新一代基因编码5-羟色胺荧光探针优化及应用

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作者 徐慕凡 张坤 +3 位作者 王静怡 高欣柯 程傲冰 张鹏 《上海交通大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第5期529-537,共9页

目的·优化基于细菌周质结合蛋白(periplasmic binding proteins,PBPs)设计的基因编码5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)荧光探针iSeroSnFR,以提高其在体内外5-HT检测中的荧光反应和时空分辨率,从而为相关研究提供更为精确的工具... 目的·优化基于细菌周质结合蛋白(periplasmic binding proteins,PBPs)设计的基因编码5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)荧光探针iSeroSnFR,以提高其在体内外5-HT检测中的荧光反应和时空分辨率,从而为相关研究提供更为精确的工具。方法·采用Gibson重组技术,将原始探针iSeroSnFR(以下称为iSeroSnFR1.0)中的循环重排超折叠绿色荧光蛋白(circularly permuted superfolder green fluorescence protein,cpsfGFP)替换为源自乙酰胆碱荧光探针iAChSnFR的cpsfGFP基因序列,构建新型基因编码的5-HT探针iSeroSnFR1.2。在HEK293细胞中过表达这2种探针,并利用压力给药系统瞬时加入外源性5-HT,比较其荧光反应动态范围和动力学特性。此外,为模拟生理环境,利用Sindbis病毒将探针表达于体外培养的原代小鼠皮层神经元,通过电刺激诱导神经元释放内源性5-HT,以进一步评估2种探针在检测内源性5-HT方面的性能。结果·在HEK293细胞中,iSeroSnFR1.2对外源性5-HT的荧光响应(ΔF/F_(0))是iSeroSnFR1.0的1.5倍。与iSeroSnFR1.0(上升时间44.9 ms和衰减时间常数1730.4 ms)相比,iSeroSnFR1.2的上升时间(36.3 ms)和衰减时间常数(1003.6 ms)分别缩短了19.1%和42.0%。在原代小鼠皮层神经元中,iSeroSnFR1.2对电刺激诱导的内源性5-HT释放的荧光反应为iSeroSnFR1.0的2.7倍,上升时间和下降时间分别缩短了44.0%和26.7%。此外,iSeroSnFR1.2还表现出更高的基底荧光强度,有利于在高背景环境中进行成像。结论·优化后的iSeroSnFR1.2显著提高了对5-HT检测的荧光响应和时间分辨率,为体内外5-HT动态检测研究提供了更为有力的工具,有望促进神经科学、精神医学等领域对5-HT在各种生理和病理过程中作用机制的深入理解。 展开更多

关键词 基因编码探针 5-羟色胺 循环重排超折叠绿色荧光蛋白 细菌周质结合蛋白

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流式细胞术在检测细胞氧化还原状态荧光蛋白探针中的应用

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作者 田烨 刘奥 +3 位作者 董瑞 祁星 易静 杨洁 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期10-17,共8页

目的·探索流式细胞术检测基因编码的荧光蛋白探针ro GFP2的方法,比较其与经典的激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测方法的异同,探讨其在检测不同氧化还原状态细胞亚群中的应用价值。方法·用r... 目的·探索流式细胞术检测基因编码的荧光蛋白探针ro GFP2的方法,比较其与经典的激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测方法的异同,探讨其在检测不同氧化还原状态细胞亚群中的应用价值。方法·用ro GFP2转染He La细胞,经H_2O_2处理后,采用LSCM技术和流式细胞术分别检测ro GFP2,以405 nm/488 nm荧光信号强度比值反映细胞氧化还原状态。转染胰腺癌细胞株Panc-1细胞,应用流式细胞术检测CD44和CD24不同标记细胞亚群的ro GFP2,比较干细胞与其他细胞氧化还原状态的异同。结果·与LSCM技术相比,流式细胞术也可检测H_2O_2引起的ro GFP2变化,且可区分群体中不同的亚群。Panc-1细胞中CD24^+/CD44^+肿瘤干细胞群与非干细胞群相比,ro GFP2比值更低,细胞处于更还原的状态。结论·流式细胞术可用于检测基因编码的氧化还原探针和特异地分析亚群的变化,可能将应用于肿瘤生物学、干细胞生物学等研究中。 展开更多

关键词 流式细胞术 细胞氧化还原状态 基因编码荧光蛋白探针 roGFP2 肿瘤干细胞

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编码绿色荧光蛋白和βARKct的重组腺病毒的制备 被引量：1

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作者 单志新 郑猛 +4 位作者 余细勇 林秋雄 符永恒 谭虹虹 林曙光 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期392-395,408,共5页

【目的】制备编码绿色荧光蛋白(GFP)和G茁γ活性抑制剂茁ARKct的重组腺病毒载体。【方法】构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-茁ARKct,经PmeI线性化后转化入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-I的BJ5183菌,筛选获得重组腺病毒质粒pAdEasy-gfp-茁AR... 【目的】制备编码绿色荧光蛋白(GFP)和G茁γ活性抑制剂茁ARKct的重组腺病毒载体。【方法】构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-茁ARKct,经PmeI线性化后转化入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-I的BJ5183菌,筛选获得重组腺病毒质粒pAdEasy-gfp-茁ARKct。用LipoFectamine2000将经PacI线性化的pAdEasy-gfp-茁ARKct转染入人胚肾293细胞,包装并扩增出重组腺病毒颗粒rAd-gfp-茁ARKct。用氯化铯高速梯度离心、纯化rAd-gfp-茁ARKct。用rAd-GFP-茁ARKct干预去甲肾上腺素诱导的乳鼠心肌细胞肥大过程,观察对茁肌球蛋白重链(茁MHC)基因表达的影响。【结果】将pAdTrack-CMV-茁ARKct转入含pAdEasy-I的BJ5183菌后获得20%的阳性重组体克隆。重组腺病毒质粒在293细胞中包装并扩增出大量的腺病毒,经PCR鉴定含有茁ARKct编码基因。透析纯化得到重组腺病毒滴度为6.0×106pfu/mL。rAd-GFP-茁ARKct表达的茁ARKct可抑制乳鼠心肌细胞茁MHC的高表达。【结论】成功构建重组腺病毒载体,并在293细胞中包装、制备出可表达茁ARKct的重组腺病毒rAd-gfp-茁ARKct。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白 制备 重组腺病毒载体 人胚肾293细胞 心肌细胞肥大 去甲肾上腺素 肌球蛋白重链 PCR鉴定 穿梭质粒 骨架质粒 病毒颗粒 梯度离心 基因表达 编码基因 病毒滴度 线性化 MHC 抑制剂 PME Pac 包装 氯化铯 重组体

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高温胁迫下B型烟粉虱热激蛋白基因hsp70表达量的变化 被引量：25

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作者 崔旭红 谢明 万方浩 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期1087-1091,共5页

为了探讨热激蛋白在B型烟粉虱Bemisiatabaci B-biotype抵抗高温中的作用,以含有B型烟粉虱热激蛋白基因hsp70片段的质粒为模板,用TaqMan-MGB探针和特异性引物构建了B型烟粉虱hsp70实时荧光定量RT-PCR检测体系,并检测了37℃-45℃高温胁迫... 为了探讨热激蛋白在B型烟粉虱Bemisiatabaci B-biotype抵抗高温中的作用,以含有B型烟粉虱热激蛋白基因hsp70片段的质粒为模板,用TaqMan-MGB探针和特异性引物构建了B型烟粉虱hsp70实时荧光定量RT-PCR检测体系,并检测了37℃-45℃高温胁迫及气温变化时B型烟粉虱成虫体内hsp70表达的情况。结果表明：缓和的高温对B型烟粉虱成虫hsp70表达具有诱导作用,在37℃-41℃范围内,hsp70的表达量随着温度的升高从8.78×10^5±6.41×10^4拷贝数上升到1.99×10^7±1.45×10^5拷贝数,在41℃时达到最高峰;而当温度升高到43℃和45℃,hsp70表达量迅速降低。B型烟粉虱成虫hsp70的表达与昼夜气温变化有关,当上午气温从34℃上升到41℃时,hsp70的表达量从1.16×10^5±1.48×10^4拷贝数上升到6.29×10^6±1.80×10^5拷贝数;当傍晚气温下降到33℃时,hsp70表达量也下降到2.32×10^5±7.69×10^3拷贝数。因此推测,hsp70在B型烟粉虱抵抗高温胁迫方面可能具有重要作用。 展开更多

关键词 B型烟粉虱 高温胁迫 热激蛋白基因hsp70 表达量 实时荧光定量RT-PCR TAQMAN-MGB探针

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家蚕一种新的胰蛋白酶基因电子克隆和序列分析 被引量：7

5

作者 李娟 赵萍 《蚕学通讯》 2005年第1期1-4,共4页

以按蚊胰蛋白酶基因的氨基酸序列为信息探针,对家蚕EST数据库进行同源检索筛选,克隆了家蚕一种新的胰蛋白酶基因。该基因编码2 71个氨基酸,与按蚊胰蛋白酶的一致性为32 % ,含有典型的胰蛋白酶功能结构域Tryp -SPc ,但在催化三联体中His... 以按蚊胰蛋白酶基因的氨基酸序列为信息探针,对家蚕EST数据库进行同源检索筛选,克隆了家蚕一种新的胰蛋白酶基因。该基因编码2 71个氨基酸,与按蚊胰蛋白酶的一致性为32 % ,含有典型的胰蛋白酶功能结构域Tryp -SPc ,但在催化三联体中His不保守。 展开更多

关键词 蛋白酶基因 序列分析 电子克隆 家蚕 EST数据库 胰蛋白酶 氨基酸序列 功能结构域 基因编码 一致性 His 三联体 按蚊 探针

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细胞内氧化还原状态荧光探针的原理与应用 被引量：3

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作者 刘奥 祁星 +3 位作者 张颖超 徐天雪 易静 杨洁 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期101-107,共7页

细胞的氧化还原状态或活性氧水平是其基本的生理特征。它自身受到精细的调控,同时也调控细胞功能,在细胞、机体的生理和病理活动中扮演重要角色。检测细胞氧化还原状态及其变化是目前基础研究和临床研究中的重要内容。该文就目前检测方... 细胞的氧化还原状态或活性氧水平是其基本的生理特征。它自身受到精细的调控,同时也调控细胞功能,在细胞、机体的生理和病理活动中扮演重要角色。检测细胞氧化还原状态及其变化是目前基础研究和临床研究中的重要内容。该文就目前检测方法中的荧光探针做一综述。通过介绍不同荧光探针的原理和特征,尤其是遗传编码荧光蛋白探针的原理和应用,理解荧光探针在基础研究和疾病相关研究中的应用,并展望其在细胞及动物整体水平新的应用前景。 展开更多

关键词 氧化还原状态 活性氧 荧光探针 遗传编码荧光蛋白探针

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蛙病毒三重荧光PCR检测方法的建立 被引量：5

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作者 李江宇 王树云 +10 位作者 王姝 任彤 高志强 谷强 张伟 刘艳华 王娜 张旻 景宏丽 江育林 张利峰 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期746-752,共7页

根据GenBank中收录的蛙病毒属虹彩病毒主要衣壳蛋白（MCP）基因序列设计了一对通用引物和3条Taqman探针，通过PCR反应体系的优化以及反应的特异性、灵敏性和干扰性试验，建立了一种可检测蛙病毒属大部分成员并能进行初步分类的三重荧光... 根据GenBank中收录的蛙病毒属虹彩病毒主要衣壳蛋白（MCP）基因序列设计了一对通用引物和3条Taqman探针，通过PCR反应体系的优化以及反应的特异性、灵敏性和干扰性试验，建立了一种可检测蛙病毒属大部分成员并能进行初步分类的三重荧光PCR方法。通过鉴定分析将蛙病毒属成员分为三类，其中第一类包括蛙病毒3型（FV3）、饰纹汀蛙虹彩病毒（BIV）、流行性造血器官坏死病毒（EHNV）、欧洲鲴鱼病毒（ECV）、欧鲶病毒（ESV）、中华鳖虹彩病毒（STIV）、大鲵虹彩病毒（ADIV）、沼泽绿牛蛙虹彩病毒（RGV）和虎纹蛙病毒（TFV），第二类是Santee．Cooper蛙病毒（SCRV），由大口黑鲈虹彩病毒（LMBV）、裂唇鱼病毒（DFV）和孔雀鱼病毒（GV6）组成，而新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV）则单独作为第三类。进一步分析发现各病毒的最低检测量均达到10^2拷贝，表明该方法除了具有良好的特异性和稳定性之外还具有高度灵敏性。建立的该蛙病毒三重荧光PCR方法可为蛙病毒的快速诊断和分子流行病学调查提供一种有效的技术手段。 展开更多

关键词 蛙病毒 虹彩病毒 主要衣壳蛋白(MCP)基因 三重荧光PCR TAQMAN探针

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胎儿弯杆菌病TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：3

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作者 赵海玲 刘慧芳 +3 位作者 杜艳芬 司微 王春来 刘思国 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期874-877,共4页

为建立胎儿弯杆菌(C.fetus)定量检测方法,本研究根据C.fetus毒力因子表面蛋白(SapA)的基因序列设计引物和一条特异的TaqMan水解探针,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测C.fetus的TaqMan荧光定量PCR方法。对该方法的特异性与敏感... 为建立胎儿弯杆菌(C.fetus)定量检测方法,本研究根据C.fetus毒力因子表面蛋白(SapA)的基因序列设计引物和一条特异的TaqMan水解探针,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测C.fetus的TaqMan荧光定量PCR方法。对该方法的特异性与敏感性研究,结果显示,该方法检测C.fetus结果均为阳性,而非C.fetus均为阴性;对带有SapA基因的阳性质粒的检测敏感性为108拷贝～102拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,可敏感地检测到模板中13个拷贝的细菌DNA,其灵敏度是常规PCR方法的100倍。该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点。该方法为C.fetus快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础。 展开更多

关键词 C.fetus 表面蛋白基因SapA 实时荧光PCR TaqMan水解探针

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人脑中脱碘酶相互作用蛋白的筛选与验证 被引量：1

9

作者 张毅哲 刘琼 +1 位作者 田静 邵永红 《深圳大学学报（理工版）》 EI CAS 北大核心 2011年第5期423-429,共7页

阐述人脑内硒蛋白在维护细胞正常功能、抵御氧化损伤和预防脑疾病方面的重要作用,指出脱碘酶3是人脑中一种重要的硒蛋白.克隆了人脱碘酶3的开放读码框,将其编码区中编码硒代半胱氨酸的TGA码突变为编码半胱氨酸的密码,以脱碘酶3突变体为&... 阐述人脑内硒蛋白在维护细胞正常功能、抵御氧化损伤和预防脑疾病方面的重要作用,指出脱碘酶3是人脑中一种重要的硒蛋白.克隆了人脱碘酶3的开放读码框,将其编码区中编码硒代半胱氨酸的TGA码突变为编码半胱氨酸的密码,以脱碘酶3突变体为"诱饵",利用酵母双杂交系统从人胎脑cD-NA文库中筛选一个能与脱碘酶3相互作用的蛋白,即人丝氨酸蛋白酶抑制剂A族蛋白3.采用荧光共振能量转移技术中的敏化发射法和荧光寿命法,验证了人脑中脱碘酶的相互作用. 展开更多

关键词 基因工程 硒蛋白 脱碘酶3 大脑 基因编码 酵母双杂交系统 蛋白质筛选 荧光共振能量转移技术

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苹果壳色单隔孢溃疡病菌TaqMan实时荧光PCR检测方法 被引量：1

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作者 林惠娇 牟桂萍 +2 位作者 滕少娜 张海鹏 周而勋 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期65-70,共6页

【目的】针对我国检疫性植物病原真菌苹果壳色单隔孢溃疡病菌Botryosphaeria stevensii,建立实时荧光PCR检测方法。【方法】根据苹果壳色单隔孢溃疡病菌及其近似种的β微管蛋白基因(β-tubulin基因)保守序列设计1对特异性引物和1条TaqMa... 【目的】针对我国检疫性植物病原真菌苹果壳色单隔孢溃疡病菌Botryosphaeria stevensii,建立实时荧光PCR检测方法。【方法】根据苹果壳色单隔孢溃疡病菌及其近似种的β微管蛋白基因(β-tubulin基因)保守序列设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,分别以病菌DNA和β-tubulin基因靶标序列重组质粒DNA为阳性标准品检验探针的特异性和灵敏度。【结果】探针BsP267对苹果壳色单隔孢溃疡病菌菌株表现出特异性阳性扩增,且与近缘种及其他常见的果腐病菌无交叉反应,扩增效率为105.858%,探针检测DNA的灵敏度达到1 fg/μL。【结论】本研究建立的苹果壳色单隔孢溃疡病菌实时荧光PCR检测法具有高特异性和灵敏度,可用于该病害的防控检测和检疫工作。 展开更多

关键词 苹果壳色单隔孢溃疡病菌 实时荧光PCR TAQMAN探针 快速检测 β微管蛋白基因

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马疱疹病毒8型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

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作者 纪言霏 齐来勇 +4 位作者 张健鹏 许丹丹 张敬文 赵霞 刘文强 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第8期24-28,共5页

为了建立一种能够快速检测马疱疹病毒8型(EHV-8)的方法,本试验以EHV-8的全基因组序列为模板,针对糖蛋白B(gB)基因的保守序列,进行对比分析,设计EHV-8的特异性引物和探针,优化反应条件,建立EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该... 为了建立一种能够快速检测马疱疹病毒8型(EHV-8)的方法,本试验以EHV-8的全基因组序列为模板,针对糖蛋白B(gB)基因的保守序列,进行对比分析,设计EHV-8的特异性引物和探针,优化反应条件,建立EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证,使用该方法进行临床样本检测。结果显示,建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法对EHV-8 DNA模板的最低检测限为1.1×10^(2)copies/μL,敏感性高;EHV-8与EHV-1、EHV-4、马流产沙门氏菌和肠产毒性大肠杆菌均无交叉反应,特异性强;批内重复性试验和批间重复性试验均表明该方法重复性好。对132份临床样本的检测结果显示,阳性检出率为10.61%,基因测序正确。由此可见,本试验建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法能够满足EHV-8的检测需求,且该方法敏感性高、特异性强、重复性好,为EHV-8的进一步研究提供了有效的辅助检测手段。 展开更多

关键词 驴 马疱疹病毒8型 糖蛋白B(gB)基因 实时荧光定量PCR TAQMAN探针

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细胞内钾离子稳态测量技术及其调控机制研究进展

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作者 颜芷昕 宋娜娜 丁小强 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期750-760,共11页

钾离子在细胞内液、细胞外液及亚细胞结构中的分布处于动态平衡,它是细胞内液含量最丰富的阳离子,在细胞外液含量却很少;在亚细胞结构中,钾离子在胞核的浓度最高,细胞基质、线粒体、内质网、溶酶体次之。细胞内钾离子参与细胞形态维持... 钾离子在细胞内液、细胞外液及亚细胞结构中的分布处于动态平衡,它是细胞内液含量最丰富的阳离子,在细胞外液含量却很少;在亚细胞结构中,钾离子在胞核的浓度最高,细胞基质、线粒体、内质网、溶酶体次之。细胞内钾离子参与细胞形态维持、酶活性调控及能量代谢、遗传物质的生物合成、细胞增殖与死亡、修复和迁移、免疫等多种生命活动的调控;同时细胞内钾离子稳态失衡和肿瘤、急性缺血损伤、自身免疫病、内分泌、神经退行性等疾病发生发展密切相关,因此维持细胞内钾离子稳态具有非常重要的意义,纠正细胞内钾离子稳态失衡为疾病治疗提供了新的方向。本文综述近年细胞内钾离子稳态的基本情况和测量技术的研究进展,并探讨其调控机制及生理和病理意义。 展开更多

关键词 细胞内钾离子稳态 细胞内钾离子浓度检测 钾离子敏感荧光探针 基因编码钾离子指示剂 钾离子通道

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生物防治

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《生物技术通报》 CAS CSCD 1991年第11期80-82,共3页

关键词 晶体蛋白 芽抱杆菌 生防因子 基因灭活 荧光假单胞菌 丝核菌属 杀昆虫剂 SUBSP 粉纹夜蛾 编码蛋白

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