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石油热袍菌来源的塔格糖4-差向异构酶在大肠杆菌中的重组表达及全细胞固定化研究
1
作者 郭雪红 刘展志 +1 位作者 许滢 吴敬 《食品与生物技术学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期106-114,共9页
D-塔格糖是一种具有多种生理功能的稀少糖,但其现有生物制备方法存在底物成本高、供应不稳定等缺陷。来源于石油热袍菌(Thermotoga petrophila)的塔格糖酮酸3-差向异构酶(tagaturonate 3-epimerase)经过分子改造后,能够以D-果糖为底物... D-塔格糖是一种具有多种生理功能的稀少糖,但其现有生物制备方法存在底物成本高、供应不稳定等缺陷。来源于石油热袍菌(Thermotoga petrophila)的塔格糖酮酸3-差向异构酶(tagaturonate 3-epimerase)经过分子改造后,能够以D-果糖为底物经差向异构反应合成D-塔格糖,该突变体被命名为塔格糖4-差向异构酶(tagatose 4-epimerase,T4E)。作者通过在T4E的N端添加T7 tag,使其在大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)BL21 (DE3)中成功表达并测定了T4E的酶学性质,优化了T4E催化D-果糖合成D-塔格糖的生物转化条件,同时对异源表达T4E的E. coli BL21 (DE3)重组细胞进行硅藻土-海藻酸钠固定化研究。结果表明,在最适条件下,以300 g/L的D-果糖为底物,反应4 h后其平衡转化率可达25%。与游离细胞中的T4E相比,经全细胞固定化后的T4E热稳定性显著提高,可连续反应7个批次,具有较高的工业应用价值。 展开更多
关键词 D-塔格糖 塔格糖4-差向异构酶 大肠杆菌 全细胞固定化
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D-塔格糖3-差向异构酶的理性设计与机制解析
2
作者 郭丁钰 魏婉清 +4 位作者 宋伟 吴静 闻建 胡贵鹏 刘立明 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第4期58-64,共7页
D-阿洛酮糖是一种在自然界中存在极少的酮糖,因其具有与蔗糖相近的甜度但热量更低而备受关注。然而,D-阿洛酮糖的高效生物合成仍然面临挑战,是由于用于生产的酮糖3-差向异构酶的热稳定性较差。该研究通过理性设计,引入二硫键和属性嫁接... D-阿洛酮糖是一种在自然界中存在极少的酮糖,因其具有与蔗糖相近的甜度但热量更低而备受关注。然而,D-阿洛酮糖的高效生物合成仍然面临挑战,是由于用于生产的酮糖3-差向异构酶的热稳定性较差。该研究通过理性设计,引入二硫键和属性嫁接策略,成功获得了热稳定性更高的最佳突变体M03。最佳突变体M03的T m值从52.7℃提高到69.4℃;在无需外源添加金属离子的条件下,55℃时半衰期延长至254.3 min,是野生型的54.1倍;通过分子动力学模拟和结构分析揭示了性能提升的详细机制。该研究为工业化生产D-阿洛酮糖提供了一个有潜力的突变菌株。 展开更多
关键词 D-阿洛酮糖 D-塔格糖3-差向异构酶 热稳定性 蛋白质工程改造 分子动力学模拟
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Clostridium scindens ATCC35704中的D-塔格糖-3-差向异构酶的克隆表达、纯化及活性研究
3
作者 邢庆超 沐万孟 +2 位作者 江波 周榴明 张涛 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期6-10,共5页
D-阿洛酮糖作为一种新型低热量功能性甜味剂,可以通过D-塔格糖-3-差向异构酶家族,以D-果糖为底物C-3位异构化得到。一个新的来源于微生物Clostridium scindens ATCC 35704中ZP 0243228的D-塔格糖-3-差向异构酶基因(CS-DTE),通过克隆并... D-阿洛酮糖作为一种新型低热量功能性甜味剂,可以通过D-塔格糖-3-差向异构酶家族,以D-果糖为底物C-3位异构化得到。一个新的来源于微生物Clostridium scindens ATCC 35704中ZP 0243228的D-塔格糖-3-差向异构酶基因(CS-DTE),通过克隆并成功导入E.coli BL21(DE3)中,构建了基因重组菌,诱导目的重组基因过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析,在约31 ku处出现显著的特征蛋白条带;通过对其活性检测表明,该重组酶分别以D-塔格糖和D-果糖为底物,可以生成D-山梨糖和D-阿洛酮糖,转化率分别为8.6%和27.9%。 展开更多
关键词 D-阿洛酮糖 D-山梨糖 D-塔格糖-3-差向异构酶 基因重组 亲和层析
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Clostridium cellulolyticum D-塔格糖3-差向异构酶基因的克隆、表达及酶活性 被引量：7
4
作者 储菲菲 邢庆超 +4 位作者 沐万孟 张涛 缪铭 江波 周榴明 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期283-286,共4页
D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。作者克隆到一种新型的D-塔格糖3-差向异构酶基因,来源于微生物Clostridium cellulolyticumH10。以pET-22b(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细胞,构建了基... D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。作者克隆到一种新型的D-塔格糖3-差向异构酶基因,来源于微生物Clostridium cellulolyticumH10。以pET-22b(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的蛋白质的过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约31 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明:该重组酶具有较高的转化活性。 展开更多
关键词 D-塔格糖3-差向异构酶 D-阿洛酮糖 克隆 表达 亲和层析
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D-塔格糖3-差向异构酶家族蛋白的研究进展 被引量：5
5
作者 沐万孟 张涛 +1 位作者 江波 张龙涛 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期127-131,共5页
稀有糖是在自然界中存在但含量极少的一类单糖及衍生物,其在膳食、保健、医药等领域中发挥着重要的功能。D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase,缩写为DTE)家族蛋白在稀有糖生物转化中占有重要地位。文中对DTE家族蛋白的最新进... 稀有糖是在自然界中存在但含量极少的一类单糖及衍生物,其在膳食、保健、医药等领域中发挥着重要的功能。D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase,缩写为DTE)家族蛋白在稀有糖生物转化中占有重要地位。文中对DTE家族蛋白的最新进展进行了综述;同时,展望了DTE家族蛋白的研究趋势。 展开更多
关键词 稀有糖 D-塔格糖3-差向异构酶 生物转化
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Clostridium bolteae ATCC BAA-613 D-塔格糖3-差向异构酶的诱导表达、纯化及活性研究 被引量：2
6
作者 储菲菲 沐万孟 +3 位作者 邢庆超 周榴明 张涛 江波 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期198-201,392,共5页
D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。一种新型的能够编码D-塔格糖3-差向异构酶的基因CLOBOL_00069被克隆,它来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613。以pUC57为克隆载体,以pET-22b(+)为载体质粒,E... D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。一种新型的能够编码D-塔格糖3-差向异构酶的基因CLOBOL_00069被克隆,它来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613。以pUC57为克隆载体,以pET-22b(+)为载体质粒,E.coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组工程菌。IPTG诱导剂诱导目的蛋白的表达;通过镍柱亲和层析,杂蛋白与目的蛋白得到了很好的分离。对纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析,在约32ku处出现明显的特征条带。通过活性研究表明,Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase属于DTEase家族,并具有较高的生物转化率,反应10h后转化率达到20%。 展开更多
关键词 D-塔格糖3-差向异构酶 D-阿洛酮糖 基因重组 亲和层析
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D-塔格糖3-差向异构酶的固定化研究
7
作者 周林芳 储菲菲 +1 位作者 张涛 江波 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2012年第19期197-200,共4页
从14种离子交换树脂和吸附树脂中,筛选出固定化效果较好的大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂D301-Ⅲ为载体,以戊二醛为交联剂,通过先吸附后交联的方法对D-塔格糖3-差向异构酶的固定化进行研究。结果表明,最佳固定化条件为:加酶量为2.00m... 从14种离子交换树脂和吸附树脂中,筛选出固定化效果较好的大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂D301-Ⅲ为载体,以戊二醛为交联剂,通过先吸附后交联的方法对D-塔格糖3-差向异构酶的固定化进行研究。结果表明,最佳固定化条件为:加酶量为2.00mL/g(粗酶液/树脂),吸附pH7.5,吸附时间为8h,吸附温度为30℃,戊二醛浓度为0.05%,交联时间为3h,固定化酶活回收率可达50%以上。固定化酶重复使用10次,酶活仍能稳定保持在初始酶活的65%以上,具有良好的操作稳定性。 展开更多
关键词 D-塔格糖3-差向异构酶 树脂 固定化
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D-塔格糖3-差向异构酶的储存稳定性 被引量：2
8
作者 张巧 帅玉英 +3 位作者 张涛 江波 缪铭 沐万孟 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1-5,共5页
为提高D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimeriase,DTE)粗酶液的储存稳定性,在其粗酶液中添加防腐剂以及糖类、盐类、多元醇类与蛋白质等稳定剂。通过单因子研究与正交实验,研究了它们对酶液储存稳定性的影响。结果表明:0.3%尼泊金... 为提高D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimeriase,DTE)粗酶液的储存稳定性,在其粗酶液中添加防腐剂以及糖类、盐类、多元醇类与蛋白质等稳定剂。通过单因子研究与正交实验,研究了它们对酶液储存稳定性的影响。结果表明:0.3%尼泊金甲酯(methylparaben,Met)有较佳的防腐效果,且能显著降低酶液的失活速率;果糖、肌醇、Mg SO4是DTE良好的稳定剂,其组合2 mmol/L Mg SO4,6%果糖,4%肌醇为最优的复合稳定剂;将加有0.3%Met和复合稳定剂的粗酶液在25℃下保存,粗酶失活半衰期为62 d,而仅加防腐剂Met的半衰期为25 d,空白酶液仅2 d。因此,复合稳定剂与防腐剂Me的联合使用能较好地提高DTE粗酶液的储存稳定性。 展开更多
关键词 D-塔格糖3-差向异构酶 储存稳定性 半衰期 稳定剂
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乳糖诱导D塔格糖3差向异构酶基因在大肠杆菌中的表达 被引量：5
9
作者 贾敏 江波 +4 位作者 张晓鸣 沐万孟 张涛 缪铭 周榴明 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2013年第13期143-146,152,共5页
以D-塔格糖3-差向异构酶高效表达菌株BL21(DE3)/pET22b-cbdte为研究对象,考察乳糖作为诱导剂诱导D-塔格糖3-差向异构酶在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性。在摇瓶发酵条件下,从诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等四个方面,研... 以D-塔格糖3-差向异构酶高效表达菌株BL21(DE3)/pET22b-cbdte为研究对象,考察乳糖作为诱导剂诱导D-塔格糖3-差向异构酶在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性。在摇瓶发酵条件下,从诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等四个方面,研究诱导条件对目的蛋白表达的影响。结果表明,工程菌培养至对数生长中期OD值为1.0左右后,加入终浓度为5g/L的乳糖,于20℃的条件下诱导7h,可获得最大酶活。与异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)最适诱导条件相比,优化后的乳糖诱导酶活提高82.7%,可溶性目的蛋白的表达量提高99.5%,菌体生物量提高30.5%。研究结果为乳糖作为诱导剂应用于D-塔格糖3-差向异构酶的工业化生产提供有益的参考和借鉴。 展开更多
关键词 D-塔格糖3-差向异构酶 乳糖 IPTG 诱导表达
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尿苷二磷酸-葡萄糖4-差向异构酶编码基因galE影响甘薯青枯菌致病性和碳代谢
10
作者 张鸿 林志坚 +6 位作者 祝金栋 林赵淼 李国良 许泳清 刘中华 邱永祥 邱思鑫 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期662-676,共15页
为明确尿苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖4-差向异构酶编码基因galE的功能,通过构建甘薯青枯菌galE基因敲除菌株ΔgalE及回补菌株CΔgalE,探索galE基因与甘薯青枯菌致病相关表型间的关联及对甘薯青枯菌生理代谢的影响。结果表... 为明确尿苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖4-差向异构酶编码基因galE的功能,通过构建甘薯青枯菌galE基因敲除菌株ΔgalE及回补菌株CΔgalE,探索galE基因与甘薯青枯菌致病相关表型间的关联及对甘薯青枯菌生理代谢的影响。结果表明:galE基因缺失显著降低了青枯菌对甘薯的致病性,并且影响了致病相关表型。ΔgalE菌落流动性、菌体泳动能力、胞外多糖含量和生物膜形成量均明显低于野生型SPRS911和CΔgalE。在半乳糖代谢途径中,galE基因缺失后,参与尿苷二磷酸葡糖与葡萄糖之间代谢的galU、pgm、glk基因表达量降低,D-葡萄糖-6-磷酸累积;与UDP-半乳糖代谢有关的dgoK、dgoAa、dgoAb、malZ和galM基因表达量升高。galE基因缺失还加强了甘薯青枯菌对于苹果酸的同化作用。上述研究结果说明,galE基因对青枯菌的致病性与碳代谢水平均有明显影响。 展开更多
关键词 甘薯青枯菌 甘薯瘟病 尿苷二磷酸-葡萄糖4-差向异构酶 胞外多糖 半乳糖代谢 碳代谢
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