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人p27^(kipl)可调控性重组腺病毒载体的构建及其在PC-3细胞中的表达
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作者 邱镇 孙颖浩 +6 位作者 许传亮 王元天 沈茜 钱松溪 顾正勤 李云 Chinlee Wu 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第11期1200-1203,共4页
目的:体外构建人p27kipl可调控性重组腺病毒载体,并观察其在前列腺癌细胞系PC-3细胞中的表达及其对细胞生长的影响。方法:采用Ad-X Tet-Off表达系统,将人全长p27kipl cDNA经过穿梭载体,与可调控性腺病毒载体骨架连接,得到重组人p27kipl... 目的:体外构建人p27kipl可调控性重组腺病毒载体,并观察其在前列腺癌细胞系PC-3细胞中的表达及其对细胞生长的影响。方法:采用Ad-X Tet-Off表达系统,将人全长p27kipl cDNA经过穿梭载体,与可调控性腺病毒载体骨架连接,得到重组人p27kipl基因腺病毒(Ad-p27kipl),在HEK293细胞包装、扩增,获得高滴度病毒,采用空斑试验测定病毒滴度,体外转染PC-3细胞,RT-PCR、Western杂交分别检测目的基因不同水平的表达,并通过MTT法观察转染前后细胞增殖力的变化。Ad-X-TRE-β gal病毒作为对照。结果:构建的Ad-p27kipl病毒滴度为1.2×109 pfu/ml,RT-PCR、Western杂交检测有特异的高表达,转染后对细胞的生长有抑制作用。结论:体外连接法成功地构建携带人p27kipl基因的可调控性重组腺病毒载体,在人前列腺癌细胞系PC-3中有高表达并对细胞生长有抑制作用。 展开更多
关键词 人p27^kip1 可调控性重组腺病毒载体 PC-3细胞 前列腺癌 细胞生长
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可调控性鼠PLP-Ig嵌合体重组腺病毒载体的构建和表达 被引量:1
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作者 张燕 刘梦蕾 沈茜 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期667-670,共4页
目的 :构建和表达可调控鼠蛋白脂质蛋白 (PLP) 免疫球蛋白重组腺病毒载体。方法 :采用常规分子生物学方法 ,从WT 1杂交瘤细胞中抽提总RNA ,克隆小鼠Ig重链Fc基因。将编码PLP13 9-151的DNA与信号肽设计在引物上 ,经两次克隆可形成可分泌... 目的 :构建和表达可调控鼠蛋白脂质蛋白 (PLP) 免疫球蛋白重组腺病毒载体。方法 :采用常规分子生物学方法 ,从WT 1杂交瘤细胞中抽提总RNA ,克隆小鼠Ig重链Fc基因。将编码PLP13 9-151的DNA与信号肽设计在引物上 ,经两次克隆可形成可分泌型PLP Ig。经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接 ,鉴定后在HEK2 93细胞中包装。获得高滴度病毒后 ,用Westernblot鉴定目的基因的表达。结果 :PLP Ig重组腺病毒经测序、限制性内切酶酶切分析及PCR等鉴定 ,同预期结果相一致。Westernblot检测病毒感染的细胞 ,发现目的基因得到特异性表达且可被四环素调节。结论 :构建了可调控的小鼠PLP Ig重组腺病毒载体并得到正确表达 ,为进一步基因治疗实验性变态反应性脑脊髓炎 (EAE) 展开更多
关键词 PLP-Ig 腺病毒载体 可调控载体 小鼠
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pri-miR-21重组腺病毒载体构建及其对TLR4基因调控的研究 被引量:8
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作者 赵婧 徐广贤 +4 位作者 贾伟 董辉 张一琳 赵志军 魏军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期153-155,159,共4页
目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系。方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨... 目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系。方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,并利用293A细胞,包装成pri-miR-21重组腺病毒感染HeLa细胞,通过Western blot检测TLR4的蛋白表达水平,验证miR-21与TLR4靶向调控的关系。结果:经PCR、酶切、测序及GFP表达证实,成功构建携带pri-miR-21基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。Western blot证实,miR-21可抑制TLR4蛋白的表达。结论:所制备的小鼠pri-miR-21重组腺病毒,可以高效表达成熟miR-21小分子,能够抑制靶基因TLR4的表达。 展开更多
关键词 pri-miR-21 重组腺病毒载体 TLR4基因 靶向调控
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胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体穿梭质粒的构建及鉴定 被引量:5
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作者 马春明 杨朝鲜 +3 位作者 闫乃红 袁琼兰 高小青 邓莉 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期199-202,共4页
构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体。提取新生大鼠纹状体总RNA,RTPCR克隆大鼠GDNFcDNA,产物回收后经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,插入重组腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV中,氯化钙法转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、... 构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体。提取新生大鼠纹状体总RNA,RTPCR克隆大鼠GDNFcDNA,产物回收后经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,插入重组腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV中,氯化钙法转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、PCR及测序分析对重组质粒做进一步鉴定。结果显示大鼠GDNFcDNA被成功克隆,所克隆的GDNFcDNA与基因库注册的相同,以上结果说明本实验成功构建了GDNFcDNA重组腺病毒载体。 展开更多
关键词 胶质细胞源神经营养因子 重组腺病毒穿梭载体 基因重组 大鼠
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人NT3、BDNF基因Tet-on可调控重组腺病毒载体的构建和鉴定 被引量:4
5
作者 李志全 朱庆生 +4 位作者 朱锦宇 郝伟 许彦鸣 王成济 杨安钢 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期344-347,共4页
目的 :分别构建含人神经营养素 3(NT3)基因和脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的重组四环素可诱导的腺病毒载体 ,并进行PCR和酶切鉴定。方法 :将NT3和BDNF基因依次分别亚克隆到pIND载体和pTRE Shuttle2载体中 ,构建重组载体pTRE Shuttle2 ... 目的 :分别构建含人神经营养素 3(NT3)基因和脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的重组四环素可诱导的腺病毒载体 ,并进行PCR和酶切鉴定。方法 :将NT3和BDNF基因依次分别亚克隆到pIND载体和pTRE Shuttle2载体中 ,构建重组载体pTRE Shuttle2 NT3和pTRE Shuttle2 BDNF。用PI SceI和I CeuI双酶切后将所获NT3及BDNF基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno X连接 ,构建成pAdeno NT3及pAdeno BDNF的重组腺病毒载体。以电穿孔转化E .coli后挑取克隆进行PCR及酶切鉴定。结果 :重组腺病毒载体的PCR鉴定表明 ,在 312bp处出现特定的条带 ;酶切鉴定证实 ,得到约 2 3kb的预期片段 ,说明人NT3、BDNF基因与腺病毒载体pAdeno X已正确连接。结论 :成功地构建了含人NT3和BDNF基因的四环素可诱导重组腺病毒载体 。 展开更多
关键词 神经营养素3 脑源神经营养因子 四环素 重组腺病毒载体
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人酸性成纤维细胞生长因子基因重组腺病毒粘粒载体的构建
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作者 章斌 梅举 +1 位作者 张宝仁 顾俊彦 《实用医学杂志》 CAS 2002年第11期1150-1152,共3页
目的 :构建人酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)重组腺病毒粘粒载体。方法 :抽取人胎脑组织mRNA ,经RT PCR获取aFGF基因 ,测序后将其插入腺病毒粘粒载体pAxCAwt的SwaI位点。结果 :RT PCR合成的DNA片段经克隆、测序后证实为aFGF基因 ,酶切... 目的 :构建人酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)重组腺病毒粘粒载体。方法 :抽取人胎脑组织mRNA ,经RT PCR获取aFGF基因 ,测序后将其插入腺病毒粘粒载体pAxCAwt的SwaI位点。结果 :RT PCR合成的DNA片段经克隆、测序后证实为aFGF基因 ,酶切结果显示 ,aFGF腺病毒重组粘粒 (pAxCAwt aFGF)中aFGF的插入方向正确。结论 :构建的aFGF腺病毒重组粘粒 (pAxCAwt aFGF)可用于进一步的基因治疗的研究中 。 展开更多
关键词 人酸成纤维细胞生长因子 AFGF 基因重组 腺病毒粘粒载体 基因治疗 心肌缺血 治疗血管生长 冠心病 CHD
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重组腺病毒转导的MSC导向的CNTF基因靶向性治疗MS对髓鞘和轴突的保护作用 被引量:1
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作者 陆正齐 胡学强 +2 位作者 朱灿胜 王敦敬 郑雪平 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期810-817,共8页
目的:探讨重组腺病毒转导的骨髓间充质细胞导向(MSC)的睫状神经营养因子(CNTF)基因靶向性治疗多发性硬化对髓鞘和轴突的保护机制。方法:先构建、扩增、纯化Ad-CNTF-IRES-GFP,在体外培养MSC细胞。将1×108Ad-CNTF-IRES-GFP转染MSCS1&... 目的:探讨重组腺病毒转导的骨髓间充质细胞导向(MSC)的睫状神经营养因子(CNTF)基因靶向性治疗多发性硬化对髓鞘和轴突的保护机制。方法:先构建、扩增、纯化Ad-CNTF-IRES-GFP,在体外培养MSC细胞。将1×108Ad-CNTF-IRES-GFP转染MSCS1×106,测定上清液中CNTF的浓度。再用MOG35-55建立C57BL/6小鼠EAE模型,将Ad-CNTF-IRES-GFP转染的MSC移植治疗EAE小鼠,观察其病情评分;免疫荧光观察其病变部位的外源性MSCs数量;免疫组化观察少突胶质细胞前体细胞(OPC)-NG2(+)细胞在病变部位的数量,Westernblot和免疫组化法观察神经生长因子CNTF表达,免疫组化观察促凋亡蛋白Caspase-3表达;病理观察髓鞘、轴突损伤情况;电镜观察髓鞘和轴突以及ODC损伤情况;所有的数据用x—±s表示。采用SPSS13.0进行统计分析。结果用多因素方差分析,P<0.05差异有显著性。结果:MSC-Ad-CNTF-IRES-GFP治疗的EAE小鼠病情显著减轻。不仅平均发病时间缩短,发病率下降,病情减轻,而且病情严重程度也明显减轻。外源性MSC出现在EAE的脊髓病变部位。治疗后的EAE小鼠脊髓病变部位的NG2(+)表达明显增加,促凋亡蛋白Caspase-3的表达明显降低。治疗后的EAE小鼠病变部位的髓鞘和轴突变性明显减轻。结论:MSC-Ad-CNTF-IRES-GFP可有效治疗EAE动物。其机制可能是:Ad-CNTF-IRES-GFP转染的MSC细胞定向去病变部位,升高其部位CNTF水平和NG2(+)细胞数量,减轻其部位髓鞘、轴突及ODC损伤,减少促凋亡蛋白Caspase-3表达。 展开更多
关键词 睫状神经生长因子 重组腺病毒载体 多发硬化 实验变态反应脑脊髓炎 骨髓间充质细胞
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大鼠BDNF基因复制缺陷型重组腺病毒的构建与鉴定 被引量:2
8
作者 王鹏 吴燕峰 +4 位作者 黄文林 唐勇 黄霖 杨睿 沈慧勇 《中山大学学报(医学科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期135-139,共5页
【目的】构建携带大鼠脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)目的基因的复制缺陷型重组腺病毒,并初步检测其体外表达目的基因的能力。【方法】提取大鼠脑组织总RNA,使用RT-PCR方法扩增BDNF目的基因并将其克隆入pMD18... 【目的】构建携带大鼠脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)目的基因的复制缺陷型重组腺病毒,并初步检测其体外表达目的基因的能力。【方法】提取大鼠脑组织总RNA,使用RT-PCR方法扩增BDNF目的基因并将其克隆入pMD18-TSimple载体测序,将测序完全正确的BDNF目的基因克隆入pShuttle2中,然后利用体外连接法将BDNF目的基因克隆入Adeno-XTM腺病毒骨架中,LipofectamineTM2000法转染HEK293细胞包装携带BDNF目的基因的重组腺病毒,少量提取重组腺病毒DNA检测证实为复制缺陷型BDNF基因重组腺病毒后大量扩增,蛋白电泳及Westernblot法初步检测BDNF目的基因在HEK293细胞中的表达。【结果】成功构建了携带大鼠BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒,并证实其在HEK293细胞中可高水平表达BDNF目的基因。【结论】利用体外连接法可方便、快捷地构建携带BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒,并可在体外高水平表达表达其所携带的目的基因。 展开更多
关键词 脑源神经营养因子 基因重组 腺病毒载体
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腺病毒介导PTEN过表达抑制人脑胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤的生长
9
作者 郑克彬 刘海鹏 +3 位作者 单小松 李志红 李春晖 方川 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期70-74,共5页
目的:研究含第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homologue deleted on chromo-some 10,PTEN)基因的重组腺病毒(Ad-PTEN-GFP)对人胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:于裸鼠背部注射人脑胶质瘤U... 目的:研究含第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homologue deleted on chromo-some 10,PTEN)基因的重组腺病毒(Ad-PTEN-GFP)对人胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:于裸鼠背部注射人脑胶质瘤U251细胞,建立胶质瘤裸鼠移植瘤模型。荷瘤裸鼠随机分为3组进行治疗:Ad-PTEN-GFP组,Ad-GFP组(空载体组)及PBS组(空白组),观察3组裸鼠移植瘤的生长,测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,并观察荷瘤裸鼠的生存时间。采用TUNEL法检测移植瘤组织中细胞凋亡的情况,采用免疫组化法检测移植瘤组织中PTEN及P65蛋白的表达。结果:与Ad-GFP组相比,Ad-PTEN-GFP组移植瘤的生长受到抑制,肿瘤体积抑制率显著升高[(82.5±12.7)%vs(7.2±1.3)%,P<0.05],荷瘤裸鼠生存时间延长[(103±10)vs(58±8)d,P<0.01];TUNEL结果表明,Ad-PTEN-GFP组与Ad-GFP组相比,移植瘤细胞凋亡率明显增加[(46.4±8.3)%vs(4.6±1.0)%,P<0.01];免疫组化结果显示,Ad-PTEN-GFP组与Ad-GFP组相比,移植瘤组织中PTEN蛋白的阳性表达率增高(83.3%vs 0,P<0.01),P65蛋白阳性表达率下降(16.7%vs 66.7%,P<0.01)。结论:感染Ad-PTEN-GFP后人脑胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤的生长受到抑制,其机制可能与P65蛋白表达的下调有关。 展开更多
关键词 胶质瘤 U251细胞 10号染色体同源丢失磷酸酶-张力蛋白(PTEN) P65 凋亡 重组腺病毒载体
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MSC-CNTF靶向性治疗变态反应性脑脊髓炎动物对病情和炎症的影响 被引量:3
10
作者 陆正齐 胡学强 +5 位作者 朱灿胜 郑雪平 王敦敬 刘然义 黄必军 黄文林 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期2355-2361,共7页
目的探讨重组腺病毒转导的骨髓间充质细胞(MSC)导向的睫状神经营养因子(CNTF)基因靶向性治疗C57小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE),对动物病情和和炎症的影响。方法用成功构建的Ad-CNTF-IRES-GFP载体,体外观察Ad-CNTF-IRES-GFP转染MSC(... 目的探讨重组腺病毒转导的骨髓间充质细胞(MSC)导向的睫状神经营养因子(CNTF)基因靶向性治疗C57小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE),对动物病情和和炎症的影响。方法用成功构建的Ad-CNTF-IRES-GFP载体,体外观察Ad-CNTF-IRES-GFP转染MSC(MSC-CNTF)对MSC表达CNTF的影响,再用MOG35-55建立C57BL/6小鼠的EAE模型,将MSC-CNTF移植治疗EAE小鼠,观察EAE动物病情评分;ELISA法观察外周血的促炎症因子TNF-α、IFN-γ,IL-12p35和抗炎症因子IL-10的水平,HE染色观察脑和脊髓炎症细胞浸润,用免疫荧光和免疫组化观察病变部位CD3(+)T细胞、炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ的表达水平。结果(1)MSC-CNTF在MOI等于100的情况下,分泌的CNTF较DIL染色的MSC(MSC-DIL)、或Ad-eGFP转染的MSC(MSC-GFP)增高20倍(P<0.01)。(2)MSC-CNTF治疗的EAE小鼠病情显著减轻。不仅平均发病时间缩短,发病率下降,病情减轻,而且病情严重程度也明显减轻。(2)MSC-CNTF治疗明显减低EAE小鼠外周血TNF-α和IFN-γ水平,明显升高外周血IL-10水平。(3)MSC-CNTF治疗EAE小鼠可明显降低病变部位的炎症细胞数量和炎性细胞因子TNF-α水平,而对IFN-γ表达几乎影响不大。结论MSC-CNTF移植治疗的EAE动物病情明显减轻,其机制是:减低外周血TNF-α和IFN-γ水平,降低病变部位CD3(+)细胞数量和炎性细胞因子TNF-α水平。 展开更多
关键词 睫状神经营养因子 重组腺病毒载体 多发硬化 实验变态反应脑脊髓炎 骨髓间充质细胞
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疫苗
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《生物技术通报》 CAS CSCD 1992年第4期44-46,共3页
关键词 疫苗研究 抗原决定基 病毒载体 重组疫苗 乙型肝炎病毒 单克隆抗体 免疫反应 启动子调控 免疫源 杂交瘤
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