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地中海拟无枝酸菌原生质体电融合及其在提高利福霉素SV发酵效价中的应用 被引量:3
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作者 郑璞 王蕾 史朝辉 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期267-269,279,共4页
对产利福霉素SV的地中海拟无枝酸菌 (Amycolatopsismediterranei)原生质体进行热灭活和紫外灭活标记 ,其热灭活条件为 5 2℃ ,1.5h ,紫外灭活条件为紫外线照射 ( 15W ,2 5cm ,2 70nm) 6 0min。将双灭活标记的原生质体用CRY 3型细胞融合... 对产利福霉素SV的地中海拟无枝酸菌 (Amycolatopsismediterranei)原生质体进行热灭活和紫外灭活标记 ,其热灭活条件为 5 2℃ ,1.5h ,紫外灭活条件为紫外线照射 ( 15W ,2 5cm ,2 70nm) 6 0min。将双灭活标记的原生质体用CRY 3型细胞融合仪进行电融合 ,得出 :成串电流频率 1.5MHz ,电压 5 8V ,成串时间 2 0s ,融合脉冲幅宽 80 μS ,融合电压 5 0 0V ,融合槽间距 0 .5mm时 ,融合率最高为 9.3× 10 -4 。对筛选的融合子产量试验表明 ,5 0 %以上的融合子产量高于出发菌株 ,有明显的正变作用 ,将融合子在利福霉素代谢类似物平板上分离纯化 ,获得了化学效价提高 30 %以上的产量稳定菌株。 展开更多
关键词 热灭活 紫外灭活 原生质体电融合 利福霉素SV 地中海拟无枝酸菌
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产利福霉素地中海拟无枝酸菌的电转化条件优化 被引量:4
2
作者 樊菲 成文玉 金红星 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期575-578,共4页
目的 为了获得较高的地中海拟无枝酸菌的转化率,进行了电转化条件的优化。方法 以大肠埃希菌.拟无枝酸菌穿梭质粒pULVKl-Am为载体,地中海拟无枝酸菌为受体菌,考察了收集菌体时期、细胞壁弱化方式、电击缓冲液和电击参数等因素对... 目的 为了获得较高的地中海拟无枝酸菌的转化率,进行了电转化条件的优化。方法 以大肠埃希菌.拟无枝酸菌穿梭质粒pULVKl-Am为载体,地中海拟无枝酸菌为受体菌,考察了收集菌体时期、细胞壁弱化方式、电击缓冲液和电击参数等因素对转化率的影响。结果 以0.1gg/mL氨苄西林处理细胞,A600为0.7~0.8时收集菌体,用溶菌酶.LiAc-DTT溶液于37℃孵育30min,去离子水作电击缓冲液,7.5kV/cm、25gF、750W下进行电击,转化率最高可达到9.23×104CFU/μg质粒DNA。结论只有将不同机制的3种细胞壁弱化剂组合起来对拟无枝酸菌进行处理时,才能得到较高的转化率。 展开更多
关键词 地中海拟无枝酸菌 利福霉素 电转化 转化率
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锌离子影响地中海拟无枝酸菌合成有机酸和利福霉素SV 被引量:1
3
作者 邓鹏飞 周峰 +3 位作者 李长军 陈雄 黄亚男 王志 《中国酿造》 CAS 2013年第8期84-87,共4页
在10L发酵罐培养地中海拟无枝酸菌过程中基料添加Zn2+(终浓度0.75mg/L)对利福霉素SV效价和有机酸合成产生了显著影响。72h^141h胞外丙酮酸、丙氨酸浓度分别比对照提高了19.7%~93.72%和降低了37.69%~59.55%;同时,胞外谷氨酸、赖氨酸和苯... 在10L发酵罐培养地中海拟无枝酸菌过程中基料添加Zn2+(终浓度0.75mg/L)对利福霉素SV效价和有机酸合成产生了显著影响。72h^141h胞外丙酮酸、丙氨酸浓度分别比对照提高了19.7%~93.72%和降低了37.69%~59.55%;同时,胞外谷氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸的浓度分别比对照提高了7.62%~162.59%、1.99%~43.10%和25.84%~92.89%。胞外酪氨酸浓度(72h^120h)与对照差异不大,之后迅速提高,141h时酪氨酸浓度是对照组的2.56倍。利福霉素SV的效价在96h比对照提高了11.72%,120h时效价提高了9.1%;141h时效价仅比对照提高了3.5%。说明锌离子抑制了丙氨酸脱氢酶活性并引起丙酮酸积累,这使得丙酮酸流入三羧酸循环的碳通量增大,使由草酰乙酸衍生的赖氨酸和由α-酮戊二酸衍生的谷氨酸合成量增大,促进了利福霉素SV的合成。但是,丙酮酸的积累也促进了芳环氨基酸的合成(如酪氨酸、苯丙氨酸),其会协同抑制利福霉素的芳环前体3-氨基-5-羟基-苯甲酸的合成,这可能是效价中后期增长放缓的原因。 展开更多
关键词 地中海拟无枝酸菌 利福霉素SV 锌离子 氨基 生物合成
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S-丙二酰转移酶基因失活对地中海拟无枝酸菌产利福霉素的影响 被引量:1
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作者 何思雨 成文玉 金红星 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期174-179,共6页
为提高利福霉素的产量,构建了S-丙二酰转移酶基因失活的地中海拟无枝酸菌。利用融合PCR构建S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,通过电击转化导入到地中海拟无枝酸菌中,使之发生同源重组,以安普霉素为标记,筛选了S-丙二酰转移酶基因失活... 为提高利福霉素的产量,构建了S-丙二酰转移酶基因失活的地中海拟无枝酸菌。利用融合PCR构建S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,通过电击转化导入到地中海拟无枝酸菌中,使之发生同源重组,以安普霉素为标记,筛选了S-丙二酰转移酶基因失活菌株,并对比了突变菌株与原始菌株的利福霉素SV产量。成功构建了S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,获得了地中海拟无枝酸菌突变株A.mediterranei △fab D,失活菌株的利福霉素SV产量为168.08 mg/L,比原始菌提高了9.94%。S-丙二酰转移酶基因的失活,弱化了突变菌株脂肪酸的合成,强化了利福霉素的合成。 展开更多
关键词 地中海拟无枝酸菌 利福霉素 S-丙二酰转移酶 融合PCR 基因失活
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地中海拟无枝酸菌S699电转化方法的优化 被引量:2
5
作者 王明艳 何璟 《湖北农业科学》 北大核心 2014年第4期920-924,共5页
地中海拟无枝酸菌S699(Amycolatopsis mediterranei S699)能够产生具有重要经济价值的抗生素———利福霉素B。在该菌株中建立高效的遗传操作系统是研究利福霉素生物合成机制以及构建基因工程高产菌株的基础。研究利用单因素试验探索了... 地中海拟无枝酸菌S699(Amycolatopsis mediterranei S699)能够产生具有重要经济价值的抗生素———利福霉素B。在该菌株中建立高效的遗传操作系统是研究利福霉素生物合成机制以及构建基因工程高产菌株的基础。研究利用单因素试验探索了供体质粒的构型、甘氨酸溶度、MgCl2浓度及电转化参数对地中海拟无枝酸菌S699电转化效率的影响。结果表明,使用添加了0.05 g/L甘氨酸和2.5 mmol/L MgCl2的34%YEME培养基培养菌丝体,在9 kV/cm、25μF、550Ω的电转化条件下,以双链DNA为供体,转化效率最高可达到3.37×102个转化子/μg DNA。利用优化后的电转化方法,成功地获得了利福霉素生物合成基因簇中细胞色素P450氧化酶基因orf5的同源缺失突变菌株,证实了优化后的电转化方法可以很好地用于后期遗传学及利福霉素生物合成基因的研究。 展开更多
关键词 地中海拟无枝酸菌S699(Amycolatopsis MEDITERRANEI S699) 利福霉素B 电转化 同源缺失
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筛选地中海拟无枝酸菌无痕基因敲除菌株的简便方法
6
作者 张巧巧 金哲男 金红星 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2018年第4期25-33,共9页
将抗生素抗性基因作为标记筛选无痕基因敲除菌株比较费时,因而建立筛选无痕基因敲除菌株的简便方法。通过敲除茄红素生物合成途径中第一个反应的酶编码基因dxs(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因),获得白色地中海拟无枝酸菌突变菌株,以此... 将抗生素抗性基因作为标记筛选无痕基因敲除菌株比较费时,因而建立筛选无痕基因敲除菌株的简便方法。通过敲除茄红素生物合成途径中第一个反应的酶编码基因dxs(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因),获得白色地中海拟无枝酸菌突变菌株,以此菌株为受体菌,对S-丙二酰转移酶基因(mtf)进行无痕敲除。针对菌落本身携带颜色的地中海拟无枝酸菌(橘红色),利用茄红素合成酶基因dxs无痕敲除获得了白色菌株,在此基础上进行mtf的无痕敲除。以茄红素生物合成途径中任意一个反应的酶编码基因作为标记,很容易筛选得到无痕基因敲除的突变菌株。 展开更多
关键词 地中海拟无枝酸菌 利福霉素 茄红素 无痕基因敲除 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷合酶
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Ca^(2+)和Mn^(2+)对地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U-32次生代谢及激酶活性的影响
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作者 邢小黑 姜卫红 +1 位作者 王伟武 黄为一 《南京农业大学学报》 CSCD 北大核心 2000年第1期51-54,共4页
采用Ca2 + 、Mn2 + 和地中海拟无枝菌酸菌U 32共培养的方法 ,通过滤纸法检测抗生素含量和离体磷酸化反应检测激酶活性 ,研究Ca2 + 和Mn2 + 对地中海拟无枝菌酸菌U 32次生代谢的影响。低浓度Ca2 + 和Mn2 + 均能促进地中海拟无枝菌酸菌U 3... 采用Ca2 + 、Mn2 + 和地中海拟无枝菌酸菌U 32共培养的方法 ,通过滤纸法检测抗生素含量和离体磷酸化反应检测激酶活性 ,研究Ca2 + 和Mn2 + 对地中海拟无枝菌酸菌U 32次生代谢的影响。低浓度Ca2 + 和Mn2 + 均能促进地中海拟无枝菌酸菌U 32的生长 ;随着离子浓度增高 ,促生长效果下降 ;浓度太高 ,则表现为抑制作用。 5mmol/LCa2 + 对地中海拟无枝菌酸菌U 32的色素绝对产量增加效果最好 ,而对其相对于菌体的色素量则以 5mmol/LMn2 + 的效果最好。 0 5mmol/LCa2 + 对地中海拟无枝菌酸菌U 32的抗生素合成有很好的作用 ,而Mn2 + 有一定的抑制作用。对地中海拟无枝菌酸菌U 32的无细胞提取液进行离体磷酸化反应检测 ,发现Ca2 + 能促进其激酶的活性 ,而Mn2 + 则相对抑制了某些激酶活性。 展开更多
关键词 CA^2+ MN^2+ 蛋白激酶 地中海拟无
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利福霉素高产菌株快速筛选方法的建立及应用
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作者 杜吉泉 王军峰 +3 位作者 储炬 王永红 庄英萍 张嗣良 《华东理工大学学报(自然科学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2006年第12期1400-1403,1408,共5页
利福霉素发酵过程中pH变化规律能够反映菌体对不同营养物质的利用情况及菌体生理特性的变化,并与最终放瓶效价有一定的关联。据此建立了一种以发酵前期(±50 h)pH变化为判断依据的新的快速筛选菌种的方法,即发酵前期pH下降到谷底较... 利福霉素发酵过程中pH变化规律能够反映菌体对不同营养物质的利用情况及菌体生理特性的变化,并与最终放瓶效价有一定的关联。据此建立了一种以发酵前期(±50 h)pH变化为判断依据的新的快速筛选菌种的方法,即发酵前期pH下降到谷底较早的菌株高产的可能性很大(概率接近70%),并在双亲株灭活种间融合法选育利福霉素SV菌株中进行了应用,筛选到了高产融合菌株F-3及F-16,两菌株分别比出发菌株效价提高了11%和17%。同时,得到了两个亲株(利福霉素SV产生菌U-32、利福霉素B产生菌X#-1)的酶解条件(U-32:10 m g/mL、34°C、2 h;X#-1:10 m g/mL、34°C、3 h)及原生质体双灭活标记条件(U-32:UV 20 m in;X#-1:60°C、50 m in),双灭活原生质体用500 g/L PEG融合,融合频率约1.04×10-5。 展开更多
关键词 地中海拟无枝酸菌 利福霉素SV pH检测控制 种快速筛选 双亲株灭活 原生 质体融合
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利福霉素B发酵工艺研究 被引量:2
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作者 孟根水 孙新强 +2 位作者 金一平 裘娟萍 金志华 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期137-140,共4页
研究温度、溶氧、巴比妥、磷酸盐及补料方式对利福霉素B发酵的影响。结果表明在控制培养温度 2 7℃、溶氧 2 5 %以上的条件下 ,采用流加补料工艺 ,利福霉素B的发酵效价较原工艺有明显提高 ,此工艺已在 60m3 发酵罐中进行工业化生产 ,发... 研究温度、溶氧、巴比妥、磷酸盐及补料方式对利福霉素B发酵的影响。结果表明在控制培养温度 2 7℃、溶氧 2 5 %以上的条件下 ,采用流加补料工艺 ,利福霉素B的发酵效价较原工艺有明显提高 ,此工艺已在 60m3 发酵罐中进行工业化生产 ,发酵效价比原生产工艺提高了一倍以上。 展开更多
关键词 利福霉素B 发酵工艺 温度 溶氧 巴比妥 补料方式 地中海拟无枝酸菌 安莎类抗生素
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