯黑痣病鉴定和检测方法,以黑痣病病原菌立枯丝核菌核糖体基因簇间的保守序列—转录间隔区（Internal transcribed spacer,ITS）为靶区域,同时引入马铃薯细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase gene,Cox）作内参,应用多重实时定量PCR技术,建立马铃薯黑痣病病原菌TaqMan RFQ-PCR多重快速检测方法。结果表明：RFQ-PCR检测体系的引物-探针具有高度的特异性,灵敏度比普通PCR方法高10～100倍;内参基因的引入还可有效避免假阴性的出现。方法特异性强、灵敏度高、简单、快速、可靠。 展开更多

关键词 马铃薯黑痣病 检测 多重实时定量pcr 检测方法

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一种从羊奶中检测牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR方法的建立 被引量：10

4

作者 范阳阳 张荦嘉 +5 位作者 刘艳艳 卞如如 霍胜楠 张卉 张全芳 步迅 《山东农业科学》 2016年第6期118-123,共6页

羊奶制品因其良好的营养功效备受消费者的青睐,也是乳制品主要掺假对象。本研究参考市场可能掺假现状,分别根据羊和牛线粒体基因组16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因(GI:510514)序列,设计一对牛和羊特异性引物、一对大豆特异性引物以... 羊奶制品因其良好的营养功效备受消费者的青睐,也是乳制品主要掺假对象。本研究参考市场可能掺假现状,分别根据羊和牛线粒体基因组16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因(GI:510514)序列,设计一对牛和羊特异性引物、一对大豆特异性引物以及相应的Taq Man-MGB探针,建立羊奶中牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR检测方法,并引入内标质控有效保证检测体系的准确性。本检测体系对羊奶、牛奶及豆浆的基因组DNA检测敏感度为0.01 ng;对羊奶中掺入牛奶和豆浆的体积掺假检测灵敏度均为0.1%。因此,本研究建立的羊奶中牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR检测体系具有通量大、灵敏度高、特异性好等优点,实现了对羊奶中其他源性成分快速、准确的检测,对保障相关产品市场安全具有重要意义。 展开更多

关键词 羊奶 牛奶 豆浆 多重实时荧光定量pcr

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辣椒中常见产毒性真菌的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR检测方法 被引量：2

5

作者 金燕 张薇薇 +3 位作者 王溯源 叶正茂 张立实 裴晓方 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期23-28,共6页

目的将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用,建立辣椒样品中常见3类（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）产毒性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA（r DNA）基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针,联用裸磁珠富集技术... 目的将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用,建立辣椒样品中常见3类（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）产毒性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA（r DNA）基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针,联用裸磁珠富集技术,建立多重实时荧光定量PCR体系,并评价所建方法的灵敏度、特异性、重复性和一致性。结果裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法灵敏度高,与本研究优化后的普通实时荧光定量PCR相比提高了10倍,是原报道的100倍,直接检测辣椒样品中3类产毒性真菌的检出限均可达103CFU/ml,即104CFU/g,且特异性良好（与非目标菌无交叉反应）、重复性良好（CV〈1.5%）,该方法模拟检测辣椒样品中3类产毒性真菌的计数结果与标准培养法的计数结果相比均无统计学差异（P〉0.05）,实验过程仅需7 h（标准培养鉴定法耗时7~14 d）。结论构建的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法能大大缩短产毒性真菌的检测时间,并成功应用于模拟辣椒样品中常见3类产毒性真菌的定量检测,值得进一步研究和推广。 展开更多

关键词 产毒性真菌 裸磁珠富集 多重实时荧光定量pcr 辣椒模型

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多重实时荧光定量PCR鉴别欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV检测方法的建立 被引量：6

6

作者 温青娜 周玲玲 +2 位作者 申红 杨菊凤 林祥群 《动物医学进展》 北大核心 2015年第6期1-8,共8页

根据欧洲型N基因、美洲型M基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp2基因的各自保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,... 根据欧洲型N基因、美洲型M基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp2基因的各自保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,建立了能够检测欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV的多重实时荧光定量PCR方法。该方法的重复试验表明其批内和批间的变异系数最高值分别为1.84%和1.76%;灵敏性试验表明其检测下限为10copies/μL;特异性试验表明与其他一些猪源病毒无交叉反应,具有良好的特异性;临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样本中美洲型及高致病性PRRSV的核酸;此外,本研究用欧洲型PRRSV质粒进一步验证了该方法可以检测出欧洲型PRRSV的目的基因。该方法的建立为不同类型的PRRSV快速检测提供了有效手段,可用于猪繁殖与呼吸综合征疫情的监测及防控。 展开更多

关键词 欧洲型 美洲型 高致病性 猪繁殖与呼吸综合征病毒 多重实时荧光定量pcr

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3种常见金银花致病菌多重实时荧光定量PCR检测方法研究 被引量：2

7

作者 朱桐杉 刘艳艳 +7 位作者 谭晴晴 刘国霞 陈雪燕 步迅 王文博 于子涵 张全芳 张永清 《山东农业科学》 北大核心 2023年第7期145-151,共7页

为了建立可同时检测炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)、白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)和褐斑病病原菌(Cercospora rhamni)3种金银花重要叶部病原菌的多重实时荧光定量PCR快速检测方法,本试验基于3种病原菌ITS片段序列... 为了建立可同时检测炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)、白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)和褐斑病病原菌(Cercospora rhamni)3种金银花重要叶部病原菌的多重实时荧光定量PCR快速检测方法,本试验基于3种病原菌ITS片段序列分别设计特异引物和TaqMan荧光探针,并制备重组质粒建立标准曲线;对建立的多重实时荧光定量PCR检测方法进行特异性、灵敏度、准确性验证。结果表明,本研究建立的多重实时荧光定量PCR快速检测方法仅针对金银花炭疽病、白粉病和褐斑病病原菌有特异性扩增;最低检测限为2.94×10^(2)copies/μL,比普通PCR法高100倍;利用本方法检测15份有叶部病害症状的金银花病叶,与DNA测序结果完全一致。综之,本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法特异性强、灵敏度高,为金银花炭疽病、白粉病和褐斑病的早期诊断提供了技术支持。 展开更多

关键词 金银花 炭疽病 白粉病 褐斑病 多重实时荧光定量pcr

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多重荧光定量PCR甄别3种霍乱弧菌相关毒素基因 被引量：2

8

作者 金大智 张政 +4 位作者 罗芸 叶菊莲 程苏云 吴方 金郁 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期1065-1070,共6页

目的为了判定霍乱弧菌是否携带相关毒力因子,研发一种快速、准确、特异检测霍乱弧菌3种毒素基因的多重荧光定量PCR方法。方法针对霍乱弧菌ctxA、ace、zot基因设计引物和探针,建立PCR体系,对70株霍乱弧菌分离株进行鉴定,采用直接测序方... 目的为了判定霍乱弧菌是否携带相关毒力因子,研发一种快速、准确、特异检测霍乱弧菌3种毒素基因的多重荧光定量PCR方法。方法针对霍乱弧菌ctxA、ace、zot基因设计引物和探针,建立PCR体系,对70株霍乱弧菌分离株进行鉴定,采用直接测序方法对鉴定结果进行验证。结果建立的多重实时荧光定量PCR方法可同时准确、特异地鉴定霍乱弧菌菌体携带的3种毒素基因,不携带毒素基因的菌株均未出现阳性检测结果。菌体检测的最低检出限度ctxA基因:102 CFU/mL,ace基因和zot基因:10CFU/mL。构建了3种毒素相关基因阳性质粒,ace基因和zot基因的最低检出限度为10copies/μL,ctxA基因的最低检出限度为102 copies/μL,定量检测批间和批内的变异系数均小于5%;对70株霍乱弧菌分离株进行评价,结果显示其中40株(57.2%)携带ctxA毒素基因、31株(44.3%)携带ace毒素基因、46株(65.7%)携带zot毒素基因,通过测序方法验证,符合率达到100%。结论本文建立的多重实时荧光定量PCR方法操作简便、特异性好、灵敏度高,为霍乱弧菌的现场流行病学调查和疫情监测提供了快速、可靠的鉴定工具。 展开更多

关键词 多重实时荧光定量pcr 霍乱弧菌 毒素

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基于16S rRNA基因的食源性致病菌实时荧光定量PCR检测研究 被引量：2

9

作者 刘玲雪 孙红炜 +4 位作者 李凡 徐晓辉 高瑞 杨淑珂 路兴波 《山东农业科学》 2017年第6期126-134,共9页

本研究以16S rRNA基因作为靶基因,利用TaqMan探针技术建立了针对志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)三种主要食源性致病菌的多重实时荧光定量PCR检测技术。结果表明,建立的荧光定量PCR... 本研究以16S rRNA基因作为靶基因,利用TaqMan探针技术建立了针对志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)三种主要食源性致病菌的多重实时荧光定量PCR检测技术。结果表明,建立的荧光定量PCR检测体系特异性良好、灵敏度高、简便快捷,大大缩短了检测时间,在食源性致病菌快速筛查方面具有良好的应用前景。 展开更多

关键词 食源性致病菌 16S RRNA基因 多重实时荧光定量pcr TAQMAN探针

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三种奶牛常见病菌多重PCR诊断方法的建立 被引量：3

10

作者 高瑞娜 张婷 《畜牧兽医杂志》 2015年第4期15-18,22,共5页

根据GenBank公布的布鲁氏菌Bcsp31、牛分枝杆菌pncA、炭疽杆菌capA三种特异基因的保守序列分别设计引物,在引物前添加通用引物(Tag),建立3种奶牛常见病菌的多重实时荧光定量PCR方法;通过构建3种病菌PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准... 根据GenBank公布的布鲁氏菌Bcsp31、牛分枝杆菌pncA、炭疽杆菌capA三种特异基因的保守序列分别设计引物,在引物前添加通用引物(Tag),建立3种奶牛常见病菌的多重实时荧光定量PCR方法;通过构建3种病菌PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证;利用大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌用于特异性试验,并对30份样本进行了检测。结果表明,本研究构建的多重实时荧光定量PCR检测时间仅需2h,灵敏度为100个拷贝/uL,与其它细菌无交叉反应,特异性为100%,阳性检出率为88.89%。因此,本试验成功建立了检测3种奶牛常见病菌早期诊断的方法,可以在奶牛养殖中应用。 展开更多

关键词 奶牛 布鲁氏菌 牛分枝杆菌 炭疽杆菌 多重实时荧光定量pcr

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3种猪繁殖障碍性病毒Real-time PCR快速检测方法的建立 被引量：3

11

作者 赵绪永 马辉 +1 位作者 宁豫昌 赵丽 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2012年第12期27-33,共7页

【目的】建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的多重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank数据库中PRV、PPV和PCV2的核苷酸序列,设计3对特异性引物和探针,以10倍系列稀释的阳性质粒为模板,优... 【目的】建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的多重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank数据库中PRV、PPV和PCV2的核苷酸序列,设计3对特异性引物和探针,以10倍系列稀释的阳性质粒为模板,优化反应条件,建立检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,并对其敏感性、重复性和特异性进行检验;分别采用单项和多重Real-time PCR方法,对临床收集的42份疑似病料进行检测,比较2种方法的符合率。【结果】特异性和灵敏度试验表明,建立的多重Real-time PCR检测方法具有高度特异性,与其他病原无明显交叉反应;检测灵敏度高,可检出1.0×101拷贝/μL的阳性质粒或1TCID50/mL的病毒样品。用多重Real-time PCR对42份临床疑似病料进行检测,其检测结果与单重Real-time PCR结果完全一致,表明多重Real-time PCR方法是可行的。【结论】建立了可同时检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,该法具有快速、灵敏、特异和重复性好等优点。 展开更多

关键词 猪伪狂犬病毒 猪细小病毒 猪圆环病毒Ⅱ型 多重实时荧光定量pcr

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2009甲型H1N1流感流行期间北京急性呼吸道感染儿童常见呼吸道病毒的研究 被引量：4

12

作者 王婷婷 朱汝南 +11 位作者 钱渊 孙宇 王芳 邓洁 曲东 李颖 任晓旭 沙莉 袁艺 王菲 李杰 张宝元 《中国循证儿科杂志》 CSCD 2012年第1期25-30,共6页

目的了解2009至2010年甲型H1N1流感大流行期间北京地区急性呼吸道感染患儿中,除流感病毒外的其他几种常见呼吸道病毒感染的流行情况。方法设计并建立检测包括呼吸道合胞病毒(RSV)A/B亚型,副流感病毒(PIV)1、2、3型,腺病毒(ADV)和人博卡... 目的了解2009至2010年甲型H1N1流感大流行期间北京地区急性呼吸道感染患儿中,除流感病毒外的其他几种常见呼吸道病毒感染的流行情况。方法设计并建立检测包括呼吸道合胞病毒(RSV)A/B亚型,副流感病毒(PIV)1、2、3型,腺病毒(ADV)和人博卡病毒(HBoV)在内的多重实时荧光PCR方法,并应用该方法对2009年6月至2010年2月甲型H1N1流感大流行期间,对首都儿科研究所附属儿童医院就诊的急性呼吸道感染患儿中甲型H1N1流感病毒检测阴性的咽拭子标本进行上述呼吸道病毒的核酸检测。结果新建立的多重RT-PCR方法最低可检测的目标基因含量为10～300拷贝数,未见与其他非目标病毒的交叉反应。本研究共检测标本849份,病毒检测总阳性率为39.0%(331份),5岁以下占87.6%(290/331份)。各病毒的检测阳性率分别为RSV-A亚型1.4%(12份),RSV-B亚型8.4%(71份),PIV-1型8.2%(70份),PIV-2型0.5%(4份),PIV-3型3.9%(33份),ADV13.9%(118份),HBoV2.7%(23份)。RSV检出以B亚型为主(85.5%),流行高峰在2009年11月至2010年2月。PIV检出以PIV-1型及PIV-3型为主,PIV-1型的流行高峰在2009年7月至2009年10月,PIV-2型及PIV-3型的流行高峰在2009年6～9月。ADV病毒在研究期间均有较高检出率(平均为13.9%),HBoV的流行高峰在2009年9～12月。结论除流感病毒外,ADV、RSV-B及PIV可能也是2009甲型H1N1流感流行期间引起儿童急性呼吸道感染的重要病原。比较以往的资料可见各病原在2009甲型H1N1流感流行期间的流行季节性及检出率基本未受到新型流感病毒的影响。 展开更多

关键词 2009甲型H1N1流感 儿童 北京 急性呼吸道感染 呼吸道病毒 多重实时定量pcr

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猪传染性胃肠炎分子生物学诊断方法研究进展 被引量：3

13

作者 徐丽秋 贾赟 +2 位作者 刘海防 高玉峰 赵玉军 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2008年第8期52-55,共4页

检测TGEV的方法主要有病毒的分离鉴定、免疫荧光抗体试验、病毒中和试验、电镜观察、免疫电镜观察、ELISA方法、核酸探针杂交技术、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析,RT-PCR和荧光定量PCR等,伴随着对TGEV基因组分子生物学的深入研究... 检测TGEV的方法主要有病毒的分离鉴定、免疫荧光抗体试验、病毒中和试验、电镜观察、免疫电镜观察、ELISA方法、核酸探针杂交技术、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析,RT-PCR和荧光定量PCR等,伴随着对TGEV基因组分子生物学的深入研究,一系列分子生物学诊断技术不断出现,现对猪传染性胃肠炎病毒的分子生物学诊断方法的研究进展作以综述。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 分子生物学 诊断技术 多重实时荧光定量RT—pcr

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