体内复制缺陷型腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶基因转染胶质瘤细胞对5-氟胞嘧啶敏感

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作者 吕彦恩 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1996年第2期129-129,共1页

病毒介导的化学敏感基因的转染,为肿瘤的治疗提供了一条有希望的新途径,目前脑肿瘤的基因治疗集中在将包装携带TK基因的逆转录病毒的细胞系植入肿瘤,其主要局限性是逆转录病毒在体内的转染几乎无效,即只有和包装细胞非常接近的胶质瘤细... 病毒介导的化学敏感基因的转染,为肿瘤的治疗提供了一条有希望的新途径,目前脑肿瘤的基因治疗集中在将包装携带TK基因的逆转录病毒的细胞系植入肿瘤,其主要局限性是逆转录病毒在体内的转染几乎无效,即只有和包装细胞非常接近的胶质瘤细胞才易被转染,且TK基因疗法所产生的旁观者效应需依赖细胞间的直接接触。本文介绍通过复制缺陷的腺病毒载体介导将细菌胞嘧啶脱氨酶(cd)基因转染至大鼠9L胶质瘤细胞,使其对在正常细胞没有毒性的核苷-5-氟胞嘧啶(5-Fc)敏感。 展开更多

关键词 体内复制 缺陷型腺病毒载体 胞嘧啶脱氨酶 基因转染 胶质瘤细胞 5-氟胞嘧啶 敏感性 脑肿瘤 基因治疗

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负载肝素酶复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定 被引量：2

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作者 陈陵 蔡永国 +4 位作者 郑兴春 杨仕明 房殿春 罗元辉 王东旭 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期38-41,共4页

目的包装负载人肝素酶(hpa)全长cDNA的复制缺陷型腺病毒载体(Adhpa)。方法将肝素酶正义腺病毒穿梭质粒pDC315hpa与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Adhpa,并大量扩增,收集纯化。对纯化后的Adhpa进行... 目的包装负载人肝素酶(hpa)全长cDNA的复制缺陷型腺病毒载体(Adhpa)。方法将肝素酶正义腺病毒穿梭质粒pDC315hpa与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Adhpa,并大量扩增,收集纯化。对纯化后的Adhpa进行滴度测定、感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×1010pfu/ml。电镜证实病毒浓缩液中存在病毒颗粒,并可见病毒在HEK293细胞中复制。PCR双引物鉴定Adhpa可扩增出Ad及hpa特异片段,而对照则不能扩增出hpa片段。结论成功包装了负盘。 展开更多

关键词 肝素酶 腺病毒科 复制缺陷型腺病毒载体 转染

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表达狂犬病毒糖蛋白基因复制缺陷型重组腺病毒的构建及其特性 被引量：8

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作者 李文辉 张云 +2 位作者 王树惠 刘力 杨帆 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期650-654,共5页

目的构建表达狂犬病毒CVS-N2C毒株糖蛋白(GP)基因的复制缺陷型重组腺病毒,作为筛选狂犬病毒基因工程疫苗的基础。方法用大肠杆菌细胞内同源重组技术构建重组病毒;NorthernblotWesternblot和免疫荧光抗体等方法鉴定重组病毒。结果重组病... 目的构建表达狂犬病毒CVS-N2C毒株糖蛋白(GP)基因的复制缺陷型重组腺病毒,作为筛选狂犬病毒基因工程疫苗的基础。方法用大肠杆菌细胞内同源重组技术构建重组病毒;NorthernblotWesternblot和免疫荧光抗体等方法鉴定重组病毒。结果重组病毒具有典型的病毒形态;病毒基因组稳定;GP基因可被转录;重组病毒表达的GP蛋白相对分子质量为66000,与天然GP相对分子质量相符表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒免疫血清特异性识别;小鼠免疫-攻击试验可保护87.5%～100%动物。结论成功地构建了表达狂犬病毒CVS-N2C毒株GP基因的复制缺陷型重组腺病毒,并表现了良好的免疫效果。 展开更多

关键词 重组腺病毒 狂犬病毒 CVS-N2C 复制缺陷型

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依托泊苷提高复制缺陷型腺病毒介导外源基因在肿瘤细胞中的表达水平 被引量：4

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作者 张圣海 吴继红 +6 位作者 刘新建 陈霞芳 田毓华 谢匡成 于慧 潘虹 黄倩 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2007年第1期14-20,共7页

目的：研究化疗药物依托泊苷对腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内表达水平的影响。方法：携带外源基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-EGFP（MOI为1或10）单独或联合终质量浓度为0．2、2、20、40、80、100和... 目的：研究化疗药物依托泊苷对腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内表达水平的影响。方法：携带外源基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-EGFP（MOI为1或10）单独或联合终质量浓度为0．2、2、20、40、80、100和200μg／ml的依托泊苷感染体外培养的肿瘤细胞NCI-H446（人非小细胞肺癌细胞株）、A549（人肺腺癌细胞株）、SMMC-7721（人肝癌细胞株）、SGC7901（人胃癌细胞株）、SKBR-3（人乳腺癌细胞株）和BTT（小鼠膀胱移行上皮癌细胞株）后不同时间，流式细胞仪分析肿瘤细胞EGFP阳性率和平均荧光强度，Western blotting检测EGFP蛋白表达，RT—PCR和实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞内EGFP的mRNA表达量和DNA拷贝数。结果：不同剂量的依托泊苷可不同程度地提高Ad5-CMV-EGFP在7种肿瘤细胞内的表达水平，但对EGFP阳性率无明显提高。10 MOI的Ad5-CMV-EGFP联合40μg／ml依托泊苷分别感染肿瘤细胞NCI-H446、NCI-H460、A549、SMMC-7721、SGC7901、SKBR-3和BTT 24h后，细胞内EGFP的荧光强度分别是单独感染的3．3、3．5、3．1、6．2、7．0、5．4和3．4倍。Ad5-CMV-EGFP联合应用依托泊苷后肿瘤细胞内EGFP蛋白表达增加2～5倍，EGFP mRNA表达量提高，但DNA拷贝数未见明显改变。结论：依托泊苷可提高腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内的表达水平，该作用可能是在转录水平上发挥作用的。 展开更多

关键词 复制缺陷型腺病毒 依托泊苷 肿瘤 基因表达

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单重靶向条件复制型腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K的构建及鉴定 被引量：2

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作者 王宏芳 李金华 +4 位作者 刘扬 李艳博 王志成 刘威武 龚守良 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期821-824,共4页

目的:构建并鉴定一种新型E1A基因CR2区选择性缺失的腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K,为包装单重靶向条件复制型腺病毒进行肿瘤基因治疗奠定基础。方法:采用RT-PCR法从人胚肾细胞(293T)中扩增条件复制型腺病毒必需的E1区基因,包... 目的:构建并鉴定一种新型E1A基因CR2区选择性缺失的腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K,为包装单重靶向条件复制型腺病毒进行肿瘤基因治疗奠定基础。方法:采用RT-PCR法从人胚肾细胞(293T)中扩增条件复制型腺病毒必需的E1区基因,包括E1A、E1Bp及E1B55K基因片段;重叠PCR法扩增CR2区缺失的E1A基因;采用基因重组技术构建pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K重组质粒,并进行PCR及酶切鉴定。结果:经测序证实获得的E1B55K及CR2区缺失的E1A基因与GenBank公布的完全一致,E1A基因CR2区缺失的pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K质粒经分别经XbaⅠ与KpnⅠ单酶切,得到大小约为817和1244bp的酶切片段,PCR鉴定得到约250及1148bp的基因片段,鉴定结果与预期结果完全一致。结论:E1A基因CR2区选择性缺失的单重靶向条件复制型腺穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K构建成功。 展开更多

关键词 条件复制型腺病毒 穿梭载体 E1A基因

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复制缺陷型慢病毒载体法高效制作转基因家禽 被引量：2

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作者 徐世永 刘红林 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期F0003-F0003,共1页

关键词 慢病毒载体 转基因家禽 载体法 缺陷型 制作 复制 分化细胞 绿色荧光蛋白

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细菌内快速构建两种用于肝纤维化基因治疗的重组复制缺陷型腺病毒

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作者 林勇 谢渭芬 +4 位作者 张忠兵 陈伟忠 张新 曾欣 陈岳祥 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期654-657,共4页

目的 :在大肠杆菌内快速构建两种分别含有人肝细胞生长因子 (hepatic growth factor,HGF)和非分泌型人尿激酶型纤溶酶原激活剂 (urokinase- type plasm inogen activator,u PA) c DNA片段的重组复制缺陷型腺病毒。方法 :分别将人 HGF和 ... 目的 :在大肠杆菌内快速构建两种分别含有人肝细胞生长因子 (hepatic growth factor,HGF)和非分泌型人尿激酶型纤溶酶原激活剂 (urokinase- type plasm inogen activator,u PA) c DNA片段的重组复制缺陷型腺病毒。方法 :分别将人 HGF和 u PA c DNA片段与穿梭载体 p Track- CMV连接 ,线性化后与骨架载体 Ad Easy- 1在大肠杆菌 BJ5 183内同源重组获得腺病毒载体 p Ad HGF和 p Adu PA,经 2 93细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒 Ad HGF和 Adu PA;将 Ad HGF和 Adu PA分别体外感染肝细胞株 L0 2 ,以 Northern印迹法和 Western印迹法检测两种病毒在肝细胞中的表达。 结果 :连接、重组后通过酶切和测序法筛选出病毒质粒 p Ad HGF和 p Adu PA;经 2 93细胞包装 ,3d后均观察到绿色荧光蛋白明显表达 ,Cs Cl梯度离心纯化最终分别获得 4× 10 1 0 efu/ m l滴度的重组病毒 Ad HGF和 6× 10 1 0 efu/ ml Adu PA;两种病毒体外感染肝细胞 3d后 ,HGF和u PA表达均明显增加。结论 :细菌内同源重组制备复制缺陷型腺病毒 ,纯化过程简单 ,重组腺病毒在肝细胞中均高效表达 。 展开更多

关键词 肝纤维化 基因治疗 细菌内快速构建 重组复制缺陷型腺病毒 治疗

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表达非洲猪瘟病毒P72蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：14

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作者 胡永新 赵永刚 +4 位作者 张永强 刘拂晓 樊晓旭 吴晓东 王志亮 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1635-1641,共7页

本研究旨在构建能够表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白的缺陷型重组腺病毒。参考ASFV China-SY18株的基因序列,合成B646L基因。先将合成的B646L基因通过TOPO连接克隆到过渡载体pENTR/D-TOPO中;再将插入B646L基因的过渡载体pENTR/D-TOPO-ASF... 本研究旨在构建能够表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白的缺陷型重组腺病毒。参考ASFV China-SY18株的基因序列,合成B646L基因。先将合成的B646L基因通过TOPO连接克隆到过渡载体pENTR/D-TOPO中;再将插入B646L基因的过渡载体pENTR/D-TOPO-ASFV-P72与pAd/CMV/V5-DEST腺病毒骨架载体进行重组,得到pAd-ASFV-P72重组质粒;重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,连续传代后获得重组腺病毒。结果表明,获得的Ad5-ASFV-P72重组腺病毒的滴度为2.53×10^9 IFU·m^L^-1;经免疫荧光方法及Western blot鉴定ASFV-P72蛋白在Vero细胞中成功表达,且能够与ASFV标准阳性血清发生特异性反应。本研究成功获得能够表达ASFV P72蛋白的重组腺病毒Ad5-ASFV-P72,不仅为ASFV多基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了一定基础,还为ASFV相关血清学诊断方法的建立提供了安全有效的抗原。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 复制缺陷型腺病毒 P72蛋白

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猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原共表达的复制缺陷型重组腺病毒构建及鉴定 被引量：2

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作者 刘文晓 高志强 +4 位作者 蒲静 张伟 刘环 牛建蕊 张鹤晓 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2016年第9期3-6,共4页

通过RT-PCR技术和重叠PCR技术扩增出含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的A抗原表位和D抗原表位,构建复制缺陷型腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与腺病毒骨架质粒经PacI线性化之后,共同转染AD-293细胞,获得共表达A、D抗原表位的复制缺陷型重组腺病... 通过RT-PCR技术和重叠PCR技术扩增出含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的A抗原表位和D抗原表位,构建复制缺陷型腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与腺病毒骨架质粒经PacI线性化之后,共同转染AD-293细胞,获得共表达A、D抗原表位的复制缺陷型重组腺病毒。经Western Blotting检测,该重组腺病毒能够正确表达目的蛋白基因,而且目的蛋白能够与猪传染性胃肠炎阳性血清反应。本研究结果为猪传染性胃肠炎重组疫苗研发奠定基础。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎 复制缺陷型腺病毒 疫苗

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表达PCV2 Cap蛋白重组复制缺陷型腺病毒黏膜免疫效果 被引量：2

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作者 邓祖丽颖 刘雨丰 +1 位作者 马宁宁 陈陆 《河南农业科学》 北大核心 2020年第10期143-148,共6页

为研发高效的猪圆环病毒2型(PCV2)黏膜疫苗,通过口服、肌内和滴鼻途径,将表达PCV2 Cap蛋白主要抗原表位的重组复制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)免疫Balb/c小鼠,同时以无外源基因的空腺病毒(wild-rAd)经滴鼻途径免疫Balb/c小鼠作为对照组,... 为研发高效的猪圆环病毒2型(PCV2)黏膜疫苗,通过口服、肌内和滴鼻途径,将表达PCV2 Cap蛋白主要抗原表位的重组复制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)免疫Balb/c小鼠,同时以无外源基因的空腺病毒(wild-rAd)经滴鼻途径免疫Balb/c小鼠作为对照组,分别检测小鼠血清中IgG和唾液、肺部、肠道灌洗液中IgA抗体水平,脾脏T淋巴细胞亚群及相关细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌水平以及淋巴结、脾脏和肺组织中PCV2病毒载量,评价其黏膜免疫效果。结果显示,与对照组相比,rAd/Cap/518经肌内途径免疫诱导产生的血清IgG抗体水平显著增加;经滴鼻和口服途径免疫诱导产生的局部黏膜部位IgA抗体水平显著增加。rAd/Cap/518经滴鼻、肌内和口服3种途径免疫诱导产生的CD3+T细胞百分率为46.60%~55.65%,经滴鼻免疫诱导产生的CD3+CD4+T细胞百分率为34.43%~37.29%,经肌内和口服途径免疫诱导产生的CD3+CD4+T细胞百分率为36.35%~41.58%,经滴鼻途径免疫诱导的CD3+CD8+T细胞百分率为12.39%~18.32%,经口服免疫诱导的CD3+CD8+T细胞百分率为16.29%,均显著高于对照组。rAd/Cap/518经滴鼻途径免疫后,能诱导小鼠脾脏和肠系膜淋巴细胞分泌IFN-γ。攻毒后免疫鼠体内病毒载量显著降低。综上,rAd/Cap/518经肌内途径免疫主要诱导全身性免疫应答,经滴鼻和口服途径免疫能诱导全身性和局部黏膜免疫应答,是一种很有前景的黏膜免疫候选疫苗。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 CAP蛋白 复制缺陷型腺病毒 黏膜免疫 免疫效果

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表达大熊猫源犬瘟热病毒H蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：4

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作者 陈廷炜 孟宪踊 +3 位作者 王铁成 高玉伟 冯娜 夏咸柱 《野生动物学报》 北大核心 2021年第3期747-754,共8页

为构建能够表达大熊猫源犬瘟热病毒(CDV)分离株giant panda/SX/2014 H蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增株giant panda/SX/2014 H基因,通过TOPO连接克隆至入门载体pENTR/D-TOPO,得到重组入门质粒pENTR/D-T... 为构建能够表达大熊猫源犬瘟热病毒(CDV)分离株giant panda/SX/2014 H蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增株giant panda/SX/2014 H基因,通过TOPO连接克隆至入门载体pENTR/D-TOPO,得到重组入门质粒pENTR/D-TOPO-CDV-H,然后与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST进行LR重组,获得重组质粒pAd-CDV-H;重组质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,获得重组腺病毒rAd-CDV-H,连续传代后对获得的重组腺病毒分别进行病毒滴定、免疫荧光和Western blot鉴定。经免疫荧光方法及Western blot鉴定结果表明,重组腺病毒rAd-CDV-H感染293A细胞、Vero细胞后均可以成功表达H蛋白,获得的重组腺病毒的滴度高达1010IFU/mL。成功获得能够表达大熊猫源CDV H蛋白的重组腺病毒rAd-CDV-H,在进一步证明其安全有效后,可为大熊猫犬瘟热免疫预防提供候选疫苗株。 展开更多

关键词 犬瘟热病毒 H基因 复制缺陷型重组腺病毒 大熊猫源

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表达PEDV中国变异株S蛋白复制型重组人腺病毒4型的构建及其免疫原性研究 被引量：4

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作者 王晓雪 刘延珂 +7 位作者 杨东东 吴艳阳 高冬生 王永生 李永涛 赵军 王川庆 张改平 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期127-132,共6页

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白复制型重组人腺病毒4型(HAdV-4)及评价其免疫原性,本研究利用RT-PCR扩增得到PEDV中国变异株纤突(S)基因的N-末端区域(1 bp^1 140 bp),构建重组质粒p Ad4FAST-Shuttle-S,重组质粒经线性化和同源重... 为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白复制型重组人腺病毒4型(HAdV-4)及评价其免疫原性,本研究利用RT-PCR扩增得到PEDV中国变异株纤突(S)基因的N-末端区域(1 bp^1 140 bp),构建重组质粒p Ad4FAST-Shuttle-S,重组质粒经线性化和同源重组,得到含有PEDV S基因的重组HAdV-4感染性克隆,纯化的感染性克隆DNA经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞,拯救得到表达PEDV变异株S蛋白的重组病毒rAd4△E3-S。将该重组病毒免疫小鼠,间接ELISA测定其血清中抗S蛋白抗体水平,利用体外淋巴细胞转化试验和流式细胞技术检测免疫小鼠T淋巴细胞反应。结果显示,重组病毒能够表达PEDV S蛋白,并且能刺激小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答。本实验结果为进一步研究重组病毒在猪体上的免疫反应奠定基础,也为PEDV活载体疫苗的研发提供实验依据。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 S基因 复制型重组人腺病毒血清4型 活载体疫苗

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携带黏附素P97蛋白C端的复制缺陷重组腺病毒载体

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作者 王科文 Faust Ren Okambaa 《国外畜牧学（猪与禽）》 2011年第3期59-63,共5页

本研究评估了一种P97复制缺陷的重组腺病毒(rAdP97c)亚单位疫苗对猪的免疫效力。研究结果发现该疫苗诱导机体产生了高水平的针对P97的体液免疫和细胞免疫。与攻毒前未免疫组[(45.8±11.5)%]相比,该疫苗免疫猪肺部的眼观损伤要少一些... 本研究评估了一种P97复制缺陷的重组腺病毒(rAdP97c)亚单位疫苗对猪的免疫效力。研究结果发现该疫苗诱导机体产生了高水平的针对P97的体液免疫和细胞免疫。与攻毒前未免疫组[(45.8±11.5)%]相比,该疫苗免疫猪肺部的眼观损伤要少一些[(18.5±9.6)%],同时,肺部炎症反应和呼吸道中肺炎支原体的含量显著减少。此外,与攻毒前未免疫组(0.568±0.104kg/d)相比,该免疫组猪的平均日增重略高(0.672±0.068kg/d)。但是,瑞福特-(Suvaxyn^(?)MH-one)尽管无法引起体内的P97特异性免疫反应,但它比该疫苗更能有效地诱导产生保护性免疫应答。 展开更多

关键词 重组腺病毒载体 缺陷 复制 粘附素 亚单位疫苗 免疫效力 C端 蛋白

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复制缺陷型BmNPV载体的构建及初步应用 被引量：4

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作者 费伟强 陈琴 +7 位作者 陈倩 梅文枫 边腾飞 吕正兵 于威 陈健 张耀洲 吴祥甫 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期514-521,共8页

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)表达载体系统可以利用线性化技术或通过Bac-to-Bac系统构建重组病毒。为了解决采用这些方法构建重组病毒需要多步克隆和筛选,无法满足实验室水平快速和高通量表达目的蛋白质需求的问题,建立了一种快速便捷的... 家蚕核型多角体病毒(BmNPV)表达载体系统可以利用线性化技术或通过Bac-to-Bac系统构建重组病毒。为了解决采用这些方法构建重组病毒需要多步克隆和筛选,无法满足实验室水平快速和高通量表达目的蛋白质需求的问题,建立了一种快速便捷的重组病毒构建方法。首先以BmNPV基因组为基础构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid,进而利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列,构建了一种复制缺陷型BmNPV穿梭载体RD-BmBacmid。利用RD-BmBac-mid单独转染或者与pBacPAK8-AcGFP共转染BmN细胞,证实了该载体的复制缺陷性,即需经同源重组修复orf1629基因后方可产生重组病毒。利用复制缺陷型BmNPV载体正筛选可以快速构建重组病毒表达目的蛋白质。 展开更多

关键词 家蚕杆状病毒穿梭载体 RED重组 复制缺陷型 转染 正筛选

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腺病毒载体介导人KDR胞外段诱导抗小鼠肝癌的免疫效应 被引量：1

15

作者 谭晓华 吴彬 +2 位作者 王芳 刘兵 王友臣 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2007年第4期312-316,共5页

目的:探讨复制缺陷型腺病毒载体(Ad)介导人血管内皮细胞生长因子受体-2(hVEGFR-2或hKDR)胞外段诱导抗小鼠肝癌血管免疫及打破免疫耐受的效果。方法:构建Ad hKDRE,用Ad hKDRE皮内免疫C57BL/6小鼠,7d后取脾细胞作为效应细胞(E),Hepa1-6/m... 目的:探讨复制缺陷型腺病毒载体(Ad)介导人血管内皮细胞生长因子受体-2(hVEGFR-2或hKDR)胞外段诱导抗小鼠肝癌血管免疫及打破免疫耐受的效果。方法:构建Ad hKDRE,用Ad hKDRE皮内免疫C57BL/6小鼠,7d后取脾细胞作为效应细胞(E),Hepa1-6/mKDR作为靶细胞(T),行乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测特异性CTL杀伤活性;给免疫小鼠接种肝癌细胞Hepa1-6,观察荷瘤小鼠成活情况。结果:Ad hKDRE免疫小鼠1周后,在E∶T为100∶1、50∶1和25∶1时,Ad hKDRE诱导的6hCTL杀伤率分别为(81.5±5.6)%、(68.4±5.5)%和(39.6±3.9)%。Ad hKDRE免疫小鼠1周后接种2×106 Hepa1-6肝癌细胞,观察2个月无小鼠成瘤;接种5×106 Hepa1-6细胞,小鼠无瘤成活率为60%。上述CTL效应和抗成瘤作用在清除CD8+和CD4+ T淋巴细胞后消失。结论:Ad介导异种(人)KDR胞外段能有效地打破小鼠肝癌的免疫耐受,诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应,这种特异性细胞免疫反应是CD4+和CD8+ T细胞依赖性的。 展开更多

关键词 复制缺陷型腺病毒载体 原发性肝癌 血管内皮细胞生长因子受体-2 异种抗原

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表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5的构建及鉴定

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作者 徐婷 熊挺 +5 位作者 李淋雨 刘郁夫 温良海 谢文婷 杨泽坤 陈瑞爱 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第12期1424-1434,共11页

【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源... 【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源重组将VP2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI构建重组穿梭质粒pAdTrack-VP2;PmeⅠ酶线性化pAdTrack-VP2后热击转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞,利用菌内同源重组构建重组腺病毒质粒pAd-VP2;将pAd-VP2经PacⅠ酶线性化和纯化后转染HEK293A细胞,包装表达VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5 (rAd5-VP2),将鉴定正确的重组病毒感染非复制型细胞(Vero、CEF和DF1细胞)并分析目的蛋白的表达情况。【结果】将rAd5-VP2通过HEK293A细胞扩大培养,测得第10代病毒的滴度为7.9×10~9 IFU/mL;RT-PCR结果显示,VP2基因在重组腺病毒中能稳定翻译;Western blotting和间接免疫荧光试验均检测到VP2蛋白的表达,蛋白分子质量为41 ku;将rAd5-VP2感染Vero、CEF和DF1细胞也检测到VP2蛋白的表达,表明HAdV-5有作为IBDV活载体疫苗研发的可能性。【结论】本研究构建了重组复制缺陷型HAdV-5,该毒株能感染部分哺乳动物细胞和家禽细胞并能检测到目的蛋白的表达。 展开更多

关键词 传染性法氏囊病 VP2蛋白 重组复制缺陷型人5型腺病毒

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降落和重叠延伸PCR构建靶向肿瘤干细胞腺病毒载体及感染实验 被引量：1

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作者 张超 刘国炳 +2 位作者 田平阁 周春平 李学农 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1513-1517,共5页

目的应用降落和重叠延伸PCR法构建对肿瘤干细胞有特异靶向性的高效载体-复制缺陷型腺病毒载体,观察其对CD133+人大肠癌细胞株SW480的感染效率。方法利用重叠延伸PCR技术扩增5型腺病毒纤毛球端HI环两端的基因序列,定向插入真核表达质粒pE... 目的应用降落和重叠延伸PCR法构建对肿瘤干细胞有特异靶向性的高效载体-复制缺陷型腺病毒载体,观察其对CD133+人大肠癌细胞株SW480的感染效率。方法利用重叠延伸PCR技术扩增5型腺病毒纤毛球端HI环两端的基因序列,定向插入真核表达质粒pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1.KNOB△HI,同时在缺失HI环部位引入EcoRV限制性酶切位点。在此基础上,用降落PCR克隆纤毛基因全长编码区序列,构建出腺病毒穿梭质粒pNEB-F5。利用凝胶图像分析和基因测序验证所构建质粒的正确性。再与pAdEasy-1,pShuttle-GFP在E.coli BJ5183中同源重组,得腺病毒载体Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP。用Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP分别感染CD133+人大肠癌细胞株SW480,通过荧光显微镜观察感染效率。结果降落PCR和重叠延伸PCR都扩增出特异性条带,测序结果与预期相符。与Ad5-GFP相比,Ad5FHI-GFP对CD133+人大肠癌细胞株SW480有显著提高。结论利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,其对CD133+人大肠癌细胞株SW480实验显示Ad5FHI-GFP组感染效率明显强于Ad5-GFP组。 展开更多

关键词 降落PCR 重叠延伸PCR 肿瘤干细胞 复制缺陷型腺病毒 穿梭质粒

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重组腺病毒介导绿色荧光蛋白基因对小鼠眼组织的转染和表达 被引量：2

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作者 于慧 吴继红 +4 位作者 张圣海 刘新建 张巨峰 易苗英 黄倩 《眼科研究》 CSCD 北大核心 2007年第12期904-907,共4页

目的研究不同剂量Ad5-EGFP前房注射后,报告基因在小鼠眼部组织的表达情况及分布特点。方法24只BALB/c小鼠随机分组。实验组以不同浓度梯度前房注射Ad5-EGFP。对照组前房分别注射PBS和不给予任何注射。观察活体眼部组织EGFP表达情况及阳... 目的研究不同剂量Ad5-EGFP前房注射后,报告基因在小鼠眼部组织的表达情况及分布特点。方法24只BALB/c小鼠随机分组。实验组以不同浓度梯度前房注射Ad5-EGFP。对照组前房分别注射PBS和不给予任何注射。观察活体眼部组织EGFP表达情况及阳性细胞的类型。结果低浓度注射组在各个时间点眼表均未观察到EGFP荧光表达。高浓度注射组在注射病毒第1d即可以观察EGFP的表达,在第10d时眼表EGFP荧光亮度、范围增加最为明显。EGFP在角膜内皮细胞、虹膜色素上皮细胞及小梁网阳性表达。结论Ad5型腺病毒载体定向携带报告基因在眼前节表达,为眼前节疾病的基因治疗提供了实验依据。 展开更多

关键词 复制缺陷型腺病毒载体 基因治疗 角膜内皮细胞 报告基因

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重组TRAIL腺病毒抑制肺癌细胞生长和诱导凋亡的作用 被引量：4

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作者 杨芳 孙茂盛 +3 位作者 易山 谢天宏 施锐 李鸿钧 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2007年第4期362-367,共6页

目的:研究重组TRAIL腺病毒(Ad-TRAIL)对人非小细胞肺癌细胞株YTMLC、A549、H460抑制生长和诱导凋亡的作用,探讨Ad-TRAIL用于非小细胞肺癌基因治疗的可能性。方法:培养肿瘤细胞,分别加入Ad-TRAIL、sTRAIL,并设Ad、PBS作对照。倒置显微镜... 目的:研究重组TRAIL腺病毒(Ad-TRAIL)对人非小细胞肺癌细胞株YTMLC、A549、H460抑制生长和诱导凋亡的作用,探讨Ad-TRAIL用于非小细胞肺癌基因治疗的可能性。方法:培养肿瘤细胞,分别加入Ad-TRAIL、sTRAIL,并设Ad、PBS作对照。倒置显微镜、吖啶橙染色后荧光显微镜、电镜进行细胞形态结构观察;肿瘤细胞生长抑制实验检测细胞存活率,绘制肿瘤细胞生长抑制曲线;DNA凝胶电泳、PI染色、TUNEL染色和流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡;集落形成实验观察肿瘤细胞集落形成能力。结果:Ad-TRAIL组、sTRAIL组与空腺病毒Ad组、PBS阴性对照组相比均明显抑制非小细胞肺癌细胞株YTMLC、A549、H460的增殖。DNA凝胶电泳出现DNA梯形条带;形态学观察发现Ad-TRAIL组的肿瘤细胞具有细胞凋亡的形态;Ad-TRAIL作用的YTMLC细胞有较高比例(8.55%)的亚二倍体凋亡峰,而Ad和PBS组分别为1.08%和0.47%;Ad-TRAIL组被TUNEL标记的细胞比例为10.6%,高于Ad组的1.13%。Ad-TRAIL组的集落数为28±7,而PBS和Ad对照组分别为257±18,193±12。结论:Ad-TRAIL对非小细胞肺癌细胞具有抑制生长和诱导凋亡的作用,Ad-TRAIL有可能用于非小细胞肺癌的基因治疗。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 重组复制缺陷型腺病毒 凋亡 非小细胞肺癌

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逆转录病毒载体介导的转基因鸡研究进展 被引量：3

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作者 王令 张涛 尹亚军 《中国家禽》 北大核心 2015年第14期44-48,共5页

转基因鸡作为重要的经济动物和理想的生物反应器,具有广阔的应用前景。鸡基因组测序的完成加快了转基因鸡的研究和发展。病毒载体法是转基因鸡制备的主导方法之一,具有效率高和遗传稳定性良好的优势。本文对逆转录病毒载体特征、复制缺... 转基因鸡作为重要的经济动物和理想的生物反应器,具有广阔的应用前景。鸡基因组测序的完成加快了转基因鸡的研究和发展。病毒载体法是转基因鸡制备的主导方法之一,具有效率高和遗传稳定性良好的优势。本文对逆转录病毒载体特征、复制缺陷型病毒载体和复制整合双缺陷型病毒载体的优缺点及其介导的转基因鸡研究进行综述,展望人工核酸酶技术结合复制整合双缺陷型逆转录病毒载体在转基因鸡研究领域的应用前景。 展开更多

关键词 转基因鸡 逆转录病毒载体 复制整合双缺陷型病毒载体 人工核酸酶技术

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