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密码子优化和信号肽对猪圆环病毒ORF2基因在毕赤酵母表达中的影响
1
作者 张春玲 王瑞阳 +5 位作者 钱忠辉 赵本进 张俊平 葛宇燕 张子悦 丁卫星 《上海农业学报》 2024年第4期81-85,共5页
为了在毕赤酵母中高效表达PCV2ORF2基因,对PCV2ORF2基因编码的187个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏爱性优化,利用两步PCR全化学合成优化后的ORF2基因。将优化前后的PCV2ORF2基因片段插入毕赤酵母表达载体pPICZα-C,构建重组质粒pPICZα-C-O... 为了在毕赤酵母中高效表达PCV2ORF2基因,对PCV2ORF2基因编码的187个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏爱性优化,利用两步PCR全化学合成优化后的ORF2基因。将优化前后的PCV2ORF2基因片段插入毕赤酵母表达载体pPICZα-C,构建重组质粒pPICZα-C-ORF2和p PICZα-C-ORF2op。将线性化的重组质粒电转化毕赤酵母GS115,并筛选Zeocin抗性重组子。同时,也研究了信号肽对PCV2ORF2表达效率的影响。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,只有经密码子优化且去除ORF2基因自身信号肽的重组子能够分泌表达PCV2 ORF2蛋白,目的蛋白分子质量约为30 ku,表达的重组ORF2蛋白可被PCV2阳性血清识别,具有生物学活性。 展开更多
关键词 猪圆环病毒orf2基因 密码子优化 稀有密码子 自身信号肽 毕赤酵母
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2023年黑龙江地区某鹅场鹅星状病毒分离鉴定及ORF2基因序列分析
2
作者 徐烨 朱庆贺 +1 位作者 高旭 孙东波 《黑龙江八一农垦大学学报》 2024年第2期50-56,106,共8页
为调查2023年黑龙江地区某鹅场中鹅星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)的感染及遗传进化情况,采集发病鹅的内脏组织样品进行RT-PCR检测,检测阳性样本通过鹅胚接种进行病毒分离,并利用RT-PCR以及电镜进行鉴定,利用二代测序技术进行分离... 为调查2023年黑龙江地区某鹅场中鹅星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)的感染及遗传进化情况,采集发病鹅的内脏组织样品进行RT-PCR检测,检测阳性样本通过鹅胚接种进行病毒分离,并利用RT-PCR以及电镜进行鉴定,利用二代测序技术进行分离毒株的全基因组测序,运用MEGA6软件对ORF2基因进行遗传进化分析。结果显示,在15份样品中,GoAstV的阳性率为6.67%(1/15)。阳性样本处理后接种鹅胚进行病毒分离,盲传至第5代时,尿囊膜增厚,出现尿酸盐沉积,鹅胚在120 h内死亡率达到83.33%(20/24),死亡鹅胚尿囊液进行GoAstV RT-PCR检测,结果为阳性。电镜观察结果显示,可观察到30 nm左右的病毒粒子。提取第5代病毒尿囊液RNA进行全基因组测序,并对该毒株ORF2基因进行同源性分析和系统发育进化树分析,结果显示,鉴定的毒株与其他GoAstV的ORF2基因核苷酸同源性为54.7%到96.6%,与GoAstV LYG2株的核苷酸同源性最高,为96.6%,而其与GoAstV FLX株差异较大,为54.7%。系统发育进化树结果显示,试验鉴定的毒株属于GoAstV G2型,与火鸡星状病毒遗传关系较近。研究对黑龙江地区某鹅场GoAstV进行分离鉴定并对ORF2基因进行序列分析,为黑龙江省GoAstV遗传进化及其分子流行病学调查研究提供了基础数据。 展开更多
关键词 GoAstV RT-PCR orf2基因 分离鉴定 序列分析
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猪II型圆环病毒全基因组序列分析及其ORF1和ORF2基因的克隆与表达 被引量：16
3
作者 韩凌霞 陈艳 +3 位作者 崔尚金 王云峰 仇华吉 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期10-13,共4页
猪II型圆环病毒(PCV＿2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap。本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中... 猪II型圆环病毒(PCV＿2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap。本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中,进行了序列测定。将Rep和Cap基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pPROEXTMHT中,以融合蛋白的形式表达了这两种蛋白。根据文献报道,致病性的PCV＿2与无致病性的PCV1的型特异性抗原决定簇主要位于Cap基因的羧基端部分,本实验利用原核表达载体pGEX＿6p＿1融合表达了Cap基因羧基端423bp的片段。通过薄层扫描各重组菌诱导表达产物的SDS＿PAGE结果,重组质粒pPRO＿Cap和pPRO＿Rep以及pGEX＿ΔCap的外源基因表达量分别占总菌体总蛋白的15.1%、30.4%和19.6%。将表达的三种蛋白作为抗原,通过酶联免疫吸附试验分别与PCV＿2阳性猪血清和SPF猪血清进行了反应,pGEX＿ΔCap表达的蛋白(Cap蛋白的羧基端部分)抗原反应性最强,这表明截短的Cap蛋白羧基端部分将是一个良好的诊断PCV＿2感染用候选抗原。 展开更多
关键词 PCV-2 诊断抗原 猪II型圆环病毒 全基因组序列分析 orfl基因 orf2基因 基因克隆 基因表达
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山东省2012年～2016年猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及对其ORF3基因分析 被引量：12
4
作者 张月 李玉杰 +7 位作者 马慧玲 王贵升 蔺晓月 孙圣福 孔祥华 王苗利 陈静 田夫林 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期447-450,共4页
为了解山东省猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行情况,本研究采用RT-PCR的方法对2012年1月~2016年12月山东省13个地市采集的258份疑似PEDV感染样品进行检测,并设计引物扩增PEDV ORF3基因片段,通过生物信息学软件对26个具有代表性的完整的PEDV O... 为了解山东省猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行情况,本研究采用RT-PCR的方法对2012年1月~2016年12月山东省13个地市采集的258份疑似PEDV感染样品进行检测,并设计引物扩增PEDV ORF3基因片段,通过生物信息学软件对26个具有代表性的完整的PEDV ORF3基因序列进行遗传进化分析。结果显示PEDV平均每年检出率达72.1%,表明PEDV是当前山东地区仔猪腹泻的主要致病病原。遗传进化分析显示,26株PEDV ORF3基因序列属于G2基因型,与其它参考PEDV病毒株同源性较高(93.8%~100%),相对保守。其中3株PEDV流行株位于2a亚型中,这在华北地区属首次报道。PEDV 2a亚型基因序列具有特异位点突变,可作为鉴别2a亚型与其它亚型的分子标记。本研究揭示了山东省PEDV流行株ORF3基因的主要基因型,为该省PEDV的防控提供依据。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 orf3基因 突变 2a亚型
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PCV2a-ORF3基因缺失株感染性克隆的构建 被引量：7
5
作者 湛洋 胡意 +2 位作者 王东亮 蔡杰 邓治邦 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期351-355,共5页
为构建猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的感染性克隆及其ORF3缺失的感染性克隆,本研究通过比较分析Gen Bank中8种亚型的PCV2基因组序列(各3株),设计了PCV2基因全长克隆引物,以从江西省萍乡市某猪场疑似感染断奶仔猪多系统衰竭综合征病死猪的病料... 为构建猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的感染性克隆及其ORF3缺失的感染性克隆,本研究通过比较分析Gen Bank中8种亚型的PCV2基因组序列(各3株),设计了PCV2基因全长克隆引物,以从江西省萍乡市某猪场疑似感染断奶仔猪多系统衰竭综合征病死猪的病料中提取的DNA为模板,利用PCR方法扩增PCV2全长基因序列并进行测序。利用分子生物学软件对测序结果分析,结果表明所获得的克隆为PCV2a-2A基因型。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增病毒全长基因组DNA,克隆于p SP72载体中构建野生型PCV2a病毒株感染性克隆。此外,采用SOE-PCR方法,缺失野生型PCV2a感染性克隆中的阅读框3(ORF3),并将这两种重组质粒分别转染PK15细胞,盲传6代后经PCR和间接免疫荧光方法检测显示,构建的PCV2a病毒株与PCV2a-ORF3突变株克隆均具有感染性。本研究为进一步探究ORF3基因对PCV2致病机理和免疫原性的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 PCV2 orf3基因 基因缺失 重叠延伸PCR
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猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达 被引量：7
6
作者 祁艳华 王爱萍 +4 位作者 李学伍 游雷鸣 史平玲 胡峰 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2010年第3期112-115,共4页
为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组... 为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 orf2基因 克隆 原核表达
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猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达 被引量：9
7
作者 郭春艳 葛俊伟 李一经 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期79-84,共6页
猪圆环病毒是引起猪多系统衰竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基... 猪圆环病毒是引起猪多系统衰竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列,并将扩增片段定向插入质粒载体pPRO-HTb,转化BL21大肠杆菌后,构建了表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组原核表达系统。经IPTG诱导,对表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物以包涵体形式存在于菌体中,通过提取包涵体,获得了初步纯化的ORF2蛋白,为进一步利用PCV2ORF2蛋白抗原进行PCV血清学检测提供了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 orf2基因 克隆 表达
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猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒福州株ORF2-7基因结构分析 被引量：7
8
作者 魏宏 林锋强 +2 位作者 周伦江 王隆柏 庄向生 《中国畜牧兽医》 CAS 2007年第1期82-85,共4页
用RT-PCR方法分段扩增出猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒(PRRSV)FZ株的5条cDNA片段,分别克隆到pMD-18T载体并进行测序,按顺序将这些序列进行拼接得到FZ株ORF2-7编码框序列,测序结果表明该序列长度为3272bp,与BJ-4株、VR-2332株、CH-1a株和... 用RT-PCR方法分段扩增出猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒(PRRSV)FZ株的5条cDNA片段,分别克隆到pMD-18T载体并进行测序,按顺序将这些序列进行拼接得到FZ株ORF2-7编码框序列,测序结果表明该序列长度为3272bp,与BJ-4株、VR-2332株、CH-1a株和HB-1株核苷酸同源性分别为99.1%、98.9%、93.2%和93.2%。 展开更多
关键词 PRRSV orf2—7基因 克隆 序列分析
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白介素2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因真核双表达质粒的构建 被引量：3
9
作者 潘群兴 何孔旺 +2 位作者 温立斌 郭容利 黄克和 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期100-104,共5页
应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2)的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA)等方法验证基因的表达情况。结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2... 应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2)的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA)等方法验证基因的表达情况。结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基因的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 orf2基因 IL-2基因 DNA疫苗
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PRRSV安徽分离株NSP2和ORF7基因的克隆与序列分析 被引量：4
10
作者 姚雪静 占松鹤 +3 位作者 朱良强 祁克宗 王非 王爱萍 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第5期58-63,共6页
2008年从安徽两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,在Marc-145细胞上盲传4代～5代,发现明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HS08株和ZJ08株)。用RT-PCR扩增这两个分离毒株的NSP2和ORF7基因,进行克隆和序列分析。... 2008年从安徽两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,在Marc-145细胞上盲传4代～5代,发现明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HS08株和ZJ08株)。用RT-PCR扩增这两个分离毒株的NSP2和ORF7基因,进行克隆和序列分析。结果表明,这两个分离毒株核苷酸同源性高于99.0%;在NSP2基因上,这两个分离毒株均发生30个氨基酸的不连续缺失,它们与CH-1a株之间核苷酸同源性分别为80.7%和80.2%;在ORF7基因上,与2007年国内高致病性猪蓝耳病毒株HuN4核苷酸同源性较高,分别为98.4%和99.5%,且ORF7基因均存在K46→R46,H109→Q109,V117→A117氨基酸突变。这些信息显示这两个安徽分离株属美洲型毒株,具有高致病性特征,与国内高致病性毒株位于同一基因群。 展开更多
关键词 PRRSV NSP2基因 orf7基因 克隆 序列分析
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2006—2012年鲁豫冀地区15株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及ORF5/Nsp2基因的遗传变异分析 被引量：6
11
作者 唐娜 管宇 +10 位作者 魏凤 王金良 曲光刚 肖跃强 李峰 谢金文 张松林 张倩 于新友 沈志强 柳增善 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第10期26-32,共7页
为研究鲁豫冀地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的遗传变异情况,对2006—2012年来自3省区发病猪场的42份样品进行PRRSV分离鉴定,并进行了生物学特性研究和PCR鉴定,结果显示先后... 为研究鲁豫冀地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的遗传变异情况,对2006—2012年来自3省区发病猪场的42份样品进行PRRSV分离鉴定,并进行了生物学特性研究和PCR鉴定,结果显示先后分离到15株PRRSV。分别采用RT-PCR扩增其ORF5基因和部分Nsp2基因并测序,与GenBank中68个ORF5序列和40个Nsp2序列的推导氨基酸序列进行比对,遗传变异分析结果表明,15株分离株均属于美洲型毒株,其中13个毒株Nsp2基因推导的氨基酸序列均存在氨基酸的不连续缺失,其ORF5基因推导的氨基酸序列与JXA1株有较高的同源性(95.5%～97.5%);SDDY2007株与疫苗株RespPRRS MLV和VR2332株亲缘关系相近,处于同一个亚群中;而HN25-2009分离株Nsp2基因推导的氨基酸序列有30个氨基酸的特征性缺失,其ORF5基因推导的氨基酸序列的遗传进化分析结果显示该分离株处于VR2332所在亚群(氨基酸同源性97.5%),具有一定特殊性。本试验结果表明,2006—2012年高致病性PRRSV是鲁豫冀地区的优势流行毒株,且存在疫苗毒株,3省区流行毒株间有一定遗传差异,但无明显地域特征。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 分离 遗传变异 orf5基因 NSP2基因
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猪星状病毒ORF2基因的克隆及序列分析 被引量：5
12
作者 兰家暖 刘磊 +5 位作者 郭旋 刘欢 卢冰霞 张民秀 廖承球 黄伟坚 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2012年第12期27-31,I0001,共6页
参考GenBank上发表的猪星状病毒亚基因组序列,设计1对引物,对猪星状病毒广西流行株衣壳蛋白ORF2基因进行扩增,最终克隆得到PAstV/NNJG7株的衣壳蛋白完整序列。序列分析发现,其ORF2全长2 358bp,编码786个氨基酸;与猪星状病毒Ⅰ型参考株... 参考GenBank上发表的猪星状病毒亚基因组序列,设计1对引物,对猪星状病毒广西流行株衣壳蛋白ORF2基因进行扩增,最终克隆得到PAstV/NNJG7株的衣壳蛋白完整序列。序列分析发现,其ORF2全长2 358bp,编码786个氨基酸;与猪星状病毒Ⅰ型参考株核苷酸同源性最高,为77.3%～79.4%;在ORF1b和ORF2连接处有一段高度保守的序列,在ORF2 3′端有一段长83bp非翻译序列及一个含43bp高度保守的茎环样基序。本试验不仅丰富了猪星状病毒衣壳蛋白基因序列,也为基因疫苗和诊断试剂盒的研制提供材料及理论依据。 展开更多
关键词 猪星状病毒 orf2基因 基因克隆 序列分析
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新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及其Nsp2和ORF5基因遗传变异分析 被引量：5
13
作者 张美玲 陆桂丽 +3 位作者 薛晶 刘丽雅 简子健 夏俊 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第17期106-110,2,共5页
为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的变异特征,利用RT-PCR、ORF5和部分NSP2基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒.分离的病毒株被鉴定为PRRSV美洲型,命名为XJ-Q株.该株病毒与香港分离株H... 为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的变异特征,利用RT-PCR、ORF5和部分NSP2基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒.分离的病毒株被鉴定为PRRSV美洲型,命名为XJ-Q株.该株病毒与香港分离株HK13亲缘关系最近,与国内变异株（HUB1和JXA1）同源性较为亲近.与美洲型标准毒株VR-2332相比,该分离株在481位和532～560位共有30个氨基酸缺失;与国内分离的PRRSV变异株相比,在487～489位有3个氨基酸的独特缺失.结果表明,新疆分离株为PRRSV美洲型,属于新缺失的PRRSV毒株. 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRS) orf5基因 NSP2基因 序列分析
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猪IL-2真核表达质粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗诱导小鼠细胞免疫增强作用的研究 被引量：7
14
作者 陈希文 程安春 +6 位作者 汪铭书 希尼尼根 豆文波 张平英 李雪梅 王刚 刘伍梅 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期60-63,共4页
目的 :研究猪白细胞介素 2真核表达质粒 (pcDNA IL 2 )对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )诱导BALB/c小鼠产生细胞免疫应答的影响。方法 :用pcDNA IL 2与PRRSVORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )共同免疫BALB/c小... 目的 :研究猪白细胞介素 2真核表达质粒 (pcDNA IL 2 )对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )诱导BALB/c小鼠产生细胞免疫应答的影响。方法 :用pcDNA IL 2与PRRSVORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )共同免疫BALB/c小鼠 ,以空载质粒pcDNA为阴性对照 ,PBS为空白对照 ;采用流式细胞仪 (FACS)、淋巴细胞增殖试验(MTT法 )分别对小鼠外周血中CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞数和淋巴细胞的转化功能进行了检测。结果 :pcDNA IL 2与pcDNA PRRSV ORF5共同免疫小鼠后外周血对ConA有明显的反应性 ,CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞数在免疫后 7天显著超过对照组 ,共同组与单独pcDNA PRRSV ORF5组有显著差异 (P <0 0 1)。结论 :pcDNA PRRSV ORF5免疫小鼠能够诱导其机体产生良好的细胞免疫应答 ,猪pcDNA IL 2能够显著增强pcDNA PRRSV ORF5诱导小鼠细胞免疫的能力。 展开更多
关键词 猪白细胞介素2真核表达质粒 猪繁殖与呼吸综合征病毒orf5基因疫苗 细胞免疫 小鼠
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豫西地区PRRSV新近流行株ORF5基因变异及Nsp2基因特征分析 被引量：4
15
作者 张明亮 张春杰 +5 位作者 程相朝 赵星灿 李银聚 吴庭才 李正 杨宁宁 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2012年第1期137-141,共5页
为研究豫西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)新近流行株ORF5基因的变异情况及Nsp2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了26份近期采自豫西地区猪场疑似PRRS猪肺脏样品中的ORF5全序列和Nsp2部分序列,并对其生物信息学和结构进行了分析... 为研究豫西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)新近流行株ORF5基因的变异情况及Nsp2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了26份近期采自豫西地区猪场疑似PRRS猪肺脏样品中的ORF5全序列和Nsp2部分序列,并对其生物信息学和结构进行了分析。结果表明:成功扩增出的21株PRRSV流行株间ORF5全基因同源性为96.6%～100%,氨基酸同源性为97.5%～100%;与参考毒株JXA1、MLV、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为96.6%～98.9%、88.4%～89.2%、88.0%～89.5%和66.8%～67.3%;对阳性病料进行了部分Nsp2基因的扩增,测序结果显示,所有流行株的Nsp 2基因与已报道的美洲株VR-2332相比,不存在核苷酸的插入或突变,但存在2个位点共90个碱基的缺失;遗传衍化分析表明,流行毒株属于美洲型。研究结果揭示了豫西地区新近流行的PRRSV ORF5基因的变异情况及Nsp 2基因的特征,为该地区的PRRS防控工作提供了理论依据。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 流行株 orf5基因 NSP2基因 变异分析
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猪戊型肝炎病毒swCH-GS189株ORF2基因的克隆及序列分析 被引量：4
16
作者 郝宝成 兰喜 +1 位作者 柳纪省 胡永浩 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期122-126,共5页
为进行猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2基因特征研究,参照GenBank中已发表的戊型肝炎病毒(HEV)核酸序列,设计了一对扩增HEVORF2基因的引物,利用RT-PCR等方法克隆出了一株猪戊型肝炎病毒甘肃分离株GS189的ORF2基因cDNA片段。序列测定结果表明,sw... 为进行猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2基因特征研究,参照GenBank中已发表的戊型肝炎病毒(HEV)核酸序列,设计了一对扩增HEVORF2基因的引物,利用RT-PCR等方法克隆出了一株猪戊型肝炎病毒甘肃分离株GS189的ORF2基因cDNA片段。序列测定结果表明,swCH-GS189株的ORF2基因长2 025 bp,编码674个氨基酸,与GenBank中公布的其它毒株间的核苷酸序列同源性为79.1%～91.8%,推导的氨基酸序列同源性为89.5%～98.8%。系统发育进化树结果表明,该分离株为基因Ⅳ型。 展开更多
关键词 戊型肝炎病毒 orf2基因 克隆 序列分析
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猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析 被引量：3
17
作者 宋长绪 赵亚华 +2 位作者 蒋智勇 王贵平 高向阳 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2005年第8期6-9,共4页
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从本室鉴定分离的PCV2GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因... 根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从本室鉴定分离的PCV2GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的ORF2基因核苷酸序列同源性在92.1%～99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%～99.5%之间。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型(PCV2) orf2基因 序列分析 猪圆环病毒2型 GD GENBANK 序列同源性 基区 基因序列 PCV2
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共表达猪IFN-γ基因对PPV VP2-PCV ORF2真核质粒的分子免疫佐剂效应研究 被引量：2
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作者 陈燕凌 徐志文 +3 位作者 郭万柱 朱玲 徐凯 唐玉香 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期1274-1280,共7页
将干扰素-γ、猪圆环病毒Ⅱ型ORF2主要抗原表位(47-85位AA)和猪细小病毒VP2基因克隆至pCI-neo真核载体中,构建重组质粒pCI-IFN-γ.ORF2.VP2。用脂质体介导法将其转染到MDBK细胞中,利用RT-PCR和间接免疫荧光法检测产物的表达情况。将重... 将干扰素-γ、猪圆环病毒Ⅱ型ORF2主要抗原表位(47-85位AA)和猪细小病毒VP2基因克隆至pCI-neo真核载体中,构建重组质粒pCI-IFN-γ.ORF2.VP2。用脂质体介导法将其转染到MDBK细胞中,利用RT-PCR和间接免疫荧光法检测产物的表达情况。将重组质粒pCI-IFN-γ.ORF2.VP2、pCI-ORF2.VP2、对照质粒pCI-neo、PBS、猪细小病毒灭活苗和猪圆环病毒亚单位疫苗通过肌肉注射免疫小鼠,检测小鼠不同时期的淋巴细胞转化功能、T淋巴细胞亚群动态变化情况以及PPV、PCV2抗体水平。试验结果显示,在转染重组质粒的MDBK细胞中能扩增到ORF2-VP2和IFN-γ基因;转染后48h用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达。pCI-IFN-γ.ORF2.VP2免疫组从第7天开始脾淋巴细胞对ConA有明显反应,显著高于对照组和PCI-ORF2.VP2免疫组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组和pCI-ORF2.VP2免疫组;在免疫后第14天检测到PPV PCV抗体。结果表明,pCI-IFN-γ.ORF2.VP2能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2基因 猪圆环病毒 orf2基因 IFN-Γ基因
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两步化学转化法构建猪圆环病毒2型ORF2基因重组腺病毒质粒 被引量：3
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作者 郭全海 陈陆 +4 位作者 王川庆 吴德峰 李志娟 王永生 刘扬科 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2010年第5期48-50,共3页
为了利用化学转化法快速构建携带猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒质粒以便获得表达该基因的重组腺病毒,首先把骨架质粒pAdeasy-1通过化学法转化到氯化钙法制备的E.coliB J5183感受态菌中,通过含氨苄青霉素的LB平板筛选出含骨架质粒... 为了利用化学转化法快速构建携带猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒质粒以便获得表达该基因的重组腺病毒,首先把骨架质粒pAdeasy-1通过化学法转化到氯化钙法制备的E.coliB J5183感受态菌中,通过含氨苄青霉素的LB平板筛选出含骨架质粒的阳性菌B J5183/p,再次用化学法把插入有猪圆环病毒2型ORF2基因的穿梭质粒rpShuttle-CMV-276经Pm eⅠ酶切线性化后转化到B J5183/p感受态细胞中进行同源重组,再在含卡那霉素的LB平板上培养,筛选出卡那霉素抗性菌进行质粒抽提纯化,酶切并电泳鉴定,获得重组阳性质粒rPAD-276。结果表明,运用2步化学转化法构建重组腺病毒质粒是一种简便、快捷且容易操作的方法。 展开更多
关键词 化学转化法 猪圆环病毒2型orf2基因 重组 腺病毒质粒 构建
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河北地区猪圆环病毒二型ORF2基因片段的克隆与原核表达 被引量：4
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作者 张秀珊 曹洪战 +3 位作者 张丽青 刘涛 陈赛娟 孙继国 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2008年第4期51-54,共4页
以PCV2 PK-15细胞毒提取的DNA为模板,用PCR扩增PCV2ORF2基因的后部约600 bp片段;对PCR产物回收纯化后与载体pMD19-T进行连接、转化,经酶切和序列分析后亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-ORF2,转入大肠埃希氏菌BL2... 以PCV2 PK-15细胞毒提取的DNA为模板,用PCR扩增PCV2ORF2基因的后部约600 bp片段;对PCR产物回收纯化后与载体pMD19-T进行连接、转化,经酶切和序列分析后亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-ORF2,转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳和Western-Blotting分析。结果表明,重组表达质粒在大肠中所表达的融合蛋白相对分子量为40 kDa,Western-blotting分析表明该蛋白具有PCV2抗原性。 展开更多
关键词 猪圆环病毒二型 orf2基因片段 克隆 原核表达
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