为探讨锯缘青蟹(Scylla serrata)性腺发育的分子机制,本研究提取锯缘青蟹卵巢的总RNA,经oligotex试剂分离mRNA,利用SMART(Switch mechanisms at the 5 end of RNAtranscript)技术及双链特异核酸内切酶DSN(duplex-specific nuclease)的...为探讨锯缘青蟹(Scylla serrata)性腺发育的分子机制,本研究提取锯缘青蟹卵巢的总RNA,经oligotex试剂分离mRNA,利用SMART(Switch mechanisms at the 5 end of RNAtranscript)技术及双链特异核酸内切酶DSN(duplex-specific nuclease)的特性构建均一化cDNA文库。经检测文库约含有4.7×107重组子,扩增后的文库含有1011以上重组子。从文库中随机挑取24个克隆进行PCR检测,文库的插入cDNA长度为500bp-2.5kb,重组率为95.8%。该文库的成功构建,为采用基因芯片技术开展锯缘青蟹性腺发育相关功能基因的研究奠定了基础。展开更多
以不同低温处理的牡丹花芽为试材,采用DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术结合SMARTTM(switching mecha-nism at 5'end of RNA transcript)建库技术合成cDNA,cDNA与pGADT7-Rec重组并转化酵母AH109,构建了冬季牡丹低温累积进...以不同低温处理的牡丹花芽为试材,采用DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术结合SMARTTM(switching mecha-nism at 5'end of RNA transcript)建库技术合成cDNA,cDNA与pGADT7-Rec重组并转化酵母AH109,构建了冬季牡丹低温累积进程中的花芽均一化cDNA文库。经检测,原始文库滴度为1.77×106cfu/ml,库容量为2.3×108。对管家基因18S rRNA均一化前后丰度检测表明,均一化程度>26,随机挑取了188个克隆,PCR方法测得文库重组率大于95%,插入片段平均长度1200bp,构建的文库质量较高。该文库为进一步通过酵母杂交技术筛选低温解除牡丹休眠进程中受低温调控的转录因子和互作蛋白,进而为构建低温解除休眠的基因调控网络奠定了基础。展开更多
植物在逆境胁迫下大量基因的表达往往会发生改变,最终导致对逆境的诱导抗性。剖析逆境作用下差异表达基因的功能是阐明植物抗逆分子机制的重要途径,而获得逆境作用下差异表达基因的全长cDNA是上述研究的基础。建立获得辣椒应答疫霉侵染...植物在逆境胁迫下大量基因的表达往往会发生改变,最终导致对逆境的诱导抗性。剖析逆境作用下差异表达基因的功能是阐明植物抗逆分子机制的重要途径,而获得逆境作用下差异表达基因的全长cDNA是上述研究的基础。建立获得辣椒应答疫霉侵染差异表达基因全长cDNA的技术平台:利用抑制性差减杂交技术构建辣椒叶片在疫霉侵染下的SSH文库,随机挑取150个克隆测序,获得24个功能已知的序列,BLASTN分析发现这些差异表达基因从功能上可分为能量代谢过程、信号传递、光合作用、抗逆反应等几种类型;利用DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术与SMARTTM(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)建库技术相结合的方法,构建了辣椒全长均一化cDNA文库,该文库含有1.8×106个独立克隆,插入片段平均长度为1.75kb,重组率为97%;基于SSH获得的差异表达基因序列设计特异性引物,从均一化文库中分离获得其相应的cDNA,结果表明:所获得的差异表达基因cDNA片段相对应的cDNA阳性克隆均为全长cDNA,所构建的SSH和均一化cDNA文库可较好地应用于辣椒应答疫霉等逆境差异表达基因全长cDNA的分离,为进一步开展差异表达基因的功能鉴定奠定基础。展开更多
文摘为探讨锯缘青蟹(Scylla serrata)性腺发育的分子机制,本研究提取锯缘青蟹卵巢的总RNA,经oligotex试剂分离mRNA,利用SMART(Switch mechanisms at the 5 end of RNAtranscript)技术及双链特异核酸内切酶DSN(duplex-specific nuclease)的特性构建均一化cDNA文库。经检测文库约含有4.7×107重组子,扩增后的文库含有1011以上重组子。从文库中随机挑取24个克隆进行PCR检测,文库的插入cDNA长度为500bp-2.5kb,重组率为95.8%。该文库的成功构建,为采用基因芯片技术开展锯缘青蟹性腺发育相关功能基因的研究奠定了基础。
文摘以不同低温处理的牡丹花芽为试材,采用DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术结合SMARTTM(switching mecha-nism at 5'end of RNA transcript)建库技术合成cDNA,cDNA与pGADT7-Rec重组并转化酵母AH109,构建了冬季牡丹低温累积进程中的花芽均一化cDNA文库。经检测,原始文库滴度为1.77×106cfu/ml,库容量为2.3×108。对管家基因18S rRNA均一化前后丰度检测表明,均一化程度>26,随机挑取了188个克隆,PCR方法测得文库重组率大于95%,插入片段平均长度1200bp,构建的文库质量较高。该文库为进一步通过酵母杂交技术筛选低温解除牡丹休眠进程中受低温调控的转录因子和互作蛋白,进而为构建低温解除休眠的基因调控网络奠定了基础。
文摘植物在逆境胁迫下大量基因的表达往往会发生改变,最终导致对逆境的诱导抗性。剖析逆境作用下差异表达基因的功能是阐明植物抗逆分子机制的重要途径,而获得逆境作用下差异表达基因的全长cDNA是上述研究的基础。建立获得辣椒应答疫霉侵染差异表达基因全长cDNA的技术平台:利用抑制性差减杂交技术构建辣椒叶片在疫霉侵染下的SSH文库,随机挑取150个克隆测序,获得24个功能已知的序列,BLASTN分析发现这些差异表达基因从功能上可分为能量代谢过程、信号传递、光合作用、抗逆反应等几种类型;利用DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术与SMARTTM(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)建库技术相结合的方法,构建了辣椒全长均一化cDNA文库,该文库含有1.8×106个独立克隆,插入片段平均长度为1.75kb,重组率为97%;基于SSH获得的差异表达基因序列设计特异性引物,从均一化文库中分离获得其相应的cDNA,结果表明:所获得的差异表达基因cDNA片段相对应的cDNA阳性克隆均为全长cDNA,所构建的SSH和均一化cDNA文库可较好地应用于辣椒应答疫霉等逆境差异表达基因全长cDNA的分离,为进一步开展差异表达基因的功能鉴定奠定基础。
