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可生物素化HLADRB1＊07：01蛋白的原核表达和纯化
1
作者 李敏英 李文 陶爱林 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2018年第7期1080-1084,共5页
目的诱导表达可生物素化的人类白细胞抗原HLA-DRB1~*07:01蛋白,以制备MHC四聚体,为后续研究肽段与MHCⅡ的结合力、检测抗原特异性T细胞提供必要工具。方法从Gen Bank中获得HLA-DRB1~*07:01的c DNA序列,人工合成基因片段时,α链、β链的... 目的诱导表达可生物素化的人类白细胞抗原HLA-DRB1~*07:01蛋白,以制备MHC四聚体,为后续研究肽段与MHCⅡ的结合力、检测抗原特异性T细胞提供必要工具。方法从Gen Bank中获得HLA-DRB1~*07:01的c DNA序列,人工合成基因片段时,α链、β链的跨膜区加入亮氨酸拉链,其中β链还在跨膜区加入Avi标签。α链和β链分别与表达载体p ET-44a和p ETduet-1-Bira连接后转入大肠杆菌Rosetta构建原核表达体系,通过氨苄青霉素(Amp)抗性基因筛选,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得目的蛋白,并用免疫印迹法分析鉴定目的蛋白。结果成功构建了重组质粒p ET-44a-HLA-DRB1~*07:01α链和p ETduet-1-HLA-DRB1~*07:01β链-Bir A,0.25 mmol/L的IPTG可高效诱导目的蛋白表达,α链可被HLA-DRA抗体特异识别,目的蛋白可生物素化且可被链霉素特异识别。目的蛋白主要以包涵体形式表达,经反复洗涤可获得高纯度的蛋白。结论成功构建了HLA-DRB1~*07:01蛋白的原核表达系统,并得到纯化的可生物素化重组表达蛋白,为进一步制备HLA-肽四聚体奠定了实验基础。 展开更多
关键词 HLA-DRB1＊07:01 重组表达 可生物素化 MHC四聚体
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光敏蛋白G-Avitag融合蛋白介导生物素对山羊IgG特异性位点偶联标记研究
2
作者 杜悦 张玉敏 +3 位作者 马兰 李梦冉 杨洪鸣 唐金宝 《中国免疫学杂志》 北大核心 2025年第7期1777-1781,共5页
目的:构建蛋白G C3结构域与Avitag标签肽的3个光敏融合蛋白,介导生物素对山羊IgG特异性位点偶联标记。方法:化学合成含琥珀密码子的蛋白G C3结构域与1个、2个及3个Avitag标签肽的DNA序列,亚克隆至pTXB1质粒构建3个融合蛋白表达载体,分别... 目的:构建蛋白G C3结构域与Avitag标签肽的3个光敏融合蛋白,介导生物素对山羊IgG特异性位点偶联标记。方法:化学合成含琥珀密码子的蛋白G C3结构域与1个、2个及3个Avitag标签肽的DNA序列,亚克隆至pTXB1质粒构建3个融合蛋白表达载体,分别与pEVOL-pBpF质粒共转化至感受态菌E.coli BL21,利用遗传密码子扩展技术制备光敏C^(Bpa)-Avi‐tag、C^(Bpa)-(Avitag)_(2)及C^(Bpa)-(Avitag)_(3)融合蛋白,目的蛋白经金属亲和层析纯化、Avitag/BirA酶体系生物素化后,通过SDS-PAGE电泳、对照实验及竞争ELISA考察其与山羊IgG的共价偶联效率、偶联位点及偶联物抗原结合特性。结果:成功构建3个表达载体并表达设计的3个目的光敏融合蛋白,C^(Bpa)-Avitag、C^(Bpa)-(Avitag)_(2)、C^(Bpa)-(Avitag)_(3),分子量与理论值相符,生物素化融合蛋白C^(Bpa)-Bn与山羊IgG重链偶联效率为85%,且特异性偶联抗体Fc位点;偶联后抗体保持了其抗原结合活性。结论:成功构建了C^(Bpa)-Avitag、C^(Bpa)-(Avitag)_(2)及C^(Bpa)-(Avitag)3融合蛋白,实现了生物素对山羊IgG的Fc位点偶联标记。 展开更多
关键词 蛋白G 山羊IgG 可生物素化标签肽 光亲和标记
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HLA-A＊0201-BSP融合基因的构建与原核表达 被引量：1
3
作者 孙万军 杜建芳 +6 位作者 徐东刚 邹民吉 王金凤 蔡欣 王颖 王嘉玺 艾辉胜 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2006年第5期976-980,共5页
克隆表达可生物素化的HLA-A*0201的重链胞外区是制备HLA-A*0201-肽四聚体的先决条件。本研究构建重组HLA-A*0201-BSP融合基因的表达载体,以制备HLA-A2四聚体。根据已报道的序列设计特异引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从已鉴定... 克隆表达可生物素化的HLA-A*0201的重链胞外区是制备HLA-A*0201-肽四聚体的先决条件。本研究构建重组HLA-A*0201-BSP融合基因的表达载体,以制备HLA-A2四聚体。根据已报道的序列设计特异引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从已鉴定为HLA-A*0201基因型的健康人白细胞中克隆HLA-A*0201重链胞外区的基因,拼接上依赖生物素-蛋白连接酶(biotin-proteinligase,BirA)的可生物素化序列(BirAsubstratepep-tide,BSP),构建HLA-A*0201-BSP的原核表达载体,在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果表明:成功扩增出HLA-A*0201-BSP融合基因并测序证实,构建的pBV220-HLA-A*0201-BSP可在大肠杆菌DH5α中高效表达HLA-A*0201-BSP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的28%,以包涵体的形式表达,经洗涤、变性后,以SepharcylS-300HR(S-300)柱层析纯化,纯度可达90%以上。结论:获得了高效表达HLA-A*0201-BSP的大肠杆菌工程菌株,建立了简便有效的包涵体纯化方法,为制备HLA-A*0201-肽四聚体奠定了基础。 展开更多
关键词 HLA—A＊0201 HLA—A＊0201-BSP融合基因 HLA—A2四聚体 可生物素化序列
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