重叠延伸PCR克隆拟南芥ACCase基因和植物表达载体构建 被引量：5

1

作者 胡亚平 夏玉平 +4 位作者 吴刚 武玉花 肖玲 李均 卢长明 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期407-412,420,共7页

植物的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACCase基因cDNA长约7 000bp,难以直接克隆。本研究先通过常规PCR将... 植物的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACCase基因cDNA长约7 000bp,难以直接克隆。本研究先通过常规PCR将其cDNA分成八个重叠的片段分别扩增出来,再用重叠延伸PCR将得到的片段逐步拼接成长度为6 890bp的完整的基因序列,测序证实克隆序列正确无误,最后将其克隆到农杆菌转化植物的载体上。序列分析发现ACCase基因的开放阅读框长度为6 765bp,编码一个含2 254个氨基酸残基的多肽链,推测其分子量约为250kDa。ACCase基因的成功克隆为利用该基因调控油料作物的含油量奠定了良好基础,同时为克隆长度较大的基因提供了一种经济可行的方法。 展开更多

关键词 重叠延伸pcr 乙酰辅酶A羧化酶 基因克隆

在线阅读 下载PDF 职称材料

重叠延伸PCR法扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因及生物信息学分析

2

作者 张毅 周淑艳 +2 位作者 陈锐 孙业红 李体远 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期173-178,共6页

利用重叠延伸PCR技术扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并进行了蛋白的诱导表达。通过序列测定和ORF软件分析,该融合基因含有1个1 005 bp的ORF,编码335个氨基酸。应用生物信息学方法,对该融合基... 利用重叠延伸PCR技术扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并进行了蛋白的诱导表达。通过序列测定和ORF软件分析,该融合基因含有1个1 005 bp的ORF,编码335个氨基酸。应用生物信息学方法,对该融合基因编码的蛋白ZtaN-p23从氨基酸组成、理化性质、信号肽、疏水性/亲水性、二级结构、亚细胞定位、功能域和高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明,该蛋白的预测分子量为46.2 kD,理论等电点约为8.97,是亲水性蛋白,推测它定位于细胞质中。序列分析表明,该蛋白可能具有信号转导、转录调控、免疫应答等功能。预测的二级结构及三级结构都表明该蛋白含有较多的不规则卷曲和α-螺旋,三级结构上呈对称形状。 展开更多

关键词 重叠延伸 pcr EB病毒 BZLF1N基因 BLRF2基因 生物信息学

在线阅读 下载PDF 职称材料

重叠延伸PCR合成风疹病毒E1蛋白抗原肽基因及其表达

3

作者 芦春斌 邱建阁 马贞丽 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期830-833,共4页

目的:利用重叠延伸PCR合成风疹病毒E1基因的抗原肽段,构建其原核表达载体并表达蛋白,为进一步获得高质量的rE1重组抗原肽奠定基础。方法:利用软件对风疹病毒E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计... 目的:利用重叠延伸PCR合成风疹病毒E1基因的抗原肽段,构建其原核表达载体并表达蛋白,为进一步获得高质量的rE1重组抗原肽奠定基础。方法:利用软件对风疹病毒E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计多对寡核苷酸引物,以重叠延伸PCR法合成相应抗原肽段,克隆后测序鉴定。再以酶切连接的方法将合成的抗原肽序列克隆导入原核表达载体pET32a;利用IPTG诱导抗原肽段的表达,SDS-PAGE和West-ern blot法分析表达产物。结果:经过6轮重叠延伸PCR扩增,成功获得与预期目的序列一致的风疹病毒E1基因抗原肽并构建获得重组质粒pET32-rE1;在37℃下分别以终浓度为1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG诱导抗原肽表达,SDS-PAGE和Western blot法检测到预期的蛋白条带;且以IPTG终浓度为1 mmol/L诱导6 h后表达量最高。结论:成功合成了密码子优化的风疹病毒E1基因抗原肽段,构建其原核表达载体pET32-rE1并表达该抗原肽。 展开更多

关键词 风疹病毒E1基因 抗原肽 重叠延伸pcr 密码子优化 原核表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

重叠延伸拼接法从基因组DNA中获得Ers-MIH1基因的编码区

4

作者 郭豫杰 鲁维飞 +1 位作者 韩立强 杨国宇 《河北渔业》 2006年第10期13-15,48,共4页

蜕皮抑制激素(molt-inhibiting hormone,MIH)产生于端髓X-器官(MTXO),储存在甲壳动物眼柄的窦腺中,抑制Y-器官蜕皮素的分泌,参与调控甲壳动物的生长和发育等重要的生理活动。提取中华绒螯蟹肌肉组织中的基因组DNA,以此为模板,采用重叠... 蜕皮抑制激素(molt-inhibiting hormone,MIH)产生于端髓X-器官(MTXO),储存在甲壳动物眼柄的窦腺中,抑制Y-器官蜕皮素的分泌,参与调控甲壳动物的生长和发育等重要的生理活动。提取中华绒螯蟹肌肉组织中的基因组DNA,以此为模板,采用重叠延伸拼接法(gene splicing by overlap extension,SOE)将中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1Eriocheir sinensismolt-inhibiting hormone-1(Ers-MIH1)成熟肽基因的编码区连接起来,克隆到pMD18-T载体中,随机挑取3个阳性克隆测序,测序结果与已知的Ers-MIH1基因编码区的序列相一致。从基因组DNA中克隆该基因的方法有效地解决了取材不便给研究中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因所带来的限制等问题。 展开更多

关键词 中华绒螯蟹 基因组DNA 蜕皮抑制激素基因1 重叠延伸拼接法

在线阅读 下载PDF 职称材料

重叠PCR法合成轮状病毒抗原基因VP4 被引量：8

5

作者 冉丹霞 王荣荣 +2 位作者 郝亚宁 宋方洲 马永平 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期118-119,124,共3页

用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得轮状病毒VP4基因。根据Genbank中鼠VP4基因的序列设计34对引物,用overlap PCR法合成VP4全基因的两个片段A、B,将A、B分别连入pMD19-T simple载体,测序结果显示,成功合成了VP4全基因。证明了... 用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得轮状病毒VP4基因。根据Genbank中鼠VP4基因的序列设计34对引物,用overlap PCR法合成VP4全基因的两个片段A、B,将A、B分别连入pMD19-T simple载体,测序结果显示,成功合成了VP4全基因。证明了重叠延伸PCR法是获得目的基因的有效方法。 展开更多

关键词 轮状病毒 VP4基因 合成 重叠延伸pcr

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用重叠延伸PCR技术进行DNA的人工合成 被引量：22

6

作者 杨宇 吴元华 郑雅楠 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2006年第9期1810-1811,共2页

重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板进行PCR扩增,从而获得目的DNA基因片段的方法。该技术在目的基因的人工合成及外源蛋白在宿主中的高效表达等方面显示出良好的应用前景。综述了重叠延伸PCR技术... 重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板进行PCR扩增,从而获得目的DNA基因片段的方法。该技术在目的基因的人工合成及外源蛋白在宿主中的高效表达等方面显示出良好的应用前景。综述了重叠延伸PCR技术的原理、反应条件的优化及其应用。 展开更多

关键词 重叠延伸pcr 基因合成

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究 被引量：12

7

作者 雒丽娜 王盛 王玉炯 《安徽农业科学》 CAS 2012年第10期5779-5781,共3页

[目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[... [目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[结果]测序结果表明3个位点的突变结果与预期完全一致,即第10位引入单个碱基A、第137位碱基C突变为G以及第686位碱基G突变为A,通过重叠延伸PCR技术一次引入3个突变碱基,100%的实现目的位点的定点突变。[结论]该研究成功实现目的位点的定点突变,为rPA基因的进一步克隆和功能研究奠定了基础。同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。 展开更多

关键词 重叠延伸pcr技术 定点突变 rPA基因

在线阅读 下载PDF 职称材料

重叠延伸PCR技术及其在生物学中的应用 被引量：9

8

作者 李守宇 《生物学教学》 2013年第4期65-66,共2页

重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的DNA基因片段的方法。该技术高效、快捷、经济,在基因功能研究方面显示良好的应用前景。

关键词 重叠延伸pcr技术 片段基因合成 融合基因构建 基因定点诱变

在线阅读 下载PDF 职称材料

应用重叠延伸法合成人源明胶基因及其克隆 被引量：1

9

作者 段慧明 陈劲春 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2011年第3期73-76,共4页

由于传统的磷酸化补齐方法对于重复序列较高的基因的合成困难较大,建立一种用于克隆全长基因的重叠延伸法并获得了成功,对全长基因进行分段扩增,从而使分段扩增片段得以重叠并互为模板,在DNA聚合酶的作用下延伸获得全长基因.根据NCB I... 由于传统的磷酸化补齐方法对于重复序列较高的基因的合成困难较大,建立一种用于克隆全长基因的重叠延伸法并获得了成功,对全长基因进行分段扩增,从而使分段扩增片段得以重叠并互为模板,在DNA聚合酶的作用下延伸获得全长基因.根据NCB I中Ⅰ型胶原蛋白α1链结构基因第531~630个氨基酸的编码序列,设计合成了10条长度约为50 bp左右的寡聚核苷酸片段,用重叠延伸PCR法扩增合成出全长基因.PCR产物经回收后,克隆入载体pGEM-T中,并导入细菌中进行扩增.结果：经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析证实,合成的目的基因与设计的序列相一致. 展开更多

关键词 人源明胶基因 重叠延伸pcr 克隆

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用改良SOE-PCR技术定点突变TuMVC4-VPg基因 被引量：3

10

作者 李国亮 钱伟 +7 位作者 张淑江 李菲 章时蕃 张慧 谢露露 武剑 王晓武 孙日飞 《中国蔬菜》 北大核心 2017年第10期39-44,共6页

芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)是白菜类蔬菜生产上的重要病害,其中Tu MV VPg基因在Tu MV侵染白菜类蔬菜的过程中起着至关重要的作用,且不同Tu MV株系的致病性不同。本试验采用改良的重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术,以Tu MV C4-VP... 芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)是白菜类蔬菜生产上的重要病害,其中Tu MV VPg基因在Tu MV侵染白菜类蔬菜的过程中起着至关重要的作用,且不同Tu MV株系的致病性不同。本试验采用改良的重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术,以Tu MV C4-VPg基因序列为模板,定点突变Tu MV C4-VPg与Tu MV CDN1-VPg基因间5个差异核苷酸位点(决定5个氨基酸差异)。结果表明:通过SOE-PCR技术获得了5个Tu MV C4-VPg基因的单点突变体,即Tu MV C4-VPg-Ⅰ、Tu MV C4-VPg-Ⅱ、Tu MV C4-VPg-Ⅲ、Tu MV C4-VPg-Ⅳ和Tu MV C4-VPg-Ⅴ。 展开更多

关键词 白菜类蔬菜 芜菁花叶病毒 VPg基因 重叠延伸pcr技术 单点突变

在线阅读 下载PDF 职称材料

OE-PCR快速合成基因的探索研究

11

作者 董冰雪 韩雪梅 +4 位作者 薜淑萍 耿三春 刘伟 李运会 詹慧莹 《湖北农业科学》 北大核心 2013年第12期2929-2933,共5页

根据GenBank中基因序列,利用DNAworks3.1软件,选择合适的参数优化设计引物。通过一步简单的重叠延伸PCR(OE-PCR),然后使用最外端的引物进行PCR扩增得到完整的基因序列。结果表明,利用该方法不但成功地合成了几个具有毕赤酵母密码子偏好... 根据GenBank中基因序列,利用DNAworks3.1软件,选择合适的参数优化设计引物。通过一步简单的重叠延伸PCR(OE-PCR),然后使用最外端的引物进行PCR扩增得到完整的基因序列。结果表明,利用该方法不但成功地合成了几个具有毕赤酵母密码子偏好性的基因,而且一次向野生型Cip基因里引入了12个点突变,并可以低成本、低错误率甚至是正确无误地合成1.5 kb以内的任何已知基因。 展开更多

关键词 基因合成 DNAworks3 1软件 重叠延伸pcr(OE-pcr)

在线阅读 下载PDF 职称材料

人、黑猩猩和叶猴FKN全基因的克隆及体外表达的比较研究 被引量：1

12

作者 洪晓武 张亚平 +4 位作者 储以微 高波 邵先安 蒋正刚 熊思东 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期326-330,共5页

目的克隆人、黑猩猩和叶猴FKN全基因及体外表达,比较研究FKN在进化过程中基因组水平和蛋白表达水平的差异。方法应用基因重叠延伸拼接PCR法(Gene splicing by overlapping extension PCR,SOE-PCR)将FKN的3个外显子编码序列依次进行前后... 目的克隆人、黑猩猩和叶猴FKN全基因及体外表达,比较研究FKN在进化过程中基因组水平和蛋白表达水平的差异。方法应用基因重叠延伸拼接PCR法(Gene splicing by overlapping extension PCR,SOE-PCR)将FKN的3个外显子编码序列依次进行前后拼接,然后插入pcDNA3.1/myc-His(-)A真核表达载体中,经酶切、测序鉴定后转染CHO细胞体外表达,RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物。结果酶切、测序鉴定证实插入的基因片段为完整的FKN,RT-PCR可从转染的CHO细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段,其表达蛋白能分泌至胞外,SDS-PAGE显示其分子量约为95000,抗c-myc抗体可与载体上的c-myc蛋白特异性结合。测序显示人、黑猩猩和叶猴相比,FKN基因除了有散在的点突变外,还发现有一明显的30bp的缺失,但此缺失对FKN蛋白的表达并不影响。结论成功克隆人、黑猩猩和叶猴FKN全基因,基因组水平和蛋白表达水平的比较研究为后续探讨FKN在高级灵长类物种进化过程中免疫学功能的演变奠定基础。 展开更多

关键词 FKN 基因重叠延伸拼接pcr 基因克隆 灵长类

在线阅读 下载PDF 职称材料

转基因大豆、玉米、油菜和水稻品系特异性检测质粒标准分子的快速构建及应用 被引量：11

13

作者 吴永彬 肖维威 +5 位作者 张宝 蔡翠霞 康文杰 周琳华 刘唐书 马文丽 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期775-782,共8页

本文采用重叠延伸PCR技术快速构建了转基因大豆GTS40-3-2、玉米NK603、油菜RT73和水稻TT51-1的4种品系作物的质粒标准分子.经快速PCR鉴定及测序分析验证后,将构建的阳性质粒标准分子应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建,并建立其相应... 本文采用重叠延伸PCR技术快速构建了转基因大豆GTS40-3-2、玉米NK603、油菜RT73和水稻TT51-1的4种品系作物的质粒标准分子.经快速PCR鉴定及测序分析验证后,将构建的阳性质粒标准分子应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建,并建立其相应的荧光定量PCR检测体系,同时对该体系的扩增效率、精确度、灵敏度等指标进行了评估.结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测体系中,目标序列的扩增效率均在97.434%～101.479%正常范围内(R2≥0.995),定量极限为20 copies,表明我们已成功构建了这4种转基因作物的品系质粒标准分子,并能有效应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建. 展开更多

关键词 转基因 重叠延伸pcr 质粒标准分子 品系特异性检测 实时荧光定量pcr

在线阅读 下载PDF 职称材料

猪α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究 被引量：11

14

作者 闫若潜 吴志明 +3 位作者 张志凌 盛敏 刘光辉 赵明军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期248-255,共8页

为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleuk... 为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleukin-2,PoIL-2)成熟肽基因连接,构建成PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因,并克隆入pGEM-T Easy载体,将PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体进行原核表达。通过尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rPoIFN-α-linker-PoIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中的PoIFN-α在不同细胞系上对不同病毒增殖活性的抑制作用;分别采用MTT法和PoIL-2 ELISA试验方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中PoIL-2的生物学活性。结果表明成功构建并克隆PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中得到高效表达,表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白相对分子质量约36.7 ku,蛋白经纯化后纯度在96%以上。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在细胞上具有与单一rPoIFN-α蛋白相近的抑制病毒增殖活性,其中在PK-15细胞上抗VSV的活性单位为1.891×104I U.mL-1,在Marc-145细胞上抑制高致病性PRRSV增殖的活性单位为905 U.mL-1;rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有与单一rPoIL-2蛋白对照相近的生物学活性,可明显促进CTLL-2细胞的增殖,并可与抗PoIL-2单抗发生特异性免疫反应。这表明rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有rPoIFN-α和rPoIL-2蛋白双重的生物学活性,为基因工程抗病毒制剂的开发以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征等病毒性疾病的预防和治疗等研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪Α干扰素 猪白细胞介素2 重叠延伸pcr 嵌合基因 融合表达 活性

在线阅读 下载PDF 职称材料

PCV2a-ORF3基因缺失株感染性克隆的构建 被引量：7

15

作者 湛洋 胡意 +2 位作者 王东亮 蔡杰 邓治邦 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期351-355,共5页

为构建猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的感染性克隆及其ORF3缺失的感染性克隆,本研究通过比较分析Gen Bank中8种亚型的PCV2基因组序列(各3株),设计了PCV2基因全长克隆引物,以从江西省萍乡市某猪场疑似感染断奶仔猪多系统衰竭综合征病死猪的病料... 为构建猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的感染性克隆及其ORF3缺失的感染性克隆,本研究通过比较分析Gen Bank中8种亚型的PCV2基因组序列(各3株),设计了PCV2基因全长克隆引物,以从江西省萍乡市某猪场疑似感染断奶仔猪多系统衰竭综合征病死猪的病料中提取的DNA为模板,利用PCR方法扩增PCV2全长基因序列并进行测序。利用分子生物学软件对测序结果分析,结果表明所获得的克隆为PCV2a-2A基因型。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增病毒全长基因组DNA,克隆于p SP72载体中构建野生型PCV2a病毒株感染性克隆。此外,采用SOE-PCR方法,缺失野生型PCV2a感染性克隆中的阅读框3(ORF3),并将这两种重组质粒分别转染PK15细胞,盲传6代后经PCR和间接免疫荧光方法检测显示,构建的PCV2a病毒株与PCV2a-ORF3突变株克隆均具有感染性。本研究为进一步探究ORF3基因对PCV2致病机理和免疫原性的影响奠定了基础。 展开更多

关键词 PCV2 ORF3基因 基因缺失 重叠延伸pcr

在线阅读 下载PDF 职称材料

TAV-CP、CVB-CP、CChMVd基因片段的融合及其RNAi载体的构建 被引量：5

16

作者 刘佳 黄丛林 +2 位作者 吴忠义 张秀海 王永勤 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2013年第1期106-111,共6页

番茄不孕病毒(TAV)、菊花B病毒(CVB)、菊花褪绿斑驳类病毒(CChMVd)是侵染菊花的3种主要病毒,严重影响菊花品质。利用Blast及分子生物学软件DNAStar对TAV、CVB、CChMVd基因序列同源性进行分析比较,选用TAV的277 bp(1 810～2 086),CVB的28... 番茄不孕病毒(TAV)、菊花B病毒(CVB)、菊花褪绿斑驳类病毒(CChMVd)是侵染菊花的3种主要病毒,严重影响菊花品质。利用Blast及分子生物学软件DNAStar对TAV、CVB、CChMVd基因序列同源性进行分析比较,选用TAV的277 bp(1 810～2 086),CVB的281 bp(496～776),CChMVd的217 bp(109～325)的部分基因片段,应用重叠延伸PCR技术将其拼接成融合基因CBT,构建了以CaMV 35S启动子驱动的含有"正向CBT片段-内含子-反向CBT片段"的RNAi的植物表达载体,为培育抗3种病毒的菊花优异种质资源奠定基础。 展开更多

关键词 菊花 TAV-CP CVB-CP CChMV 重叠延伸pcr 融合基因 RNAI载体

在线阅读 下载PDF 职称材料

人β防御素4基因的合成及其真核表达载体的构建 被引量：6

17

作者 曹玉红 张国成 +2 位作者 张光运 丁翠玲 李茹英 《医学研究生学报》 CAS 2007年第10期1115-1116,1118,共3页

关键词 人β防御素4 重叠延伸pcr 基因合成 基因克隆

在线阅读 下载PDF 职称材料

人β防御素4基因的合成及克隆载体的构建 被引量：4

18

作者 曹玉红 张光运 +2 位作者 张国成 徐彦鸣 张建 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期377-378,380,共3页

目的：合成人β防御素4（HBD4）基因并构建其克隆载体.方法：根据GenBank中HBD4结构基因的序列, 设计合成了6条长度为32 ～60 bp的寡聚核苷酸片段, 用重叠延伸PCR法扩增合成HBD4 cDNA全长.PCR产物经双酶切后, 克隆入载体pMD18-T中, 并... 目的：合成人β防御素4（HBD4）基因并构建其克隆载体.方法：根据GenBank中HBD4结构基因的序列, 设计合成了6条长度为32 ～60 bp的寡聚核苷酸片段, 用重叠延伸PCR法扩增合成HBD4 cDNA全长.PCR产物经双酶切后, 克隆入载体pMD18-T中, 并导入细菌中进行扩增.结果：HBD4基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、 测序分析证实, 合成的目的基因与设计的HBD4 cDNA的序列相一致, 并成功地克隆入克隆载体pMD18-T中.结论：用重叠延伸PCR法能方便、 准确地获得目的基因片段.重组克隆载体pMD18-T-HBD4 的获得, 为构建HBD4基因的表达载体并表达奠定了基础. 展开更多

关键词 人β防御素4 重叠延伸pcr 基因合成 基因克隆

在线阅读 下载PDF 职称材料

小鼠β-防御素2与甲型流感病毒HA1融合基因真核载体的构建与表达 被引量：2

19

作者 朱元军 张卫东 +4 位作者 李虹 王丰平 钟利 蒋忠华 李明远 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期8-10,15,共4页

目的:构建小鼠β-防御素2(mBD2)与甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)血凝素(HA1)基因融合表达的真核载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:用PCR技术分别从质粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中扩增mBD2与HA1基因片段,再用重叠延伸PC... 目的:构建小鼠β-防御素2(mBD2)与甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)血凝素(HA1)基因融合表达的真核载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:用PCR技术分别从质粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中扩增mBD2与HA1基因片段,再用重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将HA1与mBD2通过一段多肽接头Gly4Ser融合为mBD2-HA1。将mBD2-HA1融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切、PCR和测序鉴定正确后,用脂质体转入HEK293细胞,通过免疫荧光检测其瞬时表达。结果:融合基因mBD2-HA1的真核表达载体pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1构建成功,并在HEK293细胞中成功表达融和蛋白。结论:融合基因mBD2-HA1真核表达载体的成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。 展开更多

关键词 Β-防御素 流感病毒 融合基因 重叠延伸pcr 免疫荧光

在线阅读 下载PDF 职称材料

吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达 被引量：2

20

作者 王蓓 李桂欢 +4 位作者 鲁义善 汤菊芬 黄郁葱 吴灶和 简纪常 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期137-142,共6页

利用重叠延伸(SOEing)PCR技术,将吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQ0910株表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因通过Linker序列融合,构... 利用重叠延伸(SOEing)PCR技术,将吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQ0910株表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因通过Linker序列融合,构建成为Sip-GAPDH融合基因。将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明,重组质粒pET-32a-Sip-GAPDH在大肠杆菌BL21(DE3)中表达后所获得的融合蛋白Sip-GAPDH分子量为102.01 kD,表达最佳条件为37℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导5 h。Western blot鉴定结果表明融合基因得到了成功表达。 展开更多

关键词 无乳链球菌 Sip-GAPDH融合基因 重叠延伸pcr技术 原核表达

在线阅读 下载PDF 职称材料