四环素诱导性人肝细胞生长因子真核表达载体的构建与鉴定 被引量：1

1

作者 任淑婷 于琳华 +1 位作者 徐长福 高广道 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期1443-1445,共3页

目的构建四环素诱导性人肝细胞生长因子(HGF)真核表达载体。方法运用基因重组技术,将人HGFcDNA全长序列,定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MluI和SalI之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果重组pBI-L-HGF真核表达载... 目的构建四环素诱导性人肝细胞生长因子(HGF)真核表达载体。方法运用基因重组技术,将人HGFcDNA全长序列,定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MluI和SalI之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果重组pBI-L-HGF真核表达载体经限制性内切酶酶切,与理论值相符;测序结果与GenBank比对,序列正确。结论本实验成功构建人HGF四环素诱导性真核表达载体pBI-L-HGF,为今后临床开展HGF基因治疗提供了一种安全可调控的基因治疗策略。 展开更多

关键词 人肝细胞生长因子 四环素诱导性真核表达载体 基因治疗

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重组SEA基因真核表达载体的构建及诱导小鼠抗肝癌免疫的效应 被引量：4

2

作者 杨欣伟 隋延仿 +5 位作者 李增山 曲萍 叶菁 武文 董海龙 张秀敏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期443-446,共4页

目的　构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)真核表达载体 ,并通过体内转染 ,观察其诱导抗小鼠肝癌的免疫效应。方法采用基因工程技术构建SEA基因的真核表达载体 ,使其表达SEA分子。通过阳离子脂质体介导的体内转染 ,观察其对小鼠肝癌的治疗作用。... 目的　构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)真核表达载体 ,并通过体内转染 ,观察其诱导抗小鼠肝癌的免疫效应。方法采用基因工程技术构建SEA基因的真核表达载体 ,使其表达SEA分子。通过阳离子脂质体介导的体内转染 ,观察其对小鼠肝癌的治疗作用。用51 Cr释放法测定治疗组与对照组动物脾淋巴细胞杀伤H2 2 细胞的活性。结果成功地构建了SEA真核表达载体 pLXSN SEA ,体内转染 pLXSN SEA的荷瘤小鼠肿瘤明显缩小 ,生存期延长 ,4 10小鼠肿瘤完全消退 ,且长期无瘤生存。CTL杀伤活性实验表明 ,瘤区内转染pLXSN SEA可诱导强烈的CTL杀伤效应 ,与对照组相比较差异显著 (P <0 .0 1)。结论超抗原SEA体内转染对肿瘤具有明确的治疗作用 。 展开更多

关键词 重组SEA基因真核表达载体 肝癌 超抗原 肝癌 CTL 免疫效应 动物实验

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重组FN多肽真核表达载体pCH510衔接化疗治疗小鼠肿瘤的研究 被引量：8

3

作者 黄波 冯作化 +1 位作者 张桂梅 李东 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2001年第3期168-172,共5页

目的 :研究肿瘤化疗后转染 pCH5 10质粒是否提高疗效 ,以及二者衔接是否需要特定的条件。 方法 :采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型 ;通过基因转染 ,观察 pCH5 10对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH5 1... 目的 :研究肿瘤化疗后转染 pCH5 10质粒是否提高疗效 ,以及二者衔接是否需要特定的条件。 方法 :采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型 ;通过基因转染 ,观察 pCH5 10对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH5 10转染的抑瘤效果 ;采用细胞培养技术 ,观察小鼠体内注射化疗药物后 ,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞激活功能的影响 ;采用细胞计数的方法 ,观察化疗药物所致小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞数量变化的动力学 ;另外小鼠肿瘤化疗后第5天进行pCH5 10转染 ,观察抑瘤效果。结果 :转染pCH5 10对不同接种量形成的小鼠肿瘤生长都有抑制作用 ,并呈负相关。化疗药物可使免疫细胞代谢降低 ,活化受阻 ,在化疗后第 3天免疫细胞数降至最低 ,约 10d左右恢复正常 ;化疗后立即连续 10d转染 pCH5 10质粒 ,疗效没有增强 ;化疗 5d后 ,再连续 15d转染 pCH5 10质粒 ,则疗效明显增强。 结论 :化疗后转染 pCH5 10质粒 ,对小鼠肿瘤治疗效果更好 ,但由于化疗既降低免疫细胞数量 ,又抑制其功能 ,化疗后立即转染pCH5 10质粒是不恰当的 ,并且转染治疗时间不宜过短。pCH5 10、化疗和化疗 +pCH5 10三者对肿瘤不同抑制特点的比较显示化疗具有两面性 ,既抑瘤又促瘤。 展开更多

关键词 pCH510质粒 基因转染 化疗 肿瘤 小鼠 重组FN多肽真核表达载体

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单羧酸转运泵基因反义真核表达载体的构建 被引量：7

4

作者 成党校 钱桂生 黄桂君 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第8期807-809,共3页

目的　构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法　应用RT PCR方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段 ,与带有相同酶切位点的pLXSN逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接 ,构建具有反义表达的逆... 目的　构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法　应用RT PCR方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段 ,与带有相同酶切位点的pLXSN逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接 ,构建具有反义表达的逆转录病毒载体。结果　构建载体进行双酶切电泳分析及插入片段基因序列分析 ,证明反义载体构建成功。结论　应用RT PCR方法扩增插入DNA片段 ,简单、灵活、快捷。双酶切定向连接构建反义表达载体可实现构建一步到位 ,免去正反向筛选的麻烦。 展开更多

关键词 单羧酸转运泵 肿瘤 MCT1基因 反义真核表达载体

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带绿色荧光蛋白标签的人era真核表达载体的构建及人Era对细胞形态和细胞周期的影响 被引量：3

5

作者 纪宗玲 陈苏民 +5 位作者 刘断中 吴元明 张俊杰 路凡 朱帮福 李毅 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第11期1445-1448,U002,共5页

目的 :构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法 :构建带绿色荧光蛋白 (EGFP)标签的人era真核表达载体 ,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果 :无论EGF... 目的 :构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法 :构建带绿色荧光蛋白 (EGFP)标签的人era真核表达载体 ,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果 :无论EGFP融合于人Era的C端或N端 ,融合蛋白均表达于细胞浆接近核膜处 ,细胞形态无明显变化 ,细胞周期检测S期细胞所占百分数降低。结论 :人era可能参与细胞周期调控 ,为阐明人era的功能提供了资料。 展开更多

关键词 基因表达 细胞形态 细胞周期 人era真核表达载体 绿色荧光蛋白 ERA基因

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pCDNA3-AADC真核表达载体的构建及其在原代培养骨骼肌细胞中的表达 被引量：5

6

作者 刘军 肖颂华 +2 位作者 陶恩祥 邢诒刚 梁秀龄 《中国神经精神疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期255-257,I001,共4页

目的 将人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）基因构建于含CMV启动子的真核表达载体pCD-NA3上,并检测其在原代培养骨骼肌细胞中的表达。方法 采用分子克隆技术将经测序证实的人神经元性AADC基因片段同真核表达载体pCDNA3连接,酶切鉴... 目的 将人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）基因构建于含CMV启动子的真核表达载体pCD-NA3上,并检测其在原代培养骨骼肌细胞中的表达。方法 采用分子克隆技术将经测序证实的人神经元性AADC基因片段同真核表达载体pCDNA3连接,酶切鉴定并筛选出正向连接重组体,并采用脂质体转染法将其导入原代培养的骨骼肌细胞,免疫印记检测该基因的表达。结果 酶切证实基因片断正向连接于pCDNA3上,并在原代骨骼肌细胞中获得表达。结论 含人类神经元AADC基因的真核表达重组体可在原代培养的骨骼肌细胞中有效的表达。 展开更多

关键词 pCDNA3-AADC真核表达载体 构建 原代培养 骨骼肌细胞 芳香族氨基酸脱羧酶 免疫印记 帕金森病

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猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达 被引量：3

7

作者 徐彦召 张彦明 +4 位作者 何雷 唐青海 代晨 王静 杨小云 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第5期7-11,共5页

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pS... 【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。 展开更多

关键词 猪瘟病毒囊膜蛋白 猪脐静脉血管内皮细胞 分泌型真核表达载体 真核表达

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ΔCREB真核表达载体的构建及对心肌细胞TNFα含量的影响 被引量：3

8

作者 李茜 余细勇 +4 位作者 周钢 杨敏 刘志敏 邓春玉 林曙光 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第10期1201-1205,T005,共6页

目的 :构建ΔCREB的真核表达载体 ,观察其对TNFα等细胞因子的影响 ,探索心衰发生发展的始动因素。方法 :利用穿梭质粒pAdTrack构建核转录因子ΔCREB的真核表达载体pAdTrack -ΔCREB ,然后转染培养的乳鼠心肌细胞。将心肌细胞随机分为... 目的 :构建ΔCREB的真核表达载体 ,观察其对TNFα等细胞因子的影响 ,探索心衰发生发展的始动因素。方法 :利用穿梭质粒pAdTrack构建核转录因子ΔCREB的真核表达载体pAdTrack -ΔCREB ,然后转染培养的乳鼠心肌细胞。将心肌细胞随机分为空白对照组、forskolin(10 μmol/L)组、转染组和转染后加forskolin组 ,观察各组心肌细胞ΔCREB的表达以及TNFα含量的变化。结果 :①定量逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)显示 ,ΔCREB/β-actin定量比值 ,转染组 (1 0 0 10 16± 0 0 5 35 2 0 )明显高于对照组 (0 76 132 2± 0 0 4 4 0 90 ) ,(P <0 0 1) ;免疫细胞化学检测心肌细胞ΔCREB蛋白标记阳性率 ,转染组 (2 8 88% +9 0 5 % )亦明显高于对照组 (6 6 3% +3 38% ) ,(P <0 0 1)。②细胞上清TNFα含量 ,转染后加forskolin组 (34 36pmol/L± 12 17pmol/L)明显高于对照组 (16 91pmol/L± 5 16pmol/L) ,(P <0 0 1)。结论 :转染ΔCREB可显著升高心肌细胞TNFα含量。cAMP介导的CREB转录激活作用促进了TNFα基因表达 ,可能在心力衰竭的发展中起重要作用。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子 心力衰竭 转录因子 心肌细胞 TNFΑ △CREB真核表达载体

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pcDNA3-hNGF真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达 被引量：3

9

作者 粟谋 贝朝涌 +2 位作者 蒋林彬 徐威 陈宁 《中国骨质疏松杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期41-44,共4页

目的构建人神经生长因子(h NGF)真核表达载体pc DNA3-h NGF,检测其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达。方法利用PCR扩增h NGF全长c DNA,构建真核表达载体pc DNA3-h NGF,经测序证实后将其转染至大鼠骨髓基质干细胞中,利用Western blot方法检... 目的构建人神经生长因子(h NGF)真核表达载体pc DNA3-h NGF,检测其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达。方法利用PCR扩增h NGF全长c DNA,构建真核表达载体pc DNA3-h NGF,经测序证实后将其转染至大鼠骨髓基质干细胞中,利用Western blot方法检测h NGF的表达情况。结果 DNA测序结果显示构建的pc DNA3-h NGF表达载体与实验设计相符。Western blot检测显示该重组载体转染大鼠BMSCs 72h后,有h NGF的过表达。结论构建的pc DNA3-h NGF能在骨髓基质干细胞过表达h NGF蛋白,本研究为应用神经生长因子修饰的骨髓基质干细胞进行骨折治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 神经生长因子真核表达载体 骨髓基质干细胞 表达

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人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肝癌细胞转染 被引量：2

10

作者 陈陵 李志宏 +5 位作者 杨仕明 李晶晶 蔡永国 房殿春 罗元辉 王东旭 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期47-49,共3页

目的构建正义和反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肝癌细胞株MHCC97-L及高转移细胞株MHCC97-H和HCCLM6。方法采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2... 目的构建正义和反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肝癌细胞株MHCC97-L及高转移细胞株MHCC97-H和HCCLM6。方法采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认。用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肝癌细胞株MHCC97-L,反义真核表达载体转入人高转移肝癌细胞株MHCC97-H和HCCLM6,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果。结果经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3 kb和1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5 kb和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;测序结果进一步确认了方向的正确性。转染成功的肝癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光。结论成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肝癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肝癌细胞的转移能力的影响奠定了基础。 展开更多

关键词 肝素酶 荧光真核表达载体 转染

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茶树PPO融合蛋白真核表达载体的构建与表达 被引量：2

11

作者 王乃栋 张丽霞 +2 位作者 黄晓琴 韩晓阳 李智 《茶叶科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期269-275,共7页

以迎霜品种茶树基因组为模板,利用高保真聚合酶pfu,通过PCR方法扩增得到茶树PPO基因的编码区序列。通过设计酶切引物将其成功融合至真核表达载体pPICZa中,构建出茶多酚氧化酶的融合蛋白真核表达载体pPICZa-PPO,并将其转化进入巴斯德毕... 以迎霜品种茶树基因组为模板,利用高保真聚合酶pfu,通过PCR方法扩增得到茶树PPO基因的编码区序列。通过设计酶切引物将其成功融合至真核表达载体pPICZa中,构建出茶多酚氧化酶的融合蛋白真核表达载体pPICZa-PPO,并将其转化进入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,成功筛选出多个阳性转化子。对阳性转化子进行甲醇诱导,采用Western-Blotting方法在培养液中成功检测到诱导表达的目的蛋白。酶活检测结果也显示诱导产物具有较高的相对酶活性,能够正确发挥酶蛋白的生物功能。 展开更多

关键词 茶树 多酚氧化酶 融合蛋白真核表达载体 巴斯德毕赤酵母 诱导表达

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凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建 被引量：6

12

作者 于利利 王泽华 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期489-491,499,共4页

目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体,并转染宫颈癌HeLa细胞,进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果,为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因,以Pgenesil-1质粒为载体,构建重组体,根据Livin基因cDNA序列,设计shRN... 目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体,并转染宫颈癌HeLa细胞,进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果,为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因,以Pgenesil-1质粒为载体,构建重组体,根据Livin基因cDNA序列,设计shRNA寡核苷酸序列,退火后克隆到空载体Pgenesil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同,重组载体构建成功,并被成功转入宫颈癌HeLa细胞,可见绿色荧光蛋白表达,48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体,为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。 展开更多

关键词 LIVIN shRNA真核表达载体 HELA细胞

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人釉原蛋白编码区基因真核表达载体PsecTaq2A-AMG的构建 被引量：2

13

作者 杨爱玲 徐琛蓉 +3 位作者 章锦才 钟良军 殷春一 赵川江 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期133-135,共3页

目的　构建人釉原蛋白 (AMG)编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。方法　采用PCR技术体外扩增AMG完整分泌肽编码区。将扩增产物与PsecTaq2A分别用BamHI和XholI行双酶切 ,将获取的AMG目的基因片段连接到双酶切后的PsecTaq2A ,构建重组... 目的　构建人釉原蛋白 (AMG)编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。方法　采用PCR技术体外扩增AMG完整分泌肽编码区。将扩增产物与PsecTaq2A分别用BamHI和XholI行双酶切 ,将获取的AMG目的基因片段连接到双酶切后的PsecTaq2A ,构建重组质粒PsecTaq2A_AMG ,并对重组质粒进行鉴定。结果　①PCR扩增产物经 1 5 %琼脂糖凝胶电泳 ,可见大小约 5 19bp的特异性条带 ,与预期结果一致。②重组克隆PsecTaq2A_AMG酶谱分析与预期结果一致 ,序列测定结果与GenBank中的人釉原蛋白序列完全一致。结论　用此方法可成功构建AMG编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。 展开更多

关键词 人釉原蛋白 重组质粒 编码区基因真核表达载体 基因治疗

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大鼠谷氨酰胺酶反义真核表达载体的构建及鉴定 被引量：3

14

作者 刘宏鸣 杨俊涛 顾红光 《医学研究生学报》 CAS 2003年第7期487-488,共2页

目的 :构建大鼠谷氨酰胺酶 (GA)反义真核表达载体。　方法 :采用分子克隆技术将rGAcDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA 3.0中。　结果 :EcoRⅠ和HinDⅢ双酶切后 ,反义重组基因为 0 .2 8kb和 5 .4kb两条带 ,与理论计算相符。　结论 :成功... 目的 :构建大鼠谷氨酰胺酶 (GA)反义真核表达载体。　方法 :采用分子克隆技术将rGAcDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA 3.0中。　结果 :EcoRⅠ和HinDⅢ双酶切后 ,反义重组基因为 0 .2 8kb和 5 .4kb两条带 ,与理论计算相符。　结论 :成功构建了大鼠GA反义真核表达载体 。 展开更多

关键词 谷氨酰胺酶 反义真核表达载体 大鼠

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人B7.1真核表达载体的构建、鉴定及其在白血病细胞上表达的实验研究 被引量：1

15

作者 马肖容 张王刚 +2 位作者 田玮 陈银霞 刘捷 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2009年第2期450-454,共5页

本研究构建包含人B7.1cDNA的重组真核表达载体pDisplay-hB7.1并鉴定,实现其在白血病细胞株HL-60细胞上的表达,获得HL60-hB7.1。应用分子克隆、PCR法扩增人B7.1基因片段,采用ApaI、SalI分别双酶切PCR产物和表达载体pHook,纯化后的酶切产... 本研究构建包含人B7.1cDNA的重组真核表达载体pDisplay-hB7.1并鉴定,实现其在白血病细胞株HL-60细胞上的表达,获得HL60-hB7.1。应用分子克隆、PCR法扩增人B7.1基因片段,采用ApaI、SalI分别双酶切PCR产物和表达载体pHook,纯化后的酶切产物由T4DNA连接酶连接,转导大肠杆菌DH5α;应用ApaI、SalI双酶切和DNA序列分析技术进一步鉴定阳性克隆pDisplay-hB7.1,应用脂质体转化技术将B7.1转染HL-60细胞,同一标本分别采用直接免疫荧光法、SABC法及FACS法鉴定hB7.1在HL-60细胞上的表达,阳性细胞命名为HL60-hB7.1。结果表明,PCR法扩增出约620bp的基因片段;连接产物转导感受态细胞后,共筛选出5个阳性克隆,均可经ApaI、SalI双酶切出大小约620bp的基因片段,与人B7.1基因片段大小相符,提示重组载体构建成功。进一步DNA序列分析证明人B7.1基因序列和读码框架正确,与文献报道人B7.1cDNA序列一致,无基因突变。直接免疫荧光法鉴定表明,HL60-hB7.1阳性细胞数为70%,SABC法鉴定为65%,FACS法鉴定为92.7%。经以上鉴定证实hB7.1cDNA已成功转染HL-60细胞株并在其膜上高效表达,获得了HL60-hB7.1。结论:应用分子克隆方法可成功构建人B7.1(CD80)重组真核表达载体,并稳定、高效表达B7.1-于HL-60细胞胞膜上,推测应用这种方案制备的瘤苗可能具有免疫治疗和免疫保护作用。 展开更多

关键词 B7.1真核表达载体 白血病 基因治疗 免疫治疗

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含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建 被引量：2

16

作者 朱建中 卢春 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期453-454,共2页

目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中... 目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中,获得重组表达质粒pCR-GFP-K12。结果:重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果,此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制。结论:重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功,为研究K12的生物学活性及其作用机制打下基础。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白 人疱疹病毒8型 K12基因 重组真核表达载体 构建

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HBV YIDD变异株真核表达载体的构建及鉴定 被引量：1

17

作者 徐维祯 李迪 +3 位作者 李桂秋 张淑云 房勇 谷鸿喜 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2007年第5期39-42,共4页

构建HBV C基因型YIDD拉米夫定耐药株的全基因真核表达载体,为进一步深入探讨乙型肝炎病毒拉米夫定耐药的分子机制,寻求耐药后的有效治疗奠定基础。以重组质粒PMD18T-HBV-C为模板,采用PCR扩增HBV C基因型YIDD变异株的全基因组DNA,并将其... 构建HBV C基因型YIDD拉米夫定耐药株的全基因真核表达载体,为进一步深入探讨乙型肝炎病毒拉米夫定耐药的分子机制,寻求耐药后的有效治疗奠定基础。以重组质粒PMD18T-HBV-C为模板,采用PCR扩增HBV C基因型YIDD变异株的全基因组DNA,并将其定向克隆于真核表达载体PcDNA3.1(+)中。获得的真核表达重组质粒PcDNA3.1(+)-HBV-C(YIDD)通过酶切后电泳及测序进行鉴定。琼脂糖电泳结果证实PCR产物大小约为3.2 kb,与预期相同。酶切及测序结果证实,HBV C基因型YIDD拉米夫定耐药株全基因真核表达载体PcDNA3.1(+)-HBV-C(YIDD)构建成功。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒拉米夫定耐药变异真核表达载体

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抗阿尔茨海默病重组真核表达载体的构建

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作者 何颖 黄力 +3 位作者 章亚男 黎怀星 陈蕊雯 孙树汉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期55-57,共3页

目的 :将淀粉样蛋白 N端的抗原表位基因以 4种不同的组合与小鼠 Ig G重链区基因融合 ,构建抗阿尔茨海默病的重组质粒。方法 :通过 RT- PCR技术从小鼠脾组织中克隆 Ig G重链区 c DNA,将柔性接头与抗原表位基因序列设计在 5′端引物中 ,... 目的 :将淀粉样蛋白 N端的抗原表位基因以 4种不同的组合与小鼠 Ig G重链区基因融合 ,构建抗阿尔茨海默病的重组质粒。方法 :通过 RT- PCR技术从小鼠脾组织中克隆 Ig G重链区 c DNA,将柔性接头与抗原表位基因序列设计在 5′端引物中 ,然后以克隆出的小鼠 Ig G重链区 c DNA为模板 ,用 PCR法克隆出由柔性接头将抗原表位和 Ig G重链区基因融合在一起的序列 ,并插入到 p VAX质粒载体中。结果 :扩增出来的 4种不同组合的抗原表位基因和 Ig G重链区基因融合序列大小分别为 999、1 0 2 0、1 0 0 5、1 0 2 6 bp,均与 Gen Bank上登录的相符 ;p VAX重组质粒酶切结果表明融合基因正确地插入到 p VAX载体中 ,全自动测序亦显示抗原表位基因和 Ig G重链区基因为所需基因 ,接头序列也完全正确。结论 :成功构建了抗阿尔茨海默病的 4种表位基因 - Ig G重链区融合表达的重组质粒 。 展开更多

关键词 阿尔茨海默病 重组真核表达载体 抗原 基因序列 基因表达

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密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

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作者 刘立鸿 许璐 +2 位作者 李轶杰 张富春 马正海 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期663-667,共5页

目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2。方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR-XL-TO-PO载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-... 目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2。方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR-XL-TO-PO载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2;通过水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达。结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcD-NA3.1-L1-IRES-L2构建正确。重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录。重组质粒转染293T细胞后出现CPE(cytopathic effect)现象,表明衣壳基因在细胞中已表达。Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达。结论:成功地构建了pcDNA3.1-L1-IRES-L2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础。 展开更多

关键词 密码子优化 HPV16衣壳基因 共表达真核载体 细胞转染

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HBeAg真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

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作者 杨军 刘妮 +5 位作者 卫阳 靳耀锋 王军宁 康安静 苏宝山 李宗芳 《临床肝胆病杂志》 CAS 2012年第11期845-848,共4页

目的克隆HBeAg基因,构建重组HBeAg真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中进行表达。方法采用PCR法从HBeAg阳性乙型肝炎患者血清HBV DNA中扩增HBeAg基因,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建重组pcDNA-HBeAg真核表达载体,经PC... 目的克隆HBeAg基因,构建重组HBeAg真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中进行表达。方法采用PCR法从HBeAg阳性乙型肝炎患者血清HBV DNA中扩增HBeAg基因,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建重组pcDNA-HBeAg真核表达载体,经PCR、双酶切、测序鉴定后,将其转染入CHO细胞,G418筛选,用PCR、免疫斑点、Western Blot、免疫细胞化学方法检测HBeAg在CHO细胞中的表达。结果成功克隆到HBeAg基因,并构建了重组pcDNA-HBeAg真核表达载体;基因测序证实克隆的HBeAg基因中共有12个位点发生单碱基置换突变(C1819G,A2007T,C2046T,C2061G,G2106A,C2109A,C2146T,T2172C,C2203T,A2235G,G2253A,C2298T),1个位点发生缺失突变(2346 del T);成熟HBeAg蛋白中149位缬氨酸(valine,V)突变为苯丙氨酸(phenylalanine,F)(V149F),在HBeAg蛋白羧基端融合有一段长11个氨基酸的多肽(RLESRGPVZTR)。PCR、免疫斑点、Western Blot和免疫细胞化学方法证实重组pcDNA-HBeAg真核表达载体可在CHO细胞中表达分泌型HBeAg蛋白。结论重组HBeAg真核表达载体的构建和表达为HBeAg的临床诊断和深入研究提供了条件。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 肝炎e抗原 乙型 PCDNA3 1(+)真核表达载体

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