TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌 被引量：3

1

作者 赵素慧 王春晖 +6 位作者 周莹 韦耀 韩桂圆 钮红岺 赵卫 张其威 万成松 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期602-606,共5页

目的建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制... 目的建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性。结果构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103～107拷贝数之间有较好的线性关系。灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88%。结论本研究建立了TaqMan探针QF-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法。 展开更多

关键词 土拉弗朗西斯菌 TAQMAN探针 fopA基因 荧光定量PCR

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肌动蛋白结合脂筏促进巨噬细胞摄入土拉弗朗西斯菌 被引量：2

2

作者 潘欣 曾思良 +3 位作者 蔡家麟 吴鉴今 杨光 黄通来 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2011年第4期31-35,共5页

观察土拉弗朗西斯菌LVS借助脂筏以肌动蛋白为动力被鼠巨噬细胞摄入的过程。细胞胆固醇用菲律平Ⅲ染色,结合神经节苷酯GM1的霍乱毒素B亚基用键合了Alexa 594的兔抗霍乱毒素B亚基二抗显色;肌动蛋白用键合了Alexa 594的鬼笔环肽显色。免疫... 观察土拉弗朗西斯菌LVS借助脂筏以肌动蛋白为动力被鼠巨噬细胞摄入的过程。细胞胆固醇用菲律平Ⅲ染色,结合神经节苷酯GM1的霍乱毒素B亚基用键合了Alexa 594的兔抗霍乱毒素B亚基二抗显色;肌动蛋白用键合了Alexa 594的鬼笔环肽显色。免疫荧光显微镜观察到脂筏成分中的胆固醇、神经节苷酯GM1均可与细菌共定位;胆固醇可与肌动蛋白共定位。随着感染时间的延长,细菌可离开脂筏。离开脂筏的细菌囊泡可与肌动蛋白共定位。这些发现提示肌动蛋白与脂筏结合,在弗朗西斯菌早期进入巨噬细胞期间发挥重要作用。 展开更多

关键词 巨噬细胞 土拉弗朗西斯菌 脂筏 胆固醇 肌动蛋白

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土拉弗朗西斯菌与巨噬细胞膜的早期相互作用 被引量：2

3

作者 潘欣 祁建城 +1 位作者 李广波 贾文凯 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2009年第2期1-5,共5页

评估土拉弗朗西斯菌LVS在感染鼠巨噬细胞早期与细胞膜的相互作用。用表达GFP的土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞J774A.1。结合单抗的小窝蛋白-1或转铁蛋白受体-1分别用键合了Alexa594的羊抗鼠二抗显色。土拉弗朗西斯菌疫苗株LVS可以诱... 评估土拉弗朗西斯菌LVS在感染鼠巨噬细胞早期与细胞膜的相互作用。用表达GFP的土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞J774A.1。结合单抗的小窝蛋白-1或转铁蛋白受体-1分别用键合了Alexa594的羊抗鼠二抗显色。土拉弗朗西斯菌疫苗株LVS可以诱导宿主细胞膜伸出伪足,将细菌吸收进入巨噬细胞。分布在细胞膜上的小窝蛋白-1和转铁蛋白受体-1参与巨噬细胞对弗朗西斯菌的摄入。这些发现说明,弗朗西斯菌进入巨噬细胞需要细胞膜微结构域和小窝蛋白;在感染早期转铁蛋白受体-1参与了细菌的摄入,这可能与弗朗西斯菌获取铁以利在胞内生存有关。 展开更多

关键词 巨噬细胞 土拉弗朗西斯菌 微膜结构域 小窝蛋白-1 转铁蛋白受体-1

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转铁蛋白受体在土拉弗朗西斯菌LVS入侵巨噬细胞期间的作用

4

作者 潘欣 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第S1期376-379,383,共5页

评估转铁蛋白受体-1在土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞期间的作用。用表达GFP的土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞J774A.1。结合单抗的转铁蛋白受体-1分别用键合了Alexa594的羊抗鼠二抗显色,用小干扰RNA下调转铁蛋白受体-1的表达,进而... 评估转铁蛋白受体-1在土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞期间的作用。用表达GFP的土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞J774A.1。结合单抗的转铁蛋白受体-1分别用键合了Alexa594的羊抗鼠二抗显色,用小干扰RNA下调转铁蛋白受体-1的表达,进而用土拉弗朗西斯菌LVS分别感染转铁蛋白受体-1表达下调的细胞和转染无关siRNA的细胞,并进行细菌计数。分布在细胞膜上的转铁蛋白受体-1参与巨噬细胞对弗朗西斯菌的摄入。免疫印迹结果表明小干扰RNA对转铁蛋白受体-1的表达下调了大约75%。细菌入侵试验显示,在感染1 h时,转铁蛋白受体-1表达下调的细胞内细菌数量等同于对照(F=1.06,P=0.3265);而在感染24 h时,Tfr1下调样本中的细菌数量明显低于对照样本(F=24.12,P=0.0006)。这些发现说明在感染早期转铁蛋白受体-1参与了细菌的摄入,这可能与弗朗西斯菌获取铁以利在胞内生存有关。转铁蛋白受体-1的下调不影响细菌的入侵,但抑制细菌在细胞内的增殖。 展开更多

关键词 巨噬细胞 土拉弗朗西斯菌 铁蛋白受体-1 小干扰RNA

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FTN0109蛋白对土拉弗朗西斯菌致病力的影响 被引量：1

5

作者 崔国林 李冰心 +3 位作者 张寒琪 王俊 戚心怡 苏敬良 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期337-345,共9页

土拉弗朗西斯菌是一种重要的人畜共患性病原菌,目前对该菌的毒力因子及分子致病机制尚不完全清楚。本研究旨在分析未知功能蛋白FTN0109在土拉弗朗西斯菌中的分布,探讨其对细菌致病力的影响。通过生物信息学软件预测FTN0109的生物学功能... 土拉弗朗西斯菌是一种重要的人畜共患性病原菌,目前对该菌的毒力因子及分子致病机制尚不完全清楚。本研究旨在分析未知功能蛋白FTN0109在土拉弗朗西斯菌中的分布,探讨其对细菌致病力的影响。通过生物信息学软件预测FTN0109的生物学功能,并利用超速离心法检测其亚细胞定位;利用同源重组技术构建FTN0109基因缺失株及其反式回补株,分析其对三种来源小鼠巨噬细胞的入侵和细胞内增殖能力,并检测其对BALB/c小鼠的致病力和在其体内的繁殖动态。结果显示,FTN0109蛋白被预测为一种脂蛋白,主要分布于土拉弗朗西斯菌的内膜;与野毒株相比,FTN0109缺失株在小鼠巨噬细胞中不能增殖,对BALB/c小鼠的LD50提高104以上,在感染小鼠肝和脾中的载量呈不断下降趋势且均显著低于野毒株(P<0.05)。结果提示,FTN0109是一种内膜脂蛋白,它的缺失可严重降低土拉弗朗西斯菌在小鼠巨噬细胞和体内的生存能力,降低其对小鼠的致病力。 展开更多

关键词 土拉弗朗西斯菌 内膜蛋白 致病力 FTN0109

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质膜微区对土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞的影响(英文) 被引量：2

6

作者 潘欣 祁建城 +3 位作者 李广波 贾文凯 瞿旻 赵子夜 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期833-837,共5页

目的评估土拉弗朗西斯菌LVS入侵鼠巨噬细胞过程中质膜微区的作用。方法用电穿孔法将穿梭质粒pFNLTP6 gro-gfp导入土拉弗朗西斯菌LVS。细胞膜用FM4-64染色,结合单抗的微囊蛋白-1用键合了Alexa594荧光素的羊抗鼠二抗显色。用Z轴电动聚焦... 目的评估土拉弗朗西斯菌LVS入侵鼠巨噬细胞过程中质膜微区的作用。方法用电穿孔法将穿梭质粒pFNLTP6 gro-gfp导入土拉弗朗西斯菌LVS。细胞膜用FM4-64染色,结合单抗的微囊蛋白-1用键合了Alexa594荧光素的羊抗鼠二抗显色。用Z轴电动聚焦的荧光显微镜分析土拉弗朗西斯菌LVS感染。用甲基-β-环式糊精干扰富含脂质的胞膜损耗胆固醇,以评估质膜微区的损伤对弗朗西斯菌入侵的影响。菲律平Ⅲ用以检测胆固醇损耗的效果。结果土拉弗朗西斯菌疫苗株可以诱导膜结构域伸出伪足将细菌吸收进入巨噬细胞。质膜微区相关成分微囊蛋白-1与含有弗朗西斯菌的囊泡一同进入宿主。弗朗西斯菌入侵巨噬细胞需要胆固醇丰富的膜结构域。结论胆固醇丰富的质膜微区和微囊蛋白-1在弗朗西斯菌早期进入巨噬细胞期间发挥重要作用。 展开更多

关键词 巨噬细胞 土拉弗朗西斯菌 质膜微区 微囊蛋白-1 胆固醇

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土拉弗朗西斯菌FopA单抗阻断ELISA抗体检测方法的建立 被引量：1

7

作者 崔国林 戚心怡 +4 位作者 吴村 蔡梦雷 张政钢 赵东旭 翟新国 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期850-856,共7页

目的建立一种基于FopA单抗的阻断ELISA抗体检测方法。方法以pET-32a为载体表达土拉弗朗西斯菌的FopA蛋白,并以其免疫BALB/c小鼠制备单抗,以LVS超声裂解液为包被抗原、HRP标记FopA单抗为阻断抗体,建立直接阻断ELISA方法,利用阴性血清平均... 目的建立一种基于FopA单抗的阻断ELISA抗体检测方法。方法以pET-32a为载体表达土拉弗朗西斯菌的FopA蛋白,并以其免疫BALB/c小鼠制备单抗,以LVS超声裂解液为包被抗原、HRP标记FopA单抗为阻断抗体,建立直接阻断ELISA方法,利用阴性血清平均值+2SD或3SD确定该方法临界值,测定该方法特异性、敏感性、重复性及其与平板凝集试验的符合率,并利用该方法检测攻毒小鼠血清抗体变化趋势。结果筛选获得1株稳定分泌IgG1(κ型)单抗的杂交瘤细胞,并基于该单抗建立阻断ELISA方法,包被抗原最优浓度为3μg/mL、HRP标记FopA单抗最优稀释度为1∶4000、待检血清最优稀释度为1∶10,阴性临界值为27%、阳性临界值为41%、可疑区间为27%~41%,该方法的特异性、敏感性、重复性和符合率均良好,可检出攻毒9 d后小鼠血清抗体。结论成功制备FopA单抗,并基于该单抗建立一种快速、准确和高通量抗体检测的阻断ELISA方法,为我国土拉弗朗西斯菌流调和防控提供技术支撑。 展开更多

关键词 土拉弗朗西斯菌 FopA 阻断ELISA 单抗 原核表达

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土拉弗朗西斯菌致病机制研究进展

8

作者 董译滟 王聪 +2 位作者 任晨洋 文雪霞 张莹 《动物医学进展》 北大核心 2023年第12期108-112,共5页

土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,Ft)是一种可引起人畜共患的胞内病原菌,属于革兰氏阴性菌,具有多形性,无芽孢,无鞭毛,可感染多种类型的细胞。在体内,Ft主要感染巨噬细胞并在其中复制。为了在宿主体内建立有效感染,Ft已进化出多... 土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,Ft)是一种可引起人畜共患的胞内病原菌,属于革兰氏阴性菌,具有多形性,无芽孢,无鞭毛,可感染多种类型的细胞。在体内,Ft主要感染巨噬细胞并在其中复制。为了在宿主体内建立有效感染,Ft已进化出多种策略以拮抗宿主的免疫机制,适应宿主巨噬细胞质的环境并延缓细胞凋亡。这些策略主要包括增强机体对菌体的摄取、菌体从吞噬小体中逃逸、拮抗宿主的氧化防御、抑制宿主的炎症反应和维持菌体自身的稳定等。论文主要从这些方面对Ft的致病机制研究进展进行综述,以期为该病原的研究提供参考。 展开更多

关键词 土拉弗朗西斯菌 病原特征 致病机制

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土拉菌单克隆抗体的制备及其特性的研究 被引量：6

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作者 端青 赵忠利 +1 位作者 田青 张国珍 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2000年第2期3-4,共2页

用土拉弗朗西斯菌疫苗株作为抗原获得了2株单克隆抗体Ftg和Ft44，其抗体亚类分别为IgC2b和IgM，Ft9单抗识别的抗原位点是土拉菌的外膜蛋白，Ft44识别的是脂多糖。2株单抗均可在酶联免疫吸附试验中检出土拉菌，Ft9单抗还可在凝集和免疫... 用土拉弗朗西斯菌疫苗株作为抗原获得了2株单克隆抗体Ftg和Ft44，其抗体亚类分别为IgC2b和IgM，Ft9单抗识别的抗原位点是土拉菌的外膜蛋白，Ft44识别的是脂多糖。2株单抗均可在酶联免疫吸附试验中检出土拉菌，Ft9单抗还可在凝集和免疫荧光试验中与土拉菌发生特异性反应，并不与相关细菌交叉。 展开更多

关键词 土拉弗朗西斯菌 单克隆抗体 抗体亚类

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土拉菌的实验室检测及分析技术研究进展 被引量：3

10

作者 朱晓宇 海荣 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期684-688,704,共6页

关键词 土拉菌病 实验室检测 土拉弗朗西斯菌 淋巴结肿大 自然疫源地 北半球

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转铁蛋白受体1表达在弗朗西斯菌入侵巨噬细胞中的作用(英文) 被引量：1

11

作者 潘欣 祁建城 +3 位作者 李广波 贾文凯 赵子夜 瞿旻 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期932-935,共4页

目的评估土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞期间获取铁的影响因素。方法用表达绿色荧光蛋白(GFP)的土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞J774A.1。结合单抗的转铁蛋白受体-1用键合了Alexa594的羊抗鼠二抗显色。用实时定量PCR法检测5个铁代谢... 目的评估土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞期间获取铁的影响因素。方法用表达绿色荧光蛋白(GFP)的土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞J774A.1。结合单抗的转铁蛋白受体-1用键合了Alexa594的羊抗鼠二抗显色。用实时定量PCR法检测5个铁代谢相关基因在土拉弗朗西斯菌LVS感染或未感染J774A.1鼠巨噬细胞中的表达。用活的弗朗西斯菌和灭活菌分别感染巨噬细胞,免疫印迹分析比较Tfr1表达水平。用小干扰RNA下调转铁蛋白受体-1的表达,进而用土拉弗朗西斯菌LVS分别感染转铁蛋白受体-1表达下调的细胞和转染无关siRNA的细胞,并进行细菌计数。结果土拉弗朗西斯菌疫苗株可以诱导转铁蛋白受体-1在宿主巨噬细胞中表达。基因表达分析显示土拉弗朗西斯菌LVS随着时间的增加通过诱导转铁蛋白受体1(Tfr1)和铁调节蛋白(Irp1和IRP2)主动获取铁。免疫印迹结果表明小干扰RNA对转铁蛋白受体-1的表达下调了大约75%。细菌入侵试验显示,在感染1h时,转铁蛋白受体-1表达下调的细胞内细菌数量等同于对照(F=1.06,P=0.3265);而在感染24h时,Tfr1下调样本中的细菌数量明显低于对照样本(F=24.12,P=0.0006)。结论在感染早期Tfr1的上调是由翻译后调节介导的,并随着Irp1和IRP2表达的增加而增加。Tfr1表达的增加通过转铁蛋白介导的铁运输扩充了细胞内动态铁池,使弗朗西斯菌易于获取铁。转铁蛋白受体-1的下调不影响细菌与其他膜蛋白的结合而入侵,但抑制细菌在细胞内的增殖。 展开更多

关键词 巨噬细胞 土拉弗朗西斯菌 转铁蛋白受体-1 铁代谢

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