组成型启动子P_(ldh)对乳酸菌表达系统外源基因表达的影响研究

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作者 刘芯孜 赵海渊 +7 位作者 鞠宁 陈莹 王梓 孟伟静 李佳璇 姜艳平 崔文 王晓娜 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2937-2947,共11页

旨在利用AmpR(氨苄青霉素抗性)报告基因表达系统,构建不同数量乳酸菌组成型启动子P_(ldh)串联、启动子P_(ldh)与AmpR报告基因不同顺序的乳酸菌表达载体系统,分别检测AmpR报告基因转录水平、蛋白表达量并评价AMPR酶活性,从而筛选出稳定... 旨在利用AmpR(氨苄青霉素抗性)报告基因表达系统,构建不同数量乳酸菌组成型启动子P_(ldh)串联、启动子P_(ldh)与AmpR报告基因不同顺序的乳酸菌表达载体系统,分别检测AmpR报告基因转录水平、蛋白表达量并评价AMPR酶活性,从而筛选出稳定且强表达的组成型多启动子表达系统,为乳酸菌活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。对P_(ldh)启动子进行生物信息学分析,构建不同数量启动子P_(ldh)串联的重组乳酸菌以及启动子与外源基因AmpR不同顺序重组乳酸菌。通过实时荧光定量PCR、Western blot、间接ELISA检测以及氨苄青霉素活菌筛选试验综合评估不同表达系统中外源基因表达的强弱。PCR结果显示重组乳酸菌成功扩增出600、900、2300和2300 bp的P_(ldh)-P_(ldh)、P_(ldh)-P_(ldh)-P_(ldh)、P_(ldh)-AmpR-P_(ldh)-AmpR和P_(ldh)-P_(ldh)-AmpR-AmpR目的片段;Western blot结果显示重组菌均可表达AMPR蛋白,目的蛋白大小均约为28 ku。间接ELISA、荧光定量PCR和AMPR酶活性检测结果均显示,在不同数量启动子P_(ldh)串联乳酸菌表达载体系统中,三启动子驱动AmpR报告基因表达的效率显著高于双启动子(P<0.05),三启动子、双启动子驱动AmpR报告基因表达的效率均极显著高于单启动子(P<0.01),且均极显著高于对照菌pPG-Ampr/HLJ-27(P<0.01);在启动子P_(ldh)与AmpR报告基因不同顺序的乳酸菌表达载体系统中,重组菌pPG-P_(ldh)-P_(ldh)-Ampr-Ampr/HLJ-27驱动AmpR报告基因表达的效率极显著高于重组菌pPG-P_(ldh)-Ampr-P_(ldh)-Ampr/HLJ-27(P<0.01)。本研究利用AmpR报告基因成功构建了5种组成型多启动子P_(ldh)乳酸菌表达系统,结果显示在不同数量启动子P_(ldh)串联驱动单外源蛋白载体系统中,启动子调控转录进而驱动外源基因表达量与启动子数量呈正相关;在双启动子驱动双外源蛋白载体系统中,连续串联两个启动子调控转录进而驱动双外源基因表达效率显著高于两个启动子分别驱动双外源基因表达效率;以上数据为乳酸菌表达载体对外源蛋白的表达效率优化提供了必要的依据。 展开更多

关键词 乳酸菌表达系统 组成型启动子P_(ldh) 启动子活性 外源基因表达效率

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TSA促进转基因猪体细胞核移植胚胎发育和外源基因表达 被引量：6

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作者 孔庆然 朱江 +6 位作者 黄波 郇延军 王峰 石永乾 刘仲凤 武美玲 刘忠华 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期749-756,共8页

不完全的表观遗传重编程是造成转基因克隆动物效率低下的主要原因,组蛋白修饰作为表观遗传修饰的一个重要部分,可以直接影响克隆胚胎的发育和外源基因的表达情况。TSA(Trichostatin A)作为一种组蛋白去乙酰化抑制剂,可以改变组蛋白的乙... 不完全的表观遗传重编程是造成转基因克隆动物效率低下的主要原因,组蛋白修饰作为表观遗传修饰的一个重要部分,可以直接影响克隆胚胎的发育和外源基因的表达情况。TSA(Trichostatin A)作为一种组蛋白去乙酰化抑制剂,可以改变组蛋白的乙酰化水平,促进表观遗传重编程,提高克隆动物的效率。同时TSA能改变染色质结构,使转录因子易于与DNA序列结合,促进外源基因的表达。文章确定了TSA处理转基因猪成纤维细胞和核移植胚胎的最佳条件,分别为250 nmol/L、24 h和40 nmol/L、24 h,通过进一步正交实验发现,TSA同时处理供体细胞和克隆胚胎可以显著的促进核移植胚胎的体外发育。此外,无论TSA处理转基因猪成纤维细胞或核移植胚胎,都可以提高外源基因的表达水平。 展开更多

关键词 TSA 体细胞核移植 胚胎发育 外源基因表达 猪

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丝状真菌瑞氏木霉外源基因表达系统的构建 被引量：8

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作者 汪天虹 吴志红 +1 位作者 刘世利 曲音波 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期736-742,共7页

采用PCR技术体外扩增获得了瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ (CBHⅠ )启动子和终止子序列 .并以大肠杆菌质粒pUC1 9为骨架 ,在该启动子和终止子序列间加入多克隆位点 ,构建了瑞氏木霉强表达整合型载体pTRIL .以质粒pAN7 1为模板 ,... 采用PCR技术体外扩增获得了瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ (CBHⅠ )启动子和终止子序列 .并以大肠杆菌质粒pUC1 9为骨架 ,在该启动子和终止子序列间加入多克隆位点 ,构建了瑞氏木霉强表达整合型载体pTRIL .以质粒pAN7 1为模板 ,体外扩增了带有潮霉素磷酸转移酶(hph)基因的DNA片段 ,将hph插入pTRIL的cbh1启动子和终止子序列之间 ,构建了Pcbh1 hph Tcbh1表达盒 .用此表达盒转化瑞氏木霉C30原生质体 ,在潮霉素平板上得到 1 5株抗性转化子 .对其中的H1转化子进行了PCR和Southern印迹分析 ,证实hph基因确实整合到转化子染色体DNA上 ,并在Pcbh1 启动子控制下进行高效表达 .转化子H1对潮霉素抗性达 1 5 0mg L ,比出发菌株提高 2倍 . 展开更多

关键词 瑞氏木霉 外源基因表达系统 cbhI启动子 构建 表达

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植物病毒—新型的外源基因表达载体 被引量：6

4

作者 彭燕 崔晓峰 周雪平 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期465-472,共8页

与利用转基因植物表达外源基因相比 ,植物病毒载体具有表达水平高、速度快、宿主广等优点 ,是一类新型的外源基因表达载体。本文就植物病毒表达载体的构建策略、应用状况和存在的问题进行了综述。

关键词 植物病毒 外源基因表达 表达载体 植物基因工程

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莱茵衣藻线粒体遗传系统及其外源基因表达 被引量：4

5

作者 胡章立 李建成 程雪薇 《深圳大学学报（理工版）》 EI CAS 北大核心 2013年第6期603-610,共8页

外源基因表达是目前光合生物线粒体遗传系统研究的瓶颈.作者在成功进行光合生物线粒体外源基因稳定表达的基础上,评述光合生物———莱茵衣藻的线粒体遗传表达系统,指出该系统是目前唯一能够有效表达外源功能基因的光合生物.介绍莱茵衣... 外源基因表达是目前光合生物线粒体遗传系统研究的瓶颈.作者在成功进行光合生物线粒体外源基因稳定表达的基础上,评述光合生物———莱茵衣藻的线粒体遗传表达系统,指出该系统是目前唯一能够有效表达外源功能基因的光合生物.介绍莱茵衣藻线粒体基因组结构、mtDNA复制、转录及翻译特性,论述莱茵衣藻线粒体遗传转化方法、转化株筛选标记基因及外源基因表达的研究进展,分析外源基因在线粒体基因组中的同质化过程、表达效率及存在问题,为莱茵衣藻线粒体基因表达调控及反向遗传学研究辟出新径. 展开更多

关键词 基因工程 遗传转化 莱茵衣藻 线粒体基因组 外源基因表达 线粒体遗传 基因调控

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丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建 被引量：4

6

作者 王斌 潘力 郭勇 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2009年第6期84-90,共7页

以米曲霉(Aspergillus oryzae)R IB40的基因组DNA为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增得到启动子、终止子、筛选标记基因等表达元件,依次连接到载体pUC119上,构建了米曲霉的重组表达载体pNMA.将米赫根毛霉脂肪酶基因(RML)连接于pNMA的启动子... 以米曲霉(Aspergillus oryzae)R IB40的基因组DNA为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增得到启动子、终止子、筛选标记基因等表达元件,依次连接到载体pUC119上,构建了米曲霉的重组表达载体pNMA.将米赫根毛霉脂肪酶基因(RML)连接于pNMA的启动子下,得到表达载体pNMA-RML,通过ApaⅠ酶切线性化转化米曲霉宿主菌A.oryzaeniaD300,得到整合型的阳性转化子A.oryzaeONL1.其培养7天的培养液的上清液在以三丁酸甘油酯为底物的平板上形成清晰的水解透明圈,碱滴定法酶活测定表明培养液酶活可达2.5U/mL,培养液上清液的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱在相对分子质量32 500处有RML的特征条带.这说明RML已经在米曲霉中成功表达,同时证明所构建的米曲霉外源基因表达系统是有效的. 展开更多

关键词 米曲霉 外源基因表达 米赫根毛霉脂肪酶 硝酸盐还原酶 标记基因

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毕赤酵母外源基因表达系统研究进展 被引量：8

7

作者 杜中军 朱水芳 +1 位作者 黄文胜 翟衡 《生物技术通报》 CAS CSCD 2002年第4期7-11,共5页

巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris外源基因表达系统已经成功表达了很多胞间型和胞内型蛋白质。与酿酒酵母Saccharomycesceresiviae相比 ,该系统所具有的很多优势使其应用越来越广泛。有关研究主要涉及以下几个方面 :宿主菌株、表达载体、... 巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris外源基因表达系统已经成功表达了很多胞间型和胞内型蛋白质。与酿酒酵母Saccharomycesceresiviae相比 ,该系统所具有的很多优势使其应用越来越广泛。有关研究主要涉及以下几个方面 :宿主菌株、表达载体、转化方法、外源基因整合、外源蛋白糖基化和高密度发酵培养等。 展开更多

关键词 毕赤酵母 外源基因表达系统 研究进展 甲醇营养型酵母

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绿色木霉外源基因表达系统的构建 被引量：2

8

作者 刘芳 杨佳颖 陈红漫 《湖北农业科学》 北大核心 2013年第13期3180-3183,共4页

利用PCR方法克隆瑞氏木霉(Trichoderma reesei)外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ基因(cbhⅠ)启动子序列,以pSK载体为骨架,构建了pSK-cbhⅠ-GFP-hph表达载体,并成功转入到绿色木霉(T.viride)Sn-9106中。通过对绿色木霉Sn-9106进行遗传改造,为... 利用PCR方法克隆瑞氏木霉(Trichoderma reesei)外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ基因(cbhⅠ)启动子序列,以pSK载体为骨架,构建了pSK-cbhⅠ-GFP-hph表达载体,并成功转入到绿色木霉(T.viride)Sn-9106中。通过对绿色木霉Sn-9106进行遗传改造,为纤维素酶基因在木霉中同源重组表达提供遗传转化平台。 展开更多

关键词 绿色木霉(Trichoderma viride) cbhⅠ启动子 绿色荧光蛋白 外源基因表达

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影响大肠杆菌中外源基因表达的因素 被引量：6

9

作者 高慧 孙建义 刘明启 《上海畜牧兽医通讯》 2006年第5期64-65,共2页

关键词 外源基因表达 大肠杆菌 发酵培养 表达效率 克隆与表达 遗传背景 选择利用 目的基因

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牛β-乳球蛋白基因的克隆及其调控外源基因表达的研究

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作者 陈红星 程萱 +3 位作者 杨晓 邓继先 苏国富 黄培堂 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2001年第2期78-82,共5页

目的　制备乳腺生物反应器所必需的乳腺特异性表达的调控序列 ,并验证其指导外源基因表达的能力。方法　用PCR法从奶牛染色体上分 5段扩增出了全长 8 2Kb的牛 β 乳球蛋白基因 ,包括 1 8Kb的 5′侧翼区、1 7Kb的 3′侧翼区及 4 7Kb的g... 目的　制备乳腺生物反应器所必需的乳腺特异性表达的调控序列 ,并验证其指导外源基因表达的能力。方法　用PCR法从奶牛染色体上分 5段扩增出了全长 8 2Kb的牛 β 乳球蛋白基因 ,包括 1 8Kb的 5′侧翼区、1 7Kb的 3′侧翼区及 4 7Kb的gDNA区。扩增出的各片段克隆到T 载体上 ,酶切鉴定及序列分析均证实了所扩增片段的正确性。将五个片段与荧光素酶cDNA拼接成荧光素酶瞬时表达载体并在小鼠乳腺中瞬时表达。结果　注射荧光素酶瞬时表达载体的小鼠乳汁中明显测出了荧光素酶活性。结论　所克隆的牛 β 乳球蛋白基因表达调控序列能够指导外源基因在小鼠乳腺中表达。 展开更多

关键词 小鼠 乳腺 克隆 扩增 荧光素酶 瞬时表达 载体 外源基因表达 Β-乳球蛋白基因 表达调控

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株作为外源基因表达活病毒载体的研究 被引量：2

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作者 陈金霞 张宽 +9 位作者 张玉娇 杜楠楠 郑海红 李丽薇 周艳君 虞凌雪 童武 郑浩 童光志 高飞 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第3期12-19,共8页

利用反向遗传操作技术,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)也可以被用作外源基因表达的活载体。前期研究将猪瘟病毒E2蛋白的编码基因插入了高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的非结构蛋白和结构蛋白编码间区,所拯救的重组病毒rPRRSV-E2能够... 利用反向遗传操作技术,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)也可以被用作外源基因表达的活载体。前期研究将猪瘟病毒E2蛋白的编码基因插入了高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的非结构蛋白和结构蛋白编码间区,所拯救的重组病毒rPRRSV-E2能够在体外和体内高效表达E2蛋白。能够为猪瘟和HP-PRRS的感染提供100%的免疫保护。本研究利用rPRRSV-E2的全长感染性克隆平台,在PRRSV基因组ORF7和3'非翻译区之间插入了转录调控序列6(TRS6)和绿色荧光蛋白的编码基因,构建并拯救了重组病毒rPRRSV-E2-EGFP,该病毒感染MARC-145细胞后,可以同时表达猪瘟E2蛋白和EGFP。外源序列在载体中能够保持遗传稳定。本研究为开发PRRSV作为病毒活载体疫苗提供了一个新的外源基因插入位点和构建策略,对今后多价疫苗的研发有重要意义。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 3'非翻译区 转录调控序列 外源基因表达

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用海洋蓝细菌启动子构建的启动子探针载体进行外源基因表达

12

作者 李思经 《生物技术通报》 CAS CSCD 1997年第2期51-51,共1页

关键词 海洋蓝细菌 启动子探针载体 外源基因表达

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转双抗虫基因欧美杨107杨中外源基因的表达 被引量：8

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作者 张益文 任亚超 +2 位作者 刘娇娇 梁海永 杨敏生 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第12期45-52,共8页

【目的】鉴定并分析转双抗虫基因(BtCryl Ac和API基因)欧美杨107杨(简称:转基因107杨)中外源基因的表达情况,并且筛选出对鳞翅目害虫美国白蛾和杨扇舟蛾具有高抗虫性的转基因107杨株系【方法】以10个转基因107杨株系2年生田间苗为试验材... 【目的】鉴定并分析转双抗虫基因(BtCryl Ac和API基因)欧美杨107杨(简称:转基因107杨)中外源基因的表达情况,并且筛选出对鳞翅目害虫美国白蛾和杨扇舟蛾具有高抗虫性的转基因107杨株系【方法】以10个转基因107杨株系2年生田间苗为试验材料,未转基因107杨为对照(CK),进行外源基因表达测定,包括PC R检测、绝对荧光定量PC R检测和毒蛋白检测以及鳞翅目害虫抗虫性对比试验【结果】PCR检测结果表明,10个转基因株系均检测到外源基因BtCryl Ac和API而对照未检测到,证明BtCryl Ac和API基因已稳定插入转基因植株基因组中。荧光定量PCR检测表明,8月份PB1,PB2,PB6,PB9和PB10这5个株系BtCryl Ac基因的转录丰度较高为1.72×10~8~7.91×10~9,PB1最高;PB3,PB7和PB8次之为1.03×10~7~2.35×10~7;PB4和PB5与对照一样未检测到BtCrylAc基因的转录表达。ELISA毒蛋白检测表明,CrylAc毒蛋白的表达量与转录丰度大小变化趋势一致,PBl最高,为665.11 ng·g^(-1),PB4和PB5与对照一样未检测到毒蛋白。室内饲虫试验证明转基因107杨对美国白蛾幼虫的杀虫效果高于杨扇舟蛾幼虫。8个表达毒蛋白的转基因株系对1-6龄美国白蛾幼虫的致死率均为100%,但致死时间存在一定差异,PB1和PB2对各龄幼虫的致死时间均较短;PB1,PB2,PB6,PB9和PB10对1~4龄杨扇舟蛾幼虫的致死率均为100%,其中PB1和PB2的致死时间较短,PB3,PB7和PB8对1~2龄杨扇舟蛾幼虫的致死率为100%,对3龄和4龄的致死率最高为22.22%。综合抗虫对比试验结果,可以将8个转基因株系划分为2个抗性水平:PB1,PB2,PB6,YB9和PB10为高抗株系对美国白蛾和杨扇舟蛾均表现高抗性;PB3,PB7和PB8为中抗株系,对杨扇舟蛾表现出中等抗性,但对美国白蛾表现出高抗性。【结论】通过对转基因107杨进行一系列分子检测及室内抗虫对比试验,证明外源基因已成功导入杨树基因组并稳定存在,并且有8个株系高效表达;抗虫试验证明转基因107杨对美国白蛾和杨扇舟蛾具有明显的抗性,筛选出的5个株系对2种害虫都具有高抗性,另外3个株系PB3,PB7和PB8对美国白蛾具有很高的抗性,而对杨扇舟虫我则表现出中低抗性。 展开更多

关键词 双抗虫基因 欧美杨107杨 外源基因表达 BT毒蛋白 抗虫性

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宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达 被引量：4

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作者 易咏竹 陈寅 +2 位作者 张志芳 何家禄 秦俭 《蚕业科学》 CAS CSCD 2002年第4期304-307,共4页

通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体... 通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。 展开更多

关键词 表达载体 宿主域 外源基因表达 家蚕 昆虫杆状病毒表达系统 HyBacPAK6

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外源基因在转基因动物中遗传和表达的稳定性 被引量：15

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作者 孔庆然 刘忠华 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期504-511,共8页

转基因技术经过近半个世纪的发展,已成为当今生物技术研究的热点。近10多年来,与核移植技术的结合,转基因效率大大提高,携带有不同外源基因的不同种类的转基因动物迅速增加。但是,成功获得转基因动物并不是转基因动物研究的最终目的,如... 转基因技术经过近半个世纪的发展,已成为当今生物技术研究的热点。近10多年来,与核移植技术的结合,转基因效率大大提高,携带有不同外源基因的不同种类的转基因动物迅速增加。但是,成功获得转基因动物并不是转基因动物研究的最终目的,如何利用转基因技术为人类的需求服务才是科研人员始终面对的课题。在畜牧生产领域,通过转基因技术培育家畜新品种是转基因技术应用的重要体现,在我国这方面已经引起了广泛关注。但迄今为止,外源基因在转基因动物中遗传和表达的稳定性仍然是亟待解决的问题,究其原因,这主要与位置效应、外源基因的表观遗传学修饰和遗传效率相关,文章结合目前的研究进展和本实验室的研究结果,从这3方面阐述其作用机制,期望为转基因动物遗传育种向产业化的迈进提供一定的理论探讨。 展开更多

关键词 转基因动物 外源基因遗传 外源基因表达

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家蚕杆状病毒载体构建及外源基因的表达 被引量：4

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作者 崔红娟 鲁成 《蚕学通讯》 1999年第2期16-20,共5页

本文介绍了杆状病毒载体构建方法,分析了影响外源基因表达效率的因素,概述了近年来家蚕杆状病毒栽体在蚕体内表达外源基因产物所取得的成绩,并指出了这一系统存在的问题,提出了改进意见.

关键词 家蚕 杆状病毒载体 外源基因的表达

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核基质结合区在转基因烟草中提高报导基因的表达水平 被引量：5

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作者 李旭刚 朱祯 +2 位作者 徐军望 徐鸿林 肖桂芳 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2000年第9期9-13,共5页

从豌豆基因组中分离了位于质体蓝素 (Plastocyanin)基因下游的核基质结合区(Matrixattachmentregion ,MAR)。为进一步研究此段MAR序列在转基因植物中对外源基因表达水平的影响 ,将MAR序列构建在报导基因 β 葡糖醛酸酶 (β glucuronidas... 从豌豆基因组中分离了位于质体蓝素 (Plastocyanin)基因下游的核基质结合区(Matrixattachmentregion ,MAR)。为进一步研究此段MAR序列在转基因植物中对外源基因表达水平的影响 ,将MAR序列构建在报导基因 β 葡糖醛酸酶 (β glucuronidase ,GUS)基因和植物选择标记新霉素磷酸转移酶 (Neomycinphosphotransferase ,NPT II)基因的两侧形成T DNA结构。采用叶盘法 ,经农杆菌介导转化烟草。GUS定量检测表明 ,MAR的存在使GUS基因的平均表达水平提高了 2倍。 展开更多

关键词 核基质结合区 转基因植物 β-葡糖醛酸酶 外源基因表达

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提高植物疫苗外源蛋白表达量的研究进展 被引量：5

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作者 董玲 李海龙 +2 位作者 刘辉 韩亚杰 陈创夫 《内蒙古农业科技》 2006年第2期27-29,共3页

综述了在转基因植物中实现外源基因高效表达的多种途径,其中包括启动子优化,添加5-′3-′非翻译序列,使用增强子,对目的基因进行改造与优化,消除位置效应,内含子在增强基因表达方面的应用,重组蛋白的细胞定位。

关键词 转基因植物 提高外源基因表达

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转多基因欧美杨Bt基因表达特征 被引量：4

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作者 张超 王进茂 +3 位作者 赵洁 庞丁玮 张德健 杨敏生 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第9期61-70,共10页

【目的】探究转多基因欧美杨107杨中外源Bt基因是否稳定存在及表达,探索转基因107杨不同时间、不同部位Bt毒蛋白表达规律,研究多基因转化的载体结构及基因互作对外源基因表达稳定性和高效性的影响。【方法】选取1年生转Cry1Ac-Cry3A-NT... 【目的】探究转多基因欧美杨107杨中外源Bt基因是否稳定存在及表达,探索转基因107杨不同时间、不同部位Bt毒蛋白表达规律,研究多基因转化的载体结构及基因互作对外源基因表达稳定性和高效性的影响。【方法】选取1年生转Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107杨3个株系(A1、A2、A3)和转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨3个株系(B1、B2、B3),通过PCR技术对转基因107杨中外源基因进行检测和验证,通过实时荧光定量PCR对Bt基因的转录丰度进行检测,利用ELISA技术对转基因107杨不同时间、不同部位毒蛋白含量进行检测。【结果】PCR检测结果显示,转基因107杨均能扩增出与阳性对照大小一致的特异性条带,阴性对照未扩增出特异性条带,证明外源基因在转基因107杨中稳定存在;实时荧光定量PCR检测结果表明,2种Bt基因在转基因107杨中均能稳定表达,Cry1Ac基因的转录丰度在2.1×10^4~5.1×10^4之间,Cry3A基因的转录丰度在2.8×10^6~5.6×10^7之间,Cry1Ac基因和Cry3A基因转录丰度无相关性;ELISA技术检测结果显示,转基因107杨中均检测到Cry1Ac和Cry3A毒蛋白存在。2种Bt基因转录丰度和毒蛋白含量无相关性,但2种Bt毒蛋白含量之间呈现出正相关关系。转2种不同载体的107杨6、7月份2种Bt毒蛋白的含量较低,8月份急剧上升,Cry1Ac毒蛋白的含量均在9月份达到峰值,Cry3A毒蛋白含量均在8月份达到峰值,10月急剧下降。8月份不同部位(上、中、下)的叶片Bt毒蛋白含量未表现出一致性规律,不同部位(上、中、下)木质部的Bt毒蛋白含量也未呈现出一致性规律。【结论】转Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107杨和转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨不同株系间2种Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因;2种Bt毒蛋白在各株系间存在显著差异,Cry1Ac毒蛋白含量极低,Cry3A毒蛋白含量极显著高于Cry1Ac,与转录水平检测结果一致。2种不同载体之间Cry1Ac基因转录丰度、毒蛋白表达模式及含量无明显差异,Cry3A基因转录丰度、毒蛋白表达模式及含量也无明显差异。在转基因107杨整个生长季中,Cry1Ac和Cry3A平均毒蛋白含量变化趋势基本一致,呈单峰模式。 展开更多

关键词 转基因杨树 多基因载体 基因互作 外源基因表达 BT毒蛋白

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高产纤维素酶绿色木霉基因工程菌的构建 被引量：4

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作者 胡耀辉 闫舟 于寒松 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第25期13617-13619,13625,共4页

[目的]构建CBHⅡ基因过量表达的绿色木霉工程菌。[方法]根据绿色木霉cDNA序列设计合成引物,PCR扩增CBHⅡ基因序列,将完整的目的基因与表达载体pCAMBIA1302连接,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组质粒pCAMBIA1302-CBHⅠ。再将pCAM-BIA1302-CB... [目的]构建CBHⅡ基因过量表达的绿色木霉工程菌。[方法]根据绿色木霉cDNA序列设计合成引物,PCR扩增CBHⅡ基因序列,将完整的目的基因与表达载体pCAMBIA1302连接,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组质粒pCAMBIA1302-CBHⅠ。再将pCAM-BIA1302-CBHⅠ重组质粒与瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHⅡ)PcbhⅡ启动子片段连接,将潮霉素磷酸转移酶(hyg)基因片段插入PcbhⅡ启动子下游,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组表达质粒pCAMBIA1302-CBHⅡ。[结果]构建的重组表达质粒电转化后经SDS-PAGE电泳检测,绿色木霉纤维素酶CBHII基因在原宿主菌中成功过量表达,证实CBHⅡ基因在PcbhⅡ启动子控制下进行高效表达。[结论]为高产纤维素酶系的工业化菌株构建奠定基础。 展开更多

关键词 绿色木霉 CBHⅡ基因 瑞氏木霉启动子 外源基因表达系统

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