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山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:2
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作者 李鹏飞 高桂琴 +6 位作者 周广青 吴锦艳 颜新敏 曹小安 何继军 袁莉刚 尚佑军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2259-2266,共8页
山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在... 山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。 展开更多
关键词 山羊地方性鼻内肿瘤病毒 羊内源逆转录病毒 TAQMAN 荧光定量RT-PCR
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山羊地方性鼻内肿瘤病毒Shaanxi株前病毒全基因组克隆及生物信息学分析 被引量:8
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作者 何亚鹏 付明哲 +4 位作者 许信刚 庞文静 王景 周曼 张琪 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期63-66,共4页
为研究山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV)Shaanxi株前病毒全基因组序列,本研究根据Gen Bank中收录的ENTV前病毒基因组序列设计5对引物,通过PCR方法从肿瘤组织中分段扩增获得了ENTV前病毒全基因组的5个片段,测序并分析。结果显示该病毒基因... 为研究山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV)Shaanxi株前病毒全基因组序列,本研究根据Gen Bank中收录的ENTV前病毒基因组序列设计5对引物,通过PCR方法从肿瘤组织中分段扩增获得了ENTV前病毒全基因组的5个片段,测序并分析。结果显示该病毒基因组全长7 275 bp,包含相互重叠的gag-pro-pol-env编码区及5'端非编码区;ENTV Shaanxi株基因组全序列与NC004994.2、AY197548.2、ENTV-SC株(HM104174.1)核苷酸同源性分别为89%、89%、99%。本研究为ENTV的分子生物学特性研究提供资料,为进一步研究其检测方法与致病机理奠定了基础。 展开更多
关键词 山羊 地方性鼻内肿瘤病毒 全基因克隆 生物信息学分析
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山羊地方性鼻内肿瘤病毒的gag基因克隆及分析 被引量:4
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作者 侯宏艳 朱德建 +3 位作者 张丹俊 胡晓苗 赵瑞宏 戴银 《中国草食动物科学》 CAS 2018年第2期53-55,共3页
安徽省某山羊场内部分羊只发生羊鼻漏,面部一侧肿胀,进行病理剖检观察后,取面部皮下肿瘤组织研磨,提取RNA,用特异性引物通过RT-PCR方法扩增获得目的片段并测序。序列比对分析表明,获得的目的基因和山羊地方性鼻内肿瘤病毒的同源性最高,... 安徽省某山羊场内部分羊只发生羊鼻漏,面部一侧肿胀,进行病理剖检观察后,取面部皮下肿瘤组织研磨,提取RNA,用特异性引物通过RT-PCR方法扩增获得目的片段并测序。序列比对分析表明,获得的目的基因和山羊地方性鼻内肿瘤病毒的同源性最高,达99%。结果显示,此羊场的山羊感染了由山羊地方性鼻内肿瘤病毒引起的山羊地方性鼻内肿瘤。 展开更多
关键词 山羊 地方性鼻内肿瘤病毒 GAG基因 诊断
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山羊地方性鼻内肿瘤病毒MAb的制备及间接ELISA方法的建立 被引量:3
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作者 江锦秀 林裕胜 +4 位作者 张靖鹏 游伟 张龙 毛坤明 胡奇林 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期45-50,共6页
为建立检测山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的间接ELISA方法,本研究以纯化的ENTV-2免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株能够稳定分泌ENTV-2特异性单克隆抗体(MAb)的细胞株,命名为6E4,并采用鼠MAb... 为建立检测山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的间接ELISA方法,本研究以纯化的ENTV-2免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株能够稳定分泌ENTV-2特异性单克隆抗体(MAb)的细胞株,命名为6E4,并采用鼠MAb亚类鉴定试剂盒鉴定6E4 MAb的亚类,结果显示,MAb 6E4的亚类为κ链、IgG1亚型。进一步以6E4为检测抗体,经各反应条件的优化建立了检测鼻液样品中ENTV-2的间接ELISA方法,该方法的临界值为0.323。利用该方法检测羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Movi)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)以及纯化的ENTV-2和ENTV-2患病羊鼻液样品,结果显示,除纯化的ENTV-2及ENTV-2患病羊鼻液样品的检测结果呈阳性外,ORFV、Movi、Mmc的检测结果均为阴性,该方法特异性较强。将纯化的ENTV-2(以蛋白浓度换算)2倍倍比稀释(20μg/mL~0.08μg/mL)后,利用建立的间接ELISA方法检测,结果显示,纯化的ENTV-2稀释至0.3125μg/mL时检测结果仍可判定为阳性,该方法敏感性较高。批内、批间重复性试验结果显示,二者变异系数均小于10%,该方法重复性较好。采用荧光定量RT-PCR方法和本实验建立的间接ELISA方法检测109份临床鼻液样品,比较二者之间的符合率,结果显示,该间接ELISA方法与本研究室前期建立的荧光定量RT-PCR的检测结果符合率达94.5%,表明本研究建立的间接ELISA方法可用于ENTV-2感染的临床快速检测。本研究建立的ENTV-2间接ELISA方法为ENT的净化提供了技术手段。 展开更多
关键词 山羊地方性鼻内肿瘤病毒 单克隆抗体 间接ELISA
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山羊地方性鼻内肿瘤病毒SU蛋白的表达及其多克隆抗体的制备和特性分析 被引量:2
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作者 江锦秀 张靖鹏 +2 位作者 林裕胜 游伟 胡奇林 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期135-140,共6页
【目的】明确山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)SU蛋白的功能。【方法】采用RT-PCR方法从ENTV-2FJ分离株中扩增获得SU基因片段,将其克隆到pMD-19T载体;测序验证后,再亚克隆到PET-32a(+)上,在RosettagamiB(DE3)感受态细胞进行表达,采用SDS-... 【目的】明确山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)SU蛋白的功能。【方法】采用RT-PCR方法从ENTV-2FJ分离株中扩增获得SU基因片段,将其克隆到pMD-19T载体;测序验证后,再亚克隆到PET-32a(+)上,在RosettagamiB(DE3)感受态细胞进行表达,采用SDS-PAGE、Western-blot和ELISA对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。【结果】结果显示,表达的重组菌融合蛋白大小约64.38 kD,在IPTG终浓度0.4 mmol·L^(−1)、37℃诱导4 h表达效果最好。用纯化的ENTV-2进行SDS-PAGE,SU重组蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体作为一抗,进行Western-blot,结果显示鼠抗SU蛋白多克隆抗体能与ENTV-2抗原进行特异性的反应。【结论】表达的SU蛋白有较好的抗原性,为制备ENTV-2特异性单克隆抗体及建立ENTV-2特异性血清学方法奠定了基础。 展开更多
关键词 山羊地方性鼻内肿瘤病毒 表面蛋白 原核表达 多克隆抗体
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山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列分析及其gag基因促肿瘤发生的机制研究 被引量:2
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作者 潘启东 曾显成 +3 位作者 杨彬偲 刘庆华 徐泉明 陈吉龙 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期3165-3174,共10页
本研究旨在获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus 2,ENTV-2)全基因组序列并进行分析。从福建某羊场的山羊鼻内肿瘤组织取样,针对ENTV-2设计引物,通过RT-PCR方法从肿瘤组织中分段扩增出6个特异性产物,测序后利用生物... 本研究旨在获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus 2,ENTV-2)全基因组序列并进行分析。从福建某羊场的山羊鼻内肿瘤组织取样,针对ENTV-2设计引物,通过RT-PCR方法从肿瘤组织中分段扩增出6个特异性产物,测序后利用生物学软件DNAStar进行拼接,获得长度为7443 bp全基因组序列,将其命名为ENTV-2-FJ。ENTV-2-FJ基因组结构与其他逆转录病毒类似,具有5′-U5-gag-pro-pol-env-U3-3′典型结构,包含4个开放阅读框和侧翼非编码区以及末端重复序列。为制备兔抗ENTV-2 gag蛋白多克隆抗体,将特异性扩增的gag基因克隆至pET-21a(+)载体,构建重组质粒pET-21a-gag,鉴定后转化至BL21(DE3)细胞并经IPTG诱导成功表达分子量约为70 ku的融合蛋白。Western blot分析表明,制备的兔抗gag蛋白抗体能在患病山羊肿瘤组织和表达gag基因的细胞中特异性地检测出gag蛋白。为了深入研究ENTV-2-FJ致瘤机制,作者构建了过表达gag基因的K562细胞系,并进行裸鼠致瘤试验。结果显示,gag蛋白通过激活JAK2-STAT5信号通路促进肿瘤的生长。综上,本研究获得了ENTV-2-FJ全基因组序列并对其进行分析,制备并验证了gag蛋白的多克隆抗体,揭示了gag蛋白的作用机制,这些结果为阐明ENTV-2的致病机制提供了科学依据。 展开更多
关键词 山羊地方性鼻内肿瘤病毒 全基因组序列 GAG 多克隆抗体制备 致病研究
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山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量:1
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作者 张靖鹏 江锦秀 +5 位作者 林裕胜 游伟 刘道泉 毛坤明 江斌 胡奇林 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期779-784,共6页
【目的】建立一种快速、敏感的ENTV-2检测方法,用于ENT的早期诊断与流行病学调查。【方法】通过生物信息学的方法将ENTV-2与ENTV-1、ERVs、JSRV进行比对,寻找ENTV-2的保守序列并设计1对特异性引物,建立SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测... 【目的】建立一种快速、敏感的ENTV-2检测方法,用于ENT的早期诊断与流行病学调查。【方法】通过生物信息学的方法将ENTV-2与ENTV-1、ERVs、JSRV进行比对,寻找ENTV-2的保守序列并设计1对特异性引物,建立SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的PCR反应条件进行优化,将PCR扩增产物连接T载体构建的阳性质粒作为标准品,对SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】建立的检测ENTV-2 qPCR方法标准曲线呈现良好的线性关系(R^(2)=0.992);该方法的特异性良好,对ENTV-2可以产生特异性扩增曲线,与ENTV-2高度同源的ERVs没有交叉反应,也无法扩增羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)等常见病原;敏感性良好,最低检测限度为7.5×10^(2) copies·μL^(-1),敏感性可达常规PCR检测方法的100倍;批内、批间的变异系数CV<1%,重复性良好;对81份临床样品的阳性检出率为17.3%。【结论】建立的SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法特异性良好,敏感性较高,重复性良好,为山羊地方性鼻内肿瘤的早期、快速检测提供了技术支持。 展开更多
关键词 山羊地方性鼻内肿瘤病毒 SYBR-GreenⅠ 荧光定量PCR
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福建省福清市山羊地方性鼻内肿瘤病毒2型感染流行病学调查 被引量:3
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作者 张靖鹏 陈芹 +12 位作者 刘维巍 陈勇 江锦秀 吴丹 林裕胜 方玉琴 郑晓何 黄守愚 杨陈文 林秀敏 林银娇 胡奇林 毛坤明 《中国动物检疫》 CAS 2023年第6期25-30,共6页
为了解福建省福清市山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)流行及遗传变异情况,通过Taq Man qPCR检测方法,对998份山羊鼻拭子样品进行ENTV-2核酸检测,并对阳性样品SU蛋白编码基因进行遗传进化分析。结果显示:在福清市16个镇街40个山羊养殖场户... 为了解福建省福清市山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)流行及遗传变异情况,通过Taq Man qPCR检测方法,对998份山羊鼻拭子样品进行ENTV-2核酸检测,并对阳性样品SU蛋白编码基因进行遗传进化分析。结果显示:在福清市16个镇街40个山羊养殖场户中,共检测出19个阳性场户、89份阳性样品,场阳性率为47.50%,个体阳性率为8.92%;9份阳性样品的SU蛋白编码基因均与ENTV-2位于同一进化分支,其中2份阳性样品处于相对独立的分支,与ENTV-2流行株同源性约为96%,且各有5处氨基酸突变,其他阳性样品与ENTV-2流行株同源性在99%以上,氨基酸序列一致。结果表明,ENTV-2在福清市流行较为广泛,流行毒株出现了一定的变异,需要持续加强监测,采取综合措施控制该病流行。本研究有助于了解和掌握ENTV-2在山羊群中的感染情况和遗传变异特征,为提高该病防治效果奠定了基础。 展开更多
关键词 山羊地方性鼻内肿瘤病毒2型 流行病学 福清 qPCR
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云南省江城县山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测及序列分析 被引量:3
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作者 张娜西 孟锦昕 +6 位作者 李钊 何于雯 王德琼 李楠 孙建美 白方 王静林 《中国动物检疫》 CAS 2022年第6期48-52,共5页
为了解云南省山羊群中的地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus,ENTV)感染情况,2017年在云南省南部边境地区江城县采集山羊血分离血浆,采用随机PCR(random PCR)进行扩增、克隆,结果从20份血浆中获得与ENTV 2型(ENTV-2)同源性... 为了解云南省山羊群中的地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus,ENTV)感染情况,2017年在云南省南部边境地区江城县采集山羊血分离血浆,采用随机PCR(random PCR)进行扩增、克隆,结果从20份血浆中获得与ENTV 2型(ENTV-2)同源性较高的2条序列;根据ENTV-2 CHN1(KU258870)毒株序列设计一套半巢式引物,对采集的20份血浆进行核酸检测,结果4份为阳性。序列分析发现,检测到的4条序列与四川、福建等地流行的ENTV-2位于同一个进化分支,它们之间的核苷酸同源性为96.3%~99.5%,氨基酸同源性为95.3%~99.0%,提示江城县羊群中流行的ENV-2可能与四川省、福建省流行毒株相关;位点分析结果显示,江城县的这4份ENTV-2核酸阳性样品在env蛋白186和204位发生了独特的“G→E”氨基酸位点突变,其中1份在178位还发生了“T→P”的氨基酸位点突变。结果表明,江城县山羊群中存在ENTV-2感染,且流行的ENTV-2呈现一些特有的分子特征。因此,云南省需要加强ENTV监测,了解其在山羊群中的流行情况及其演变规律。本研究为进一步开展ENTV感染调查和山羊呼吸道疾病的诊断和预防提供了依据。 展开更多
关键词 地方性鼻内肿瘤病毒 山羊 ENV基因 序列分析
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山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量:1
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作者 黎家明 郑烁东 +5 位作者 罗世诚 张浩权 颜广智 陈盛楠 刘明杰 黄良宗 《广东畜牧兽医科技》 2023年第1期24-28,62,共6页
为建立山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2)快速检测方法,根据ENTV-2 env基因保守区域设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床... 为建立山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2)快速检测方法,根据ENTV-2 env基因保守区域设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,该方法建立的标准曲线在重组质粒浓度为1.019×10^(9)—1.019×10^(2)copies/μL时,相关系数R^(2)为0.998,Ct值和重组质粒浓度有良好的线性关系;与相关的其他5种羊常见病原无交叉反应,最低检测限度为10.19 copies/μL,组间和组内的变异系数均在1.5%内。利用本研究建立的方法与常规RT-PCR对20份临床样品进行对比检测,两种方法的ENTV-2阳性检出率分别为60%(12/20)和30%(6/20),两种方法的总符合率为70%(14/20)。结果表明,本研究建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为ENTV-2的诊断和流行病学调查提供技术手段。 展开更多
关键词 山羊地方性鼻内肿瘤病毒 TAQMAN 荧光定量RT-PCR
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山羊地方性鼻内腺瘤病毒和内源性逆转录病毒gag变异区的克隆与分析 被引量:5
11
作者 王小玉 冯迎春 +5 位作者 颜其贵 张国俊 陈瑜 韩国全 任玉鹏 郭万柱 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第1期29-32,共4页
根据病毒gag变异区的两端设计引物,PCR扩增ENTV及ERVs的gag变异区,TA克隆并测序,经比对分析发现,在ERVs的783位~803位的"CCT"重复序列,编码多聚脯氨酸"PPPPPPP",对应在ENTV gag中存在缺失突变和点突变,编码氨基酸为"PSL",生物信... 根据病毒gag变异区的两端设计引物,PCR扩增ENTV及ERVs的gag变异区,TA克隆并测序,经比对分析发现,在ERVs的783位~803位的"CCT"重复序列,编码多聚脯氨酸"PPPPPPP",对应在ENTV gag中存在缺失突变和点突变,编码氨基酸为"PSL",生物信息学预测该区域的变异位于一个重要的抗原决定簇中,对gag在ENTV和ERVs中的功能有较大影响,为进一步研究gag的抗原性及相关免疫学检测方法的建立奠定基础。 展开更多
关键词 山羊 鼻内肿瘤 山羊地方性鼻内肿瘤病毒 羊源内源逆转录病毒 GAG
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一起山羊地方性鼻内肿瘤的诊断 被引量:4
12
作者 王景 周曼 +2 位作者 何亚鹏 付明哲 许信刚 《动物医学进展》 北大核心 2017年第2期129-132,共4页
陕西省某山羊养殖场发生一起山羊鼻内肿瘤病,通过流行病学和临床症状调查、病理剖检、病理切片检查进行初步诊断。其次根据GenBank收录的山羊地方性鼻内肿瘤病毒基因组序列设计1对特异性引物,通过PCR方法从肿瘤组织中扩增获得目的片段... 陕西省某山羊养殖场发生一起山羊鼻内肿瘤病,通过流行病学和临床症状调查、病理剖检、病理切片检查进行初步诊断。其次根据GenBank收录的山羊地方性鼻内肿瘤病毒基因组序列设计1对特异性引物,通过PCR方法从肿瘤组织中扩增获得目的片段并测序。序列比对分析表明,该目的基因和山羊地方性鼻内肿瘤病毒高度相似,最终确定该病为山羊地方性鼻内肿瘤病毒引起的山羊地方性鼻内肿瘤(ENT)。 展开更多
关键词 山羊 地方性鼻内肿瘤病毒 病理变化 序列分析
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山羊和绵羊地方性鼻内腺癌研究进展 被引量:13
13
作者 张国俊 冯迎春 +2 位作者 颜其贵 郭万柱 王小玉 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第11期101-104,共4页
羊地方性鼻内腺癌(ENA)起源于鼻黏膜腺体,是由逆转录病毒ENTV引起的一种接触传染性肿瘤,主要发生于青年及成年山羊和绵羊。临床特征主要表现为持续性鼻漏、呼吸困难、头骨变形。论文重点论述了该病的病原,并结合ENTV的免疫学特性对该病... 羊地方性鼻内腺癌(ENA)起源于鼻黏膜腺体,是由逆转录病毒ENTV引起的一种接触传染性肿瘤,主要发生于青年及成年山羊和绵羊。临床特征主要表现为持续性鼻漏、呼吸困难、头骨变形。论文重点论述了该病的病原,并结合ENTV的免疫学特性对该病的诊断与防控方法进行了比较,以期为该病的预防及早期诊断提供参考资料。 展开更多
关键词 地方鼻内腺癌 地方性鼻内肿瘤病毒 逆转录病毒
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羊地方性鼻内腺瘤的研究进展 被引量:2
14
作者 陈静 《草学》 2020年第4期62-65,共4页
羊地方性鼻腺瘤(ENA)是绵羊和山羊的病毒性传染疾病,其特征在于鼻腔中的筛骨黏膜的肿瘤生长,已对羊养殖业造成严重的经济损失。为了对该病有更深入、全面的了解,本文主要从病原学、流行病学、临床症状和病理变化、诊断技术以及防治等方... 羊地方性鼻腺瘤(ENA)是绵羊和山羊的病毒性传染疾病,其特征在于鼻腔中的筛骨黏膜的肿瘤生长,已对羊养殖业造成严重的经济损失。为了对该病有更深入、全面的了解,本文主要从病原学、流行病学、临床症状和病理变化、诊断技术以及防治等方面对羊地方性鼻内腺瘤进行了综述。 展开更多
关键词 地方性鼻内肿瘤病毒 地方鼻内腺瘤
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