A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立 被引量：3

1

作者 任建乐 林铱婷 +9 位作者 姬康 谭姗姗 陈新新 晋怡 王颖 牛胜 梁立滨 李俊平 赵宇军 田文霞 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期678-688,共11页

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,... [目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。 展开更多

关键词 A型塞内卡病毒(sva) VP2蛋白 原核表达 多克隆抗体 间接ELISA

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天然产物库中体外颉颃A型塞内卡病毒化合物的筛选及作用途径研究 被引量：1

2

作者 王西彤 沙洲 +9 位作者 迟田英 崔进 郑辉 陈峰 曹振山 张慧 戈胜强 魏荣 尼博 黄保续 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期3155-3165,共11页

【目的】寻找对A型塞内卡病毒(SVA)具有抑制活性的天然产物,并深入研究其颉颃途径。【方法】将天然产物浓度统一稀释至10μmol/L,与荧光素酶重组塞内卡病毒(rSVA-NLuc)相结合,在天然产物小分子库中筛选出具有荧光素酶抑制活性的化合物,... 【目的】寻找对A型塞内卡病毒(SVA)具有抑制活性的天然产物,并深入研究其颉颃途径。【方法】将天然产物浓度统一稀释至10μmol/L,与荧光素酶重组塞内卡病毒(rSVA-NLuc)相结合,在天然产物小分子库中筛选出具有荧光素酶抑制活性的化合物,采用实时荧光定量RT-PCR方法验证其活性,通过乳酸脱氢酶(LDH)法进行细胞毒性试验确定最大无毒浓度,结合病毒滴度测定、实时荧光定量RT-PCR、Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)等技术,在病毒感染周期的不同阶段,对其颉颃SVA的效果及途径进行研究。【结果】通过初筛,从136种天然产物中筛选出莫能霉素钠盐、孕酮、叶下珠次素、4-羟基德里辛和2-甲基雌酮5种能体外颉颃SVA的化合物。进一步通过实时荧光定量RT-PCR复核验证和细胞毒性检测,筛选出一种能体外颉颃SVA的天然产物——孕酮。与空白对照组相比,其在体外可导致SVA mRNA表达水平极显著下降(P<0.01),最大无毒浓度达50μmol/L。进一步研究表明,孕酮能在感染后8、12、24、36 h持续抑制SVA增殖,与对照组相比,在感染后24和36 h病毒滴度显著下降(P<0.05)。与对照组相比,不同浓度(10、20和50μmol/L)孕酮在吸附阶段导致SVA吸附水平极显著下降(P<0.01);在复制阶段使SVA VP3水平显著下降且使病毒滴度极显著下降(P<0.01);在释放阶段使释放胞外的病毒比例极显著下降(P<0.01);但对其他途径无显著影响。说明孕酮能在体外抑制SVA吸附、复制和释放,但对其入胞、组装途径无明显作用。【结论】本研究从天然产物小分子库中筛选出一种具有低细胞毒性且对SVA具有较强颉颃作用的天然产物——孕酮。该产物对SVA吸附、复制和释放阶段具有抑制作用,从而颉颃SVA的感染。本研究为促进抗SVA药物的开发和研究SVA的感染偏好性提供了科学参考。 展开更多

关键词 孕酮 A型塞内卡病毒(sva) 天然产物 颉颃途径

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甲磺酸瑞波西汀体外颉颃塞内卡病毒的研究 被引量：1

3

作者 巩有权 周晓翠 +7 位作者 郑辉 陈峰 曹振山 沙洲 张慧 崔进 武瑞 尼博 《中国畜牧兽医》 CSCD 北大核心 2024年第1期268-277,共10页

【目的】从含有127种化合物的FDA批准上市药物库中筛选具有颉颃A型塞内卡病毒(SenecavirusA,SV A)活性的化合物并研究其作用途径。【方法】利用荧光素酶重组塞内卡病毒(rSVA-NLuc)结合荧光素酶高通量筛选技术,建立抗SVA化合物体外筛选... 【目的】从含有127种化合物的FDA批准上市药物库中筛选具有颉颃A型塞内卡病毒(SenecavirusA,SV A)活性的化合物并研究其作用途径。【方法】利用荧光素酶重组塞内卡病毒(rSVA-NLuc)结合荧光素酶高通量筛选技术,建立抗SVA化合物体外筛选平台。从FDA批准上市药物库中筛选浓度为10μmol/L时具有抑制荧光素酶活性效应的化合物,并进一步利用实时荧光定量RT-PCR验证其抑制活性,通过反映乳酸脱氢酶(LDH)释放水平的细胞毒性试验进而确定其最大无毒浓度。针对病毒感染周期的吸附、入胞、复制和组装释放等4个主要过程,采用不同的细胞处理方法和实时荧光定量RT-PCR、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)、蛋白免疫印迹(Western blotting)和病毒滴度测定(TCID_(50))等技术进行化合物分子额顽机制研究。【结果】从包含127种分子的FDA获批上市药物库中筛选出8种候选抗SVA活性分子,通过实时荧光定量RT-PCR及细胞毒性检测,鉴定出1种安全、有效的化合物——甲磺酸瑞波西汀。在病毒感染细胞36h内甲磺酸瑞波西汀可使SVA VP3蛋白表达量和病毒滴度均极显著下降(P<0.01)。甲磺酸瑞波西汀处理金黄仓鼠肾细胞(BSR-T7/5)可减少SVA的吸附和入胞;实时荧光定量RT-PCR也显示甲磺酸瑞波西汀能抑制SVA的组装阶段,但它对SVA的复制和释放阶段没有影响。【结论】本试验从FDA批准上市药物库中筛选出了1种细胞毒性较低且颉SVA效果优异的化合物一—甲磺酸瑞波西汀,该化合物通过抑制SVA的吸附、入胞和组装阶段来对抗SVA感染。本研究为抗SVA药物的进一步研发提供重要参考。 展开更多

关键词 A型塞内卡病毒(sva) FDA药物库 高通量筛选

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塞内卡病毒A完整病毒和空衣壳的分离及抗体应答分析

4

作者 李梅 穆素雨 +4 位作者 董虎 李硕 潘颂佳 郭慧琛 孙世琪 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4562-4570,共9页

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)在复制过程中可形成完整病毒和空衣壳,它们的分离条件和抗体应答差异目前还是未知的。本研究利用盐酸胍形成SVA空衣壳,通过优化不同的密度梯度、介质、转速、时间条件进行超速离心,获得分离SVA完整病毒... 塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)在复制过程中可形成完整病毒和空衣壳,它们的分离条件和抗体应答差异目前还是未知的。本研究利用盐酸胍形成SVA空衣壳,通过优化不同的密度梯度、介质、转速、时间条件进行超速离心,获得分离SVA完整病毒和空衣壳的最佳条件,并按SVA完整病毒12.5μg·只-1,空衣壳12.5μg·只^(-1)肌肉注射免疫BALB/c小鼠,免疫后1~7周检测特异性抗体和中和抗体。结果显示,SVA的MOI=1时感染细胞2 h加入100 mmol·L^(-1)盐酸胍可以使SVA完整病毒全部形成空衣壳;在10%~50%氯化铯,36000 r·min^(-1),离心2.5 h是区分SVA完整病毒和空衣壳的最佳条件;而且SVA完整病毒与空衣壳诱导小鼠的特异性抗体和中和抗体水平无显著差异(P=ns)。本研究为塞内卡病毒A完整病毒和空衣壳的分离纯化、重组SVA病毒样颗粒疫苗的开发提供参考。 展开更多

关键词 塞内卡病毒a 完整病毒 空衣壳 分离条件优化 免疫原性

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猪塞内卡病毒A研究进展

5

作者 何宇乾 李静 +3 位作者 刘枢清 朱丽杰 刘拂晓 王奇 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4616-4625,共10页

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是近年来引起感染猪发生水疱样病变的一种小RNA病毒,属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、塞内卡病毒属(Senecavirus)。至今,围绕SVA的遗传进化、基因组结构与功能、致病机制及流行病学等领域的研究已取得... 塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是近年来引起感染猪发生水疱样病变的一种小RNA病毒,属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、塞内卡病毒属(Senecavirus)。至今,围绕SVA的遗传进化、基因组结构与功能、致病机制及流行病学等领域的研究已取得一定成果,并建立了多种实验室诊断方法。在中国,SVA感染范围较为广泛,大多以表现为无明显症状的隐性感染形式为主,并且与其他病原体混合感染的情况较为常见。目前,中国在SVA检测领域已实现了显著的技术提升,应用了逆转录恒温热隔绝式PCR(RT-iiPCR)、重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)、实时荧光逆转录重组酶辅助扩增技术(rRT-RAA)、逆转录微滴式数字PCR(RT-ddPCR)和实时逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)等新型检测手段。然而,SVA是一种易变异和重组的新发RNA病毒,目前尚无针对其的有效商品化疫苗或药物,有效防控SVA仍是一项艰巨的任务。现有SVA疫苗的研究仍以灭活疫苗为主,同时包括亚单位疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、病毒颗粒疫苗和重组活载体疫苗等。针对SVA引起感染的抗病毒药物治疗方面,目前可采用利巴韦林、甲磺酸瑞波西汀等进行治疗。此外,中草药提取物或其他天然产物也被发现为潜在的抗病毒制剂。笔者旨在对SVA的流行分布、病原学、流行病学、鉴别诊断及防控的最新研究进展进行归纳和总结,以期为SVA的预防和控制策略提供新的视角和思路。 展开更多

关键词 塞内卡病毒a(sva) 病原学 流行病学 鉴别诊断 疫病防控

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塞内卡病毒的基因组结构与功能及其关键毒力因子

6

作者 李倩 刘枢清 +1 位作者 赵艳薇 王迁迁 《中国动物检疫》 CAS 2024年第11期106-110,共5页

塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是一种影响猪的重要病原体,其基因组变异对病毒进化和致病性密切相关。本文系统梳理了SVA的基因组结构、编码蛋白功能、基因变异类型,综述了影响SVA毒力的关键基因区域,包括结构蛋白编码基因、非结构蛋白... 塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是一种影响猪的重要病原体,其基因组变异对病毒进化和致病性密切相关。本文系统梳理了SVA的基因组结构、编码蛋白功能、基因变异类型,综述了影响SVA毒力的关键基因区域,包括结构蛋白编码基因、非结构蛋白编码基因以及非编码区,通过全面回顾SVA基因组研究进展,以期为深入了解SVA的分子流行病学特征提供基础,并为未来的疫病预防和控制提供依据。 展开更多

关键词 塞内卡病毒 基因组结构 蛋白功能 毒力基因

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猪繁殖与呼吸综合征对塞内卡病毒灭活苗免疫效果的影响

7

作者 汤笑语 张丽燕 +2 位作者 邱文英 陈奕帆 马明昊 《中国兽药杂志》 2024年第2期28-33,共6页

为探究猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)对塞内卡病毒(SVA)灭活疫苗免疫效果的影响,对PRRS阳性猪和PRRS阴性猪分别免疫相同批次、相同剂量的SVA灭活苗,检测首次免疫后7 d、14 d、21 d、28 d血清中和抗体效价,并在免疫后28 d对所有试验猪进行攻... 为探究猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)对塞内卡病毒(SVA)灭活疫苗免疫效果的影响,对PRRS阳性猪和PRRS阴性猪分别免疫相同批次、相同剂量的SVA灭活苗,检测首次免疫后7 d、14 d、21 d、28 d血清中和抗体效价,并在免疫后28 d对所有试验猪进行攻毒保护试验。结果显示,所有PRRS阳性猪的SVA血清中和抗体效价均小于1∶4,而PRRS阴性猪SVA血清中和抗体效价在二免后上升到较高水平。攻毒保护结果与中和抗体效价结果呈正相关,PRRS阳性组0/5保护,而PRRS阴性组试验猪达到5/5保护。这一研究表明PRRS会使SVA灭活疫苗免疫效果下降,为SVA及PRRS疫苗的研发及猪场疾病的防控提供了参考。 展开更多

关键词 塞内卡病毒 猪繁殖与呼吸综合征 免疫 中和抗体

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塞内卡病毒病研究进展 被引量：19

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作者 张永宁 吴绍强 林祥梅 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期1381-1388,共8页

塞内卡病毒病是由微RNA病毒科的A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)引起的动物传染病,主要感染猪,不同年龄阶段的猪均易感,但不同毒株的致病力明显不同,引起的临床症状也不尽相同。早期的分离株多导致亚临床感染,近年来的分离株通常引起... 塞内卡病毒病是由微RNA病毒科的A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)引起的动物传染病,主要感染猪,不同年龄阶段的猪均易感,但不同毒株的致病力明显不同,引起的临床症状也不尽相同。早期的分离株多导致亚临床感染,近年来的分离株通常引起口蹄疫样的临床症状,病猪口鼻部、蹄部出现水疱、溃疡,新生仔猪死亡率显著增加。目前,该病主要流行于加拿大、巴西和美国等国家;2015年以来,我国广东和湖北两省某些猪场相继发生SVA疫情。为提高人们对该病的认识和重视,及早做好相关防控预案和检测技术储备,笔者从病原学、流行病学、临床症状与病理变化、检疫与诊断、防控措施等方面对取得的最新研究进展进行概述。 展开更多

关键词 塞内卡病毒病 A型塞内卡病毒 水疱 检疫 防控

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浙江省猪群塞内卡病毒感染流行病学调查 被引量：4

9

作者 张红丽 王雅婷 +4 位作者 黄靖 张璐 董建斐 赵灵燕 徐辉 《中国动物检疫》 CAS 2022年第10期1-6,共6页

为了解浙江省猪群塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)流行情况,2017—2020年开展了SVA血清学和病原学检测。结果显示:2018—2020年浙江省猪群SVA抗体个体阳性率分别为21.86%、9.83%、12.79%,群体阳性率分别为83.00%、56.06%、70.89%,整体呈... 为了解浙江省猪群塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)流行情况,2017—2020年开展了SVA血清学和病原学检测。结果显示:2018—2020年浙江省猪群SVA抗体个体阳性率分别为21.86%、9.83%、12.79%,群体阳性率分别为83.00%、56.06%、70.89%,整体呈波动状变化趋势;屠宰场平均个体阳性率为18.35%,高于养殖场(14.86%),差异明显(P<0.01);浙南(19.13%)、浙北(17.01%)的平均个体阳性率显著高于其他区域(10.09%~12.25%)。2017—2020年SVA核酸个体阳性率、群体阳性率总体呈下降趋势,分别由2017年的18.08%、33.80%下降至2020年的1.66%、3.81%;屠宰场屠宰猪群的SVA核酸个体阳性率(8.72%)高于养殖场和无害化处理场病死猪群(3.97%),差异显著(P<0.01);2018—2020年仅在浙南、浙北区域检出SVA核酸阳性。结果表明:浙江省猪群SVA感染有所控制,但流行范围依然较广,部分区域猪群SVA隐性感染较严重,需重视并持续加强猪群SVA感染监测。 展开更多

关键词 塞内卡病毒 流行病学调查 血清学 病原学 隐性感染

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猪塞内卡病毒研究进展 被引量：6

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作者 黄健强 吴静波 《动物医学进展》 北大核心 2019年第3期82-88,共7页

塞内卡病毒属小RNA病毒科塞内卡病毒属,可感染各个年龄段的猪群引发猪自发性水疱病,临床表现与口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎、猪传染性水疱病相似,但感染发病率较低,临床症状较轻。2015年以来,塞内卡病毒相关猪自发性水疱病的流行区域... 塞内卡病毒属小RNA病毒科塞内卡病毒属,可感染各个年龄段的猪群引发猪自发性水疱病,临床表现与口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎、猪传染性水疱病相似,但感染发病率较低,临床症状较轻。2015年以来,塞内卡病毒相关猪自发性水疱病的流行区域迅速扩大,包括巴西、美国、加拿大、中国、泰国和哥伦比亚都相继暴发疫情。另外还出现临床症状加重、新生猪病死率升高等新变化,这些变化给生猪养殖业带来了不小的恐慌,也引起了研究人员的高度重视。为充分了解和掌握塞内卡病毒的最新信息,认清研究的重点和方向,论文对病毒生物学与流行病学特征、临床特性、实验室诊断技术等方面进行了综述。 展开更多

关键词 塞内卡病毒 猪自发性水疱病 流行病学 临床表现 诊断

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A型塞内卡病毒困扰美国养猪业 被引量：2

11

作者 翁善钢 《猪业科学》 2016年第7期26-26,共1页

A型塞内卡病毒（Senecavirus A，SVA）感染病例的增加，让美国养猪业深感困惑。从2015年8月到11月，美国有9个州报告了100多个病例。事实上，自1988年以来，美国一直有SVA散发病例。但是，去年的报告病例数量却是爆发式地显著上升。

关键词 养猪业 美国 病毒 A型 感染病例 sva

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塞内卡病毒A的RT-PCR检测方法的建立和应用 被引量：13

12

作者 范慧 李亮 +3 位作者 姜平 王先炜 李玉峰 白娟 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1312-1318,共7页

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是一种无囊膜的单股正链RNA病毒,可引起成年母猪水疱性病变,并导致新生仔猪死亡。为建立SVA的快速检测方法,本研究对NCBI发表的40株SVA的基因序列进行同源比较,选择保守区域设计了3对引物P1、P2和P3,从... 塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是一种无囊膜的单股正链RNA病毒,可引起成年母猪水疱性病变,并导致新生仔猪死亡。为建立SVA的快速检测方法,本研究对NCBI发表的40株SVA的基因序列进行同源比较,选择保守区域设计了3对引物P1、P2和P3,从中筛选出最佳扩增引物,通过对引物浓度、退火温度、延长时间、循环次数进行优化,成功建立了SVA的RT-PCR检测方法。用该方法检测SVA、脑心肌炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应,具有良好的特异性。敏感性试验结果显示,病毒检测限可达1TCID50,比国外文献报道的检测方法灵敏性更高。用该方法检测山东省的100份猪组织样品,阳性率为2%。本研究所建立的方法特异性强、敏感性高、可靠性好,为SVA的快速检测及流行病学调查提供了有效的技术手段。 展开更多

关键词 塞内卡病毒a RT-PCR 检测

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塞内卡病毒A结构蛋白VP1诱导PK-15细胞凋亡 被引量：10

13

作者 王咏 毛箬青 +2 位作者 张克山 郑海学 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期811-820,共10页

塞内卡病毒A(SVA)作为一种新发病病原,致病机制仍不清楚。通过显微镜观察发现,SVA感染PK-15细胞后能使细胞产生明显的细胞病变(CPE),同时伴随着严重的细胞凋亡。为了深入研究SVA诱导凋亡的情况,在验证SVA各蛋白真核质粒正常表达后,通过A... 塞内卡病毒A(SVA)作为一种新发病病原,致病机制仍不清楚。通过显微镜观察发现,SVA感染PK-15细胞后能使细胞产生明显的细胞病变(CPE),同时伴随着严重的细胞凋亡。为了深入研究SVA诱导凋亡的情况,在验证SVA各蛋白真核质粒正常表达后,通过Annexin V-FITC/PI双染流式方法检测SVA各蛋白诱导凋亡的情况,Annexin V-FITC/PI和Hoechst染色后显微镜观察磷脂酰丝氨酸和核凝聚程度,通过Western blotting和RT-PCR技术分析SVA-VP1对凋亡通路中主要调控分子Caspase3、Caspase8和Bax蛋白质和mRNA水平的影响,发现SVA-VP1能够显著诱导细胞发生早期和晚期凋亡,并且能够促进凋亡蛋白Caspase3、Caspase8及Bax蛋白和mRNA水平的上调。本研究结果为深入研究SVA调控宿主细胞凋亡的分子机制和致病机制奠定了理论基础。 展开更多

关键词 塞内卡病毒a PK-15细胞 细胞凋亡 流式细胞术

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表达绿色荧光蛋白重组猪塞内卡病毒的构建及初步应用 被引量：5

14

作者 张晓战 杨磊 +8 位作者 邓同炜 赵攀登 彭志锋 陈露露 郭懿文 夏艳勋 乔宏兴 边传周 王增 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期2978-2985,共8页

塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在... 塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在实验室前期对SVA研究的基础上建立稳定表达绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒,为体外高通量筛选具有抗SVA活性药物提供一种简单快速有效的工具。本研究在pEGFP-C1载体EGFP基因末端引入猪捷申病毒1型的2A基因,构建EGFP-P2A融合基因过度质粒,随后分别设计带有同源臂的克隆引物,通过同源重组技术将EGFP-P2A基因插入SVA毒株CH/HeN-2018基因组2A和2B基因间,并经测序鉴定,成功构建重组载体pSVA-EGFP。将pSVA-EGFP转染PK-15细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的重组SVA荧光毒rCH/HeN-2018-EGFP。通过绿色荧光观察、RT-PCR和生长曲线测定,评估了重组毒株rCH/HeN-2018-EGFP和亲本毒株生长特性。并进一步通过药物细胞毒性试验和病毒感染试验对rCH/HeN-2018-EGFP作为潜在抗SVA药物筛选工具进行评价。结果表明,rCH/HeN-2018-EGFP与亲本毒株wtCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018在PK-15细胞中具有相似的生长特性,且遗传稳定,在P10代能够稳定表达绿色荧光,插入的EGFP-P2A基因没有出现突变现象。抗SVA病毒感染试验结果表明,用终浓度20μmol·L^(-1)的姜黄素和110μmol·L^(-1)黄芩苷预处理PK-15细胞2 h,通过观察荧光细胞的数量直观判断两种药物均能够抑制rCH/HeN-2018-EGFP在细胞中的复制,其中黄芩苷抑制效果极显著。随后在亲本毒株wtCH/HeN-2018感染试验进一步证实了黄芩苷对SVA病毒复制抑制的效果。本研究所构建的携带EGFP基因的重组SVA毒株能够高效稳定地表达绿色荧光蛋白,可以作为一种工具报告病毒应用于抗SVA药物和蛋白的筛选过程。 展开更多

关键词 塞内卡病毒 反向遗传操作系统 报告病毒 绿色荧光蛋白 抗病毒药物筛选

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PK-15细胞的TPL2基因敲除有利于口蹄疫病毒和塞内卡病毒复制 被引量：3

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作者 闫鸣昊 郝军红 +6 位作者 张大俊 申超超 徐国伟 侯景 张克山 郑海学 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期1060-1073,共14页

旨在构建TPL2(MAP3K8/COT)基因敲除PK-15细胞系PK-15-TPL2^-/-,评估该基因敲除前后对口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVA)复制的影响及产生影响的原因,为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供良好的生物材料,也为疫苗生产过程中进一... 旨在构建TPL2(MAP3K8/COT)基因敲除PK-15细胞系PK-15-TPL2^-/-,评估该基因敲除前后对口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVA)复制的影响及产生影响的原因,为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供良好的生物材料,也为疫苗生产过程中进一步提升FMDV和SVA产量指明方向。筛选2条针对TPL2基因的单向导RNA(sg RNA),合成sg RNA并将其插入到含有GFP标签的慢病毒表达载体,构建sg RNA/Cas9慢病毒表达质粒,包装慢病毒并感染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞。通过测序确认细胞系中TPL2的DNA序列,通过蛋白质印迹(Western blot)方法检测细胞系中TPL2表达情况。使用FMDV和SVA感染构建好的细胞系,利用IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID50评估FMDV和SVA在PK-15-TPL2^-/-细胞中的复制水平,在此基础上通过测定干扰素(IFN)和IFN刺激基因(ISG)的mRNA表达水平,研究了FMDV或SVA感染的PK-15-TPL2^-/-细胞中干扰素途径的激活状态。TPL2基因敲除PK-15细胞系中TPL2基因发生了碱基插入突变和碱基缺失突变,构建的细胞系中均未检测到TPL2蛋白质表达。测定并比较了FMDV和SVA感染的PK-15和PK-15-TPL2^-/-细胞中病毒含量,表明TPL2基因敲除显著促进了FMDV和SVA的复制。同时,RT-qPCR进一步表明与FMDV和SVA感染期间的PK-15细胞相比,PK-15-TPL2^-/-细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56的mRNA表达明显降低。综上所述,本研究成功构建了TPL2基因敲除的PK-15细胞系,与对照细胞相比,TPL2基因的敲除更利于FMDV和SVA的复制,这可能与IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56表达的抑制有关。本研究提示CRISPR/Cas9基因编辑技术可以作为在动物和疫苗开发过程中编辑细胞系以提高病毒产量的有效工具,本结果为进一步提升FMDV和SVA产量指明了方向,也为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供了良好的生物材料。 展开更多

关键词 TPL2基因 PK-15细胞 基因敲除 口蹄疫病毒 塞内卡病毒

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猪塞内卡病毒A、猪水疱病毒和口蹄疫病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：3

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作者 苏博 吴志敏 +8 位作者 张馨月 赵涵 鲍迪 张添琪 张嘉钰 梁湘雨 孟凡茹 王开 胡桂学 《动物医学进展》 北大核心 2023年第9期12-18,共7页

为建立一种鉴别猪塞内卡病毒A(SVA)、猪水疱病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对3种病毒的基因保守区域设计引物和探针,建立了可同时检测上述3种病毒的Taq Man三重荧光定量PCR方法。该方法仅能特异性扩增SVA和FMDV病毒基因以及SVD... 为建立一种鉴别猪塞内卡病毒A(SVA)、猪水疱病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对3种病毒的基因保守区域设计引物和探针,建立了可同时检测上述3种病毒的Taq Man三重荧光定量PCR方法。该方法仅能特异性扩增SVA和FMDV病毒基因以及SVDV阳性质粒,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、经典猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒的阳性样品cDNA或DNA无交叉反应,对3种病毒核酸的最低检出限均为10 copies/μL,组内和组间变异系数均小于4%。应用该方法对2019-2022年采集的吉林省部分地区267份病料和本实验室留存的30份猪血清样品进行检测,未检出SVA、FMDV以及SVDV。建立的三重荧光PCR方法有利于对3种病毒进行有效的流行病学调查,可给快速准确鉴别致猪水疱症状病毒性疾病提供诊断方法。 展开更多

关键词 塞内卡病毒a 猪水疱病毒 口蹄疫病毒 三重荧光定量PCR

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1株塞内卡病毒A型的基因组序列与演化分析 被引量：2

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作者 李宁 郭慧芳 +5 位作者 王白玉 乔麒龙 黄庆 李永涛 王增 赵军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期553-559,共7页

旨在分析塞内卡病毒A型(Senecavirus A,SVA)CH-HNCY-2019株的基因组特性和演化,参考SVA毒株SVV-001(GenBank No.NC011349)全基因组序列设计8对引物,通过RT-PCR扩增和测序获得SVA CH-HNCY-2019株全基因序列并进行序列分析。结果显示,SVA... 旨在分析塞内卡病毒A型(Senecavirus A,SVA)CH-HNCY-2019株的基因组特性和演化,参考SVA毒株SVV-001(GenBank No.NC011349)全基因组序列设计8对引物,通过RT-PCR扩增和测序获得SVA CH-HNCY-2019株全基因序列并进行序列分析。结果显示,SVA分离株CH-HNCY-2019基因组全长为7294个核苷酸,与中国分离株核苷酸相似性为95.9%~99%,与美国经典株SVV-001核苷酸相似性最低。CH-HNCY-2019与大多数中国2017—2018年分离毒株亲缘关系较近,处于同一分支,而与中国2015—2016年分离株亲缘关系较远。与包括2019年中国广东4个SVA分离株在内的其他国内外分离株相比,CH-HNCY-2019的VP1蛋白的722位氨基酸由L突变为Q;VP3蛋白的499位氨基酸由A突变为V,528位氨基酸由P突变为S,582位氨基酸由E突变为K。本研究成功获得1株SVA CH-HNCY-2019全基因组序列,研究结果提示,SVA中国流行株具有多样性,而且在不断地演变,应加强SVA的分子流行病学调查、生物安全措施和疫苗研发以防止SVA在我国猪群中的广泛传播。 展开更多

关键词 塞内卡病毒a RT-PCR扩增 sva CH-HNCY-2019 基因组序列分析 遗传进化

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抗A型塞内卡病毒天然产物筛选及颉颃作用机制研究 被引量：3

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作者 蒙英雯 李月华 +6 位作者 沙洲 李晨钰 巩有权 董雅琴 魏荣 邹丰才 尼博 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期734-744,共11页

【目的】从天然产物库中筛选具有颉颃A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)活性的天然产物并研究其颉颃作用机制。【方法】利用荧光素酶重组塞内卡病毒(rSVA-NLuc)与BHK-21细胞,结合荧光素酶高通量筛选技术,建立抗SVA药物体外筛选平台。从... 【目的】从天然产物库中筛选具有颉颃A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)活性的天然产物并研究其颉颃作用机制。【方法】利用荧光素酶重组塞内卡病毒(rSVA-NLuc)与BHK-21细胞,结合荧光素酶高通量筛选技术,建立抗SVA药物体外筛选平台。从天然产物库中筛选浓度为10μmol/L时具有抑制荧光素酶活性效应的天然产物,并进一步利用实时荧光定量RT-PCR验证其抑制活性,通过细胞毒性试验确定其最大无毒浓度。选择病毒感染周期的吸附、入胞、复制、组装释放4个主要过程,利用实时荧光定量RT-PCR、50%组织细胞感染量(TCID 50)测定等进行天然产物分子颉颃机制研究。【结果】从包含560种天然产物的分子库中筛选出16种候选抗SVA活性分子,通过实时荧光定量RT-PCR及细胞毒性检测,鉴定出4种安全、有效的天然产物,分别为20S-原人参三醇((20S)-protopanaxatriol)、蕈青霉素(paxilline)、方胆碱(fangchinoline)、竹红菌乙素(hypocrellin B)。作用机制研究显示,20S-原人参三醇能抑制SVA感染过程中的吸附、复制阶段;蕈青霉素在SVA的吸附、入胞、复制、组装释放阶段即整个病毒感染周期均发挥抑制作用;方胆碱能抑制SVA的入胞、复制;竹红菌乙素能抑制SVA的吸附、入胞、复制及组装释放阶段。【结论】本试验从天然产物库中筛选出了4种具有抗SVA活性的天然产物,这些化合物抗病毒效果良好,且作用机制各有不同。本研究为抗SVA药物的进一步研发提供重要参考。 展开更多

关键词 A型塞内卡病毒(sva) 天然产物 高通量筛选 颉颃机制

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一株塞内卡病毒A全基因组序列测定与致病性分析 被引量：3

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作者 赖隆永 刘小龙 +5 位作者 谭礼宁 叶盛聪 邱灵姗 陈盛勇 刘楚楚 徐磊 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期820-826,共7页

本研究旨在明确塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的同源性关系,并了解SVA-FJLY株的致病性。以分离自福建省某养殖场中的一株SVA-FJLY株为研究对象,参照其原型毒株SVV-001(GenBank No.DQ641257.1)全基因... 本研究旨在明确塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的同源性关系,并了解SVA-FJLY株的致病性。以分离自福建省某养殖场中的一株SVA-FJLY株为研究对象,参照其原型毒株SVV-001(GenBank No.DQ641257.1)全基因组序列设计5对引物,通过RT-PCR扩增、测序、拼接,获得SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析;并通过滴鼻攻毒3~4周龄仔猪。结果表明,SVA-FJLY株基因组全长7275 bp(不包括PolyA),SVA-FJLY株基因组存在一个多聚蛋白、VP1蛋白和VP2蛋白。SVA-FJLY株与参考毒株之间的基因组一级结构有较高的相似性,与HeB01-2017株(MF967574.1)相似性最高,达98.5%;而与SVA原型毒株SVV-001株(DQ641257.1)的相似性较低,为93.9%。SVA-FJLY株与国内几个毒株属于同一个分支,与国内的HeB01-2017株亲缘关系最近,同时与国外Colombia-2016株(KX857728.1)的亲缘关系最近。通过动物试验发现试验组猪攻毒10 d后,试验组2/3发病,对照组3/3正常,未出现仔猪死亡。通过全基因组序列测定获得了SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析,明确SVA-FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的相似性关系,了解了SVA-FJLY株的致病性,为SVA的反向遗传学和疫苗的研制提供参考依据,同时也丰富了SVA的基因组信息数据库。 展开更多

关键词 塞内卡病毒a RT-PCR扩增 序列分析 遗传进化树 同源性 sva-FJLY株 致病性

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塞内卡病毒CH/ZZ/2016株全基因组测序与分析 被引量：2

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作者 韩宇 王秀明 +5 位作者 张斌 乌吉斯古楞 巨敏莹 刘建奇 宋庆庆 关平原 《中国动物检疫》 CAS 2020年第12期108-113,共6页

为了解塞内卡病毒分离株SVA/CH/ZZ/2016全基因组序列,设计4对相互重叠的特异性引物扩增基因片段,将扩增产物分别克隆至pCE2TA/Blunt-Zero载体并进行测序,拼接校正后获得SVA/CH/ZZ/2016株全基因组。结果显示,该毒株基因组全长7292 bp,包... 为了解塞内卡病毒分离株SVA/CH/ZZ/2016全基因组序列,设计4对相互重叠的特异性引物扩增基因片段,将扩增产物分别克隆至pCE2TA/Blunt-Zero载体并进行测序,拼接校正后获得SVA/CH/ZZ/2016株全基因组。结果显示,该毒株基因组全长7292 bp,包括5'UTR(670 bp)、ORF(6546 bp)以及3'UTR(76 bp)。选择国内外其他9株参考毒株序列,对编码区12个基因的核苷酸及编码氨基酸进行比对。结果显示,核苷酸同源性最高的是3B基因,最低的是VP1基因,其余基因的核苷酸序列同源性均在85.2%~100%之间。VP1基因遗传进化分析显示,SVA/CH/ZZ/2016株与美国分离株USAIL_Purdue_43_2016和USAIN_Purdue_3698_2016株亲缘关系最近,属同一进化分支,与原始毒株SVV-001株亲缘关系最远。对SVA/CH/ZZ/2016株和原始毒株SVV-001 VP1蛋白的氨基酸序列进行比对,发现共有10处氨基酸差异。本研究通过对SVA/CH/ZZ/2016株全基因组测序及分析,为进一步开展SVA分子生物学研究及流行病学调查提供了基础数据。 展开更多

关键词 塞内卡病毒 全基因组 序列分析

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