斑点叉尾鮰病毒ORF6基因的高效可溶表达及抗原性分析 被引量：1

1

作者 刘玉林 王卫民 +1 位作者 王敏 李莉娟 《湖北农业科学》 北大核心 2011年第5期1001-1003,1048,共4页

利用GST融合基因表达系统表达GST-GP6融合蛋白,以质粒pMD19-T-ORF6为模板,扩增出ORF6基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2,将所构建的重组质粒pGEX-4T-2-ORF6转化E.coli ER2566,并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得... 利用GST融合基因表达系统表达GST-GP6融合蛋白,以质粒pMD19-T-ORF6为模板,扩增出ORF6基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2,将所构建的重组质粒pGEX-4T-2-ORF6转化E.coli ER2566,并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行10%SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果表明,大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-GP6融合蛋白相符,表达产物以可溶的形式存在。Western blot分析表明,融合蛋白能够与斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。 展开更多

关键词 斑点叉尾鮰病毒 ORF6基因 高效可溶表达 抗原性

在线阅读 下载PDF 职称材料

H9N2禽流感病毒HA全长基因的高效可溶表达及免疫原性研究

2

作者 谢青梅 李少璃 +4 位作者 陈丽 周庆丰 马静云 毕英佐 曹永长 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期93-96,共4页

采用RT-PCR方法扩增了H9N2亚型禽流感病毒(AIV)广东株的血凝素基因HA.将HA基因克隆到笔者所设计的原核表达载体pMBX上,成功构建重组表达质粒pMBX-HA.将其转化到E.coliBL-21感受态细胞中表达,经SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为96 200... 采用RT-PCR方法扩增了H9N2亚型禽流感病毒(AIV)广东株的血凝素基因HA.将HA基因克隆到笔者所设计的原核表达载体pMBX上,成功构建重组表达质粒pMBX-HA.将其转化到E.coliBL-21感受态细胞中表达,经SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为96 200的融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的29.5%.经蛋白可溶性分析看出,融合蛋白90%以上是以可溶形式表达的.W estern-b lot证实,可溶表达的融合蛋白与H9N2 AIV阳性血清具有良好的免疫反应性.将可溶表达的融合蛋白用体积分数为50%的N i-NTA树脂过柱纯化,用融合蛋白作抗原,通过ELISA方法,能特异性地检测出禽流感阳性血清. 展开更多

关键词 禽流感病毒 HA基因 高效可溶表达 免疫原性

在线阅读 下载PDF 职称材料

星海链霉菌卤化酶重组蛋白在大肠杆菌中可溶表达

3

作者 王玉梅 赵心清 +1 位作者 马昱澍 魏东芝 《大连理工大学学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第3期278-284,共7页

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是表达异源蛋白的良好宿主,但常遇到蛋白表达产物不可溶的困难.在对来自星海链霉菌的卤化酶基因sinH进行大肠杆菌异源表达时,为克服蛋白表达产物可溶性低的问题,探讨了不同载体对蛋白可溶表达的影响.... 大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是表达异源蛋白的良好宿主,但常遇到蛋白表达产物不可溶的困难.在对来自星海链霉菌的卤化酶基因sinH进行大肠杆菌异源表达时,为克服蛋白表达产物可溶性低的问题,探讨了不同载体对蛋白可溶表达的影响.利用pET28a进行SinH表达时不能得到可溶的目标蛋白;使用含有泛素标签及内含肽的载体pHUIE实现了卤化酶蛋白SinH的可溶表达,但纯化后纯度不高;利用带有链霉菌分子伴侣蛋白基因的载体pET28a-SinH与pETcoco-pL1SL2在E.coli BL21(DE3)中共表达,在30℃,0.1mmol/L IPTG诱导条件下表达4h,成功获得大量可溶蛋白,使用亲和层析(Ni-NTA)纯化,获得了较纯的目标蛋白SinH,上述研究结果为在大肠杆菌中进行其他链霉菌蛋白的可溶表达提供了参考. 展开更多

关键词 卤化酶 星海链霉菌 可溶表达 泛素标签 链霉菌分子伴侣 共表达体系 蛋白纯化

在线阅读 下载PDF 职称材料

相容性溶质支持下重组免疫毒素的周质腔可溶表达及葡萄糖对其表达的影响 被引量：3

4

作者 任永明 张明生 +3 位作者 何丹 晁开 罗耀武 黄华樑 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期40-44,共5页

在基因工程的实践中,包含体的形成是人们利用大肠杆菌表达外源蛋白的一大难题。本文报道了利用山梨醇、甜菜碱等相容性溶质,在高盐胁迫下,实现了重组免疫毒素在大肠杆菌周质腔中的可溶性表达。同时发现葡萄糖的加入时机对重组免疫毒素... 在基因工程的实践中,包含体的形成是人们利用大肠杆菌表达外源蛋白的一大难题。本文报道了利用山梨醇、甜菜碱等相容性溶质,在高盐胁迫下,实现了重组免疫毒素在大肠杆菌周质腔中的可溶性表达。同时发现葡萄糖的加入时机对重组免疫毒素的表达量有重要的影响。 展开更多

关键词 相容性溶质 重组免疫毒素 周质腔 可溶表达 葡萄糖

在线阅读 下载PDF 职称材料

二硫键异构酶DsbC介导重组瑞替普酶在E.coli中可溶表达 被引量：3

5

作者 禚孝发 关怡新 姚善泾 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第3期600-606,共7页

瑞替普酶(reteplase)是第三代溶血栓药物,其结构中含有9对二硫键,因而重组瑞替普酶在E.coli中表达时极易形成包涵体。研究引入二硫键异构酶Dsb C介导瑞替普酶折叠过程中错配二硫键的异构,从而促进其在E.coli中的可溶表达。首先分别构建... 瑞替普酶(reteplase)是第三代溶血栓药物,其结构中含有9对二硫键,因而重组瑞替普酶在E.coli中表达时极易形成包涵体。研究引入二硫键异构酶Dsb C介导瑞替普酶折叠过程中错配二硫键的异构,从而促进其在E.coli中的可溶表达。首先分别构建了reteplase、Dsb C表达载体p BAD/His A-R及p ACYCDuet-1-Dsb C,并共转化入E.coli BL21菌株,获得了瑞替普酶的Dsb C共表达体系。在此基础上,考察了发酵过程中诱导方式及时间、培养温度、诱导剂浓度对瑞替普酶可溶表达量的影响。在37℃、200 r·min-1的条件下培养到OD600值为0.6左右时,加入0.1 mmol·L-1的IPTG诱导二硫键异构酶Dsb C的表达;在25℃、160 r·min-1的条件下培养1 h后,加入0.5 g·L-1的L-阿拉伯糖诱导目标蛋白瑞替普酶表达,继续培养10 h收获菌体,结果表明近60%的瑞替普酶实现了可溶表达,其产量约为70 mg·L-1发酵液,用平板溶圈法测得纯化后瑞替普酶的活性为2.35×105 IU·mg-1。通过共表达二硫键异构酶Dsb C实现了瑞替普酶在E.coli中的可溶表达,有助于瑞替普酶的临床及折叠机理研究,对其他富含二硫键的重组蛋白质生产具有一定的指导意义。 展开更多

关键词 瑞替普酶 二硫键异构酶 DSBC 共表达 可溶表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组人白细胞介素-2的原核可溶表达 被引量：3

6

作者 李冠英 李海红 +1 位作者 徐士勋 潘晓雨 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期107-110,共4页

为探索白细胞介素-2在大肠杆菌中的可溶表达及其生物学活性,利用载体p MAL-c5x将rh IL-2与MBP融合,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导MBP-rh IL2的表达。接着用Amylose树脂将MBP-rh IL2纯化,最后利用Factor Xa蛋白酶将rh IL-2从融合蛋白中释放... 为探索白细胞介素-2在大肠杆菌中的可溶表达及其生物学活性,利用载体p MAL-c5x将rh IL-2与MBP融合,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导MBP-rh IL2的表达。接着用Amylose树脂将MBP-rh IL2纯化,最后利用Factor Xa蛋白酶将rh IL-2从融合蛋白中释放。结果显示:MBP-rh IL2以可溶形式表达;Factor Xa成功将rh IL-2从融合蛋白中释放出来;经生物学活性测定,其比活性为4.4×106IU/mg。 展开更多

关键词 白细胞介素-2 可溶表达 蛋白纯化

在线阅读 下载PDF 职称材料

人源磷脂酶PLA2异源可溶表达纯化及酶学分析 被引量：1

7

作者 马文君 滕琳 +4 位作者 田顺利 郭校燕 王培培 郑春阳 卫宏远 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2021年第2期70-75,82,共7页

为实现人源磷脂酶A2的原核异源可溶表达,并对其进行纯化和初步的酶学性质分析。通过检索NCBI确定人源PLA2(PLA2G10),并将其构建于载体pET28a+上,并以麦芽糖结合蛋白(MBP)为促溶标签,成功构建载体pET28a-MBP-PLA2,转化E.coli BL21(DE3)后... 为实现人源磷脂酶A2的原核异源可溶表达,并对其进行纯化和初步的酶学性质分析。通过检索NCBI确定人源PLA2(PLA2G10),并将其构建于载体pET28a+上,并以麦芽糖结合蛋白(MBP)为促溶标签,成功构建载体pET28a-MBP-PLA2,转化E.coli BL21(DE3)后,经PTG低温诱导表达,SDS-PAGE鉴定后,确认其在上清中大量表达。根据蛋白的性质建立了一整套蛋白纯化工艺,包括Q柱洗脱,硫酸铵盐析,Phenyl柱纯化,Amylose柱纯化,分离纯化获得重组酶,SDS-PAGE测定该酶纯度大于90%。以卵磷脂为底物,酸碱滴定法测定其比活为127.04 U/mg,纯化得率48.8%,纯化倍数为10.3倍。酶学性质研究表明,该酶的分子量为56.5 kDa,最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.0,是钙离子依赖酶,对PC亲和能力最强,Km值为12.2 mmol/L,V(max)为0.19 mmol/L/min。本试验建立的磷脂酶A2的异源表达、纯化体系,为其进一步的理论和工业研究奠定了基础。 展开更多

关键词 人磷脂酶A2 载体构建 异源可溶表达 蛋白纯化 活性测定

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组人汗腺抗菌素蛋白的异源可溶表达、发酵优化及分离纯化研究 被引量：1

8

作者 马文君 郭校燕 +3 位作者 滕琳 王培培 卫宏远 郑春阳 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2021年第9期114-121,共8页

目的:实现人汗腺抗菌素(Dermcidins,DCD-1L)的原核异源可溶表达,并进行纯化及活性分析。方法:首先检索NCBI确定人DCD-1L的序列,构建载体并转化E.coli ER2566,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后,进行SDS-PAGE电泳进行鉴定。其次,通... 目的:实现人汗腺抗菌素(Dermcidins,DCD-1L)的原核异源可溶表达,并进行纯化及活性分析。方法:首先检索NCBI确定人DCD-1L的序列,构建载体并转化E.coli ER2566,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后,进行SDS-PAGE电泳进行鉴定。其次,通过单因素实验,对不同温度、转速和补料速度等发酵条件进行研究与优化,根据DCD-1L蛋白特性优化蛋白纯化工艺。最后采用质谱和牛津杯法对纯化的蛋白进行分子量和抗菌活性鉴定。结果:经SDS-PAGE凝胶检测,在上清中分子量处检测到条带,证明采用原核表达系统可实现人DCD-1L的可溶表达;通过单因素实验获得最佳DCD-1L的发酵条件为:37℃培养,转速400 r/min,开启蠕动泵以50 mL/30 min补料速度自动加入发酵罐中;研究还建立了包括超滤、Q柱洗脱和分子筛在内的一整套优化的蛋白纯化工艺,获得的产品纯度大于96%,总回收率18.4%;最后,通过牛津杯法检测,纯化的重组人DCD-1L在浓度为50μg/mL时,对表皮葡萄球菌这类革兰氏阳性菌较大肠杆菌具有更明显的抑菌活性。结论:本研究对重组人DCD-1L蛋白实现了原核可溶表达,并建立了稳定可靠的发酵、纯化工艺,并进行了初步的抗菌活性鉴定,为后续重组人DCD-1L蛋白的应用研究奠定了基础。 展开更多

关键词 人汗腺抗菌素 载体构建 异源可溶表达 发酵条件优化 蛋白纯化

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组人βNGF在大肠杆菌中的可溶表达、纯化及活性鉴定 被引量：5

9

作者 白羊 章永垒 +7 位作者 邹有土 黄奋飞 陈胜亮 阮卡 葛平辉 马燕玲 王明灶 陈星 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期202-207,共6页

旨在大肠杆菌中可溶表达重组人神经生长因子（Recombinant humanβnerve growth factor,rhβNGF）,并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定。成功扩增h NGFβ亚基基因,将其克隆入pMAL-c2X表达载体,构建了hβNGF-MBP的大肠杆菌表达体... 旨在大肠杆菌中可溶表达重组人神经生长因子（Recombinant humanβnerve growth factor,rhβNGF）,并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定。成功扩增h NGFβ亚基基因,将其克隆入pMAL-c2X表达载体,构建了hβNGF-MBP的大肠杆菌表达体系并进行诱导表达,表达产物经纯化后以Factor Xa酶切去除麦牙糖结合蛋白（MBP）,Western blot鉴定后以TF-1细胞法检测生物学活性。结果显示,pMAL-c2X-hβNGF经酶切和测序证实构建正确,25℃、180 r/min、0.5 mmol/L IPTG诱导下可溶表达hβNGF-MBP融合蛋白。hβNGF-MBP经Factor Xa酶切后可去除MBP标签,SDS-PAGE分析纯化的hβNGF位于13 k D左右,纯度可达95%。Western blot鉴定为hβNGF,结果表明,比活约为1×10~6 U/mg。在大肠杆菌中成功可溶表达hβNGF,并具有较高的生物学活性。 展开更多

关键词 人神经生长因子 大肠杆菌 可溶表达 生物学活性

在线阅读 下载PDF 职称材料

褶纹冠蚌铜锌超氧化物歧化酶的可溶性表达及其活性分析 被引量：7

10

作者 徐欢欢 范小勇 +2 位作者 马辉 胡宝庆 文春根 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期156-160,共5页

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,EC1.15.1.1,简称SOD）是机体细胞抵御氧化损伤最重要的酶类之一,广泛存在于需氧生物、耐氧生物及某些厌氧微生物中。目前已知的SOD主要分为三类,即Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD。其中,Cu/Zn-SOD主... 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,EC1.15.1.1,简称SOD）是机体细胞抵御氧化损伤最重要的酶类之一,广泛存在于需氧生物、耐氧生物及某些厌氧微生物中。目前已知的SOD主要分为三类,即Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD。其中,Cu/Zn-SOD主要存在于包括人类在内的所有真核生物的细胞浆内，是目前研究最多的一类；Mn—SOD主要存在于原核生物和真核生物的线粒体中： 展开更多

关键词 褶纹冠蚌 铜锌超氧化物歧化酶 可溶表达 活性测定 抗氧化作用

在线阅读 下载PDF 职称材料

GST-Exendin-4在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化 被引量：2

11

作者 张怡 周庆峰 +2 位作者 贾孟 张红绪 李成伟 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期155-159,共5页

为了制备GST-Exendin-4融合蛋白,以本实验室构建好的pET22b-Exendin-4为模板,通过PCR扩增出Exendin-4基因,酶切克隆入pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Exendin-4。经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL... 为了制备GST-Exendin-4融合蛋白,以本实验室构建好的pET22b-Exendin-4为模板,通过PCR扩增出Exendin-4基因,酶切克隆入pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Exendin-4。经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同浓度的IPTG和不同温度诱导下,经SDS-PAGE分析鉴定,表达出Mr约为30 kD的目的蛋白,灰度扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的29.9%,超声裂解后的上清通过Sepharose 4B亲和层析纯化、透析、除盐及冷冻干燥得到高纯度的目的蛋白。本研究成功制备了高纯度的GST-Exendin-4融合蛋白,为下一步进行目的蛋白大规模的生产打下了良好的基础。 展开更多

关键词 EXENDIN-4 融合蛋白 可溶表达 亲和纯化

在线阅读 下载PDF 职称材料

鸭源坦布苏病毒E蛋白的可溶性表达及免疫原性研究 被引量：2

12

作者 张琳 余斌 +3 位作者 刘跃生 张存 华炯钢 崔言顺 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2014年第4期6-9,共4页

用RT-PCR扩增鸭源坦布苏病毒YY5株的E蛋白基因片段,分别插入到表达载体pMBP-c、pET-GST、pET-His、pET-DsbA中,构建了一系列原核表达载体,转化人大肠杆菌E.coli Trans10或DE3(plysS)宿主菌。工程菌株经诱导后进行SDS-PAGE,结果显示MBP-... 用RT-PCR扩增鸭源坦布苏病毒YY5株的E蛋白基因片段,分别插入到表达载体pMBP-c、pET-GST、pET-His、pET-DsbA中,构建了一系列原核表达载体,转化人大肠杆菌E.coli Trans10或DE3(plysS)宿主菌。工程菌株经诱导后进行SDS-PAGE,结果显示MBP-E融合蛋白得到了有效表达并且以可溶性蛋白的形式存在,且能与自然感染康复的鸭源多抗和鼠源单抗反应。以MBP-E免疫小鼠制备的高免血清,在体外可以中和DDTMUV,中和抗体效价达到1:46。重组蛋白MBP-E具有良好的免疫反应原性、免疫原性和体外免疫保护特性,这为进一步研制DTMUV重组亚单位疫苗奠定基础。 展开更多

关键词 坦布苏病毒 囊膜蛋白 可溶表达 中和抗体

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用SUMO表达系统高效可溶性表达鸡传染性法氏囊病病毒VP3基因 被引量：5

13

作者 曲栗 尹杰超 +7 位作者 李宁 刘生伟 傅俊华 姚文兵 谷学佳 郝建权 任桂萍 李德山 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期199-202,共4页

为评价SUMO原核表达系统(pHisSUMO Express)对病毒基因的可溶性表达,本研究从人工接种发病的鸡传染性法氏囊病(IBD)的病料组织样品中提取总RNA,通过RT-PCR扩增IBD病毒(IBDV)VP3基因,并将其克隆于pHisSUMO中构建了重组表达质粒pHisSUMO-V... 为评价SUMO原核表达系统(pHisSUMO Express)对病毒基因的可溶性表达,本研究从人工接种发病的鸡传染性法氏囊病(IBD)的病料组织样品中提取总RNA,通过RT-PCR扩增IBD病毒(IBDV)VP3基因,并将其克隆于pHisSUMO中构建了重组表达质粒pHisSUMO-VP3,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)PlysS,经IPTG诱导,得到可溶性表达的融合蛋白SUMO-VP3。结果表明,该融合蛋白表达量占细菌总蛋白35%,经HisTrapTMFF crude column层析柱纯化后的SUMO-VP3蛋白可被SUMO蛋白酶Ⅰ有效切割,获得无标签的VP3蛋白,经western blot鉴定表明该VP3蛋白具有良好的抗原性。本研究表明pHisSUMO Express表达系统是高效可溶表达外源蛋白的有效工具,所表达的病毒蛋白具有良好的抗原性,为病原诊断抗原的研究和制备提供有效表达系统。 展开更多

关键词 SUMO 高效可溶表达 鸡传染性法氏囊病病毒 VP3基因

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组亲环蛋白A的可溶性表达 被引量：1

14

作者 闫啸 徐立仁 +1 位作者 关怡新 姚善泾 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期363-369,共7页

为获得高表达量的可溶亲环蛋白A(cyclophilin A,CypA),对重组CypA质粒表达和工程菌的培养过程进行研究.首先将pRSET-CypA质粒转入EscherichiacoliBL21菌株,获得表达CypA的重组工程菌;然后以2×YT为基本培养基,对培养基组成包括碳源... 为获得高表达量的可溶亲环蛋白A(cyclophilin A,CypA),对重组CypA质粒表达和工程菌的培养过程进行研究.首先将pRSET-CypA质粒转入EscherichiacoliBL21菌株,获得表达CypA的重组工程菌;然后以2×YT为基本培养基,对培养基组成包括碳源、氮源和氨苄青霉素浓度进行优化,并考察接种量和诱导条件(诱导剂浓度、诱导时机、诱导后培养时间)等对目标蛋白表达量的影响.结果表明:通过控制培养温度和转速可大大减少CypA包涵体的量;以甘露醇为碳源能显著提高目标蛋白的表达量;优化的培养基组成为蛋白胨16 g?L-1,酵母提取物10 g?L-1,NaCl 5 g?L-1,甘露醇10 g?L-1,Amp50 mg?L-1;在对数生长期中期OD600为1.3时加入1 mmol?L-1IPTG诱导,然后在30℃、180 r?min-1条件下继续培养9 h收获菌体;优化后目标蛋白CypA产量为66.7 mg?L-1发酵液,与优化前相比提高了76.6%. 展开更多

关键词 亲环蛋白A 可溶表达 培养优化

在线阅读 下载PDF 职称材料

骨形态发生蛋白-7在E.coli中的可溶性表达

15

作者 杨维琳 林陈水 《浙江工业大学学报》 CAS 2013年第1期61-64,共4页

骨形态发生蛋白-7(BMP-7)属于转化生长因子(TGF-β)家族中的成员,有很强的骨诱导作用.为了获得可溶性的rhBMP-7,利用SOE-PCR法获得链球菌G蛋白B1域(GB1)目的基因,构建GB1、连接肽、6His-tag、EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-7融合表... 骨形态发生蛋白-7(BMP-7)属于转化生长因子(TGF-β)家族中的成员,有很强的骨诱导作用.为了获得可溶性的rhBMP-7,利用SOE-PCR法获得链球菌G蛋白B1域(GB1)目的基因,构建GB1、连接肽、6His-tag、EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-7融合表达型载体,转化E.coliBL21(DE3).工程菌在28℃下经0.1mmol/L IPTG诱导后,可获得表观分子量约为28kD的以可溶形式表达的GB1-BMP-7融合蛋白. 展开更多

关键词 骨形态发生蛋白-7(BMP-7) 链球菌G蛋白B1域(GB1) SOE-PCR法 可溶表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

热纤梭菌耐热葡聚糖外切酶的克隆表达及酶学特性分析

16

作者 王珊珊 刘阳 +3 位作者 任艳艳 王令 路宏朝 张涛 《饲料研究》 CAS 北大核心 2024年第5期82-88,共7页

研究旨在开发耐热纤维素酶,以提高畜禽对纤维素饲料的利用率和养殖经济效益。从蛋白质信息数据库UniProt中获取热纤梭菌(Clostridium thermocellum)葡聚糖外切酶CelS的序列信息,经信号肽删除和密码子优化,利用大肠杆菌表达系统,实现了C... 研究旨在开发耐热纤维素酶,以提高畜禽对纤维素饲料的利用率和养殖经济效益。从蛋白质信息数据库UniProt中获取热纤梭菌(Clostridium thermocellum)葡聚糖外切酶CelS的序列信息,经信号肽删除和密码子优化,利用大肠杆菌表达系统,实现了CelS的过量表达。通过自诱导表达条件优化,有效提高了CelS可溶表达的比例。将胞内上清液通过镍离子亲和层析和热处理分离纯化获得可溶CelS,将胞内沉淀通过洗涤、变性和复性后获得包涵体复性CelS。酶学特性检测发现,两种表达形式CelS的酶活力无显著性差异,最适反应温度均为70℃,最适反应pH值为5.5~6.0,对无定形纤维素(PASC)的活性最高,对结晶纤维素(Avicel)和玉米秸秆(CS)次之。CelS与海栖热袍菌(Thermotoga maritima)葡聚糖内切酶EG12B协同作用水解CS,比单独水解酶活力提高了81.8%。试验结果表明,重组CelS表现出优越的耐热性能和纤维素水解活性,为进一步开发酶制剂提供了有力支持,有利于提高纤维素饲料的利用率。 展开更多

关键词 热纤梭菌 葡聚糖外切酶 可溶表达 包涵体 酶学特性

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组C型肉毒梭菌毒素的表达与免疫保护性分析 被引量：2

17

作者 杜吉革 姚文生 +7 位作者 刘莹 薛麒 李倩琳 朱真 李启红 印春生 陈小云 李旭妮 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第4期1381-1387,共7页

本研究旨在获得重组C型肉毒梭菌毒素蛋白,并评价其免疫保护性。将麦芽糖蛋白(MBP)和C型肉毒梭菌毒素重链C末端(CHC)的编码基因序列进行优化和串联,获得基因片段GMBPCHC。将GMBPCHC克隆至pET28a-(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,... 本研究旨在获得重组C型肉毒梭菌毒素蛋白,并评价其免疫保护性。将麦芽糖蛋白(MBP)和C型肉毒梭菌毒素重链C末端(CHC)的编码基因序列进行优化和串联,获得基因片段GMBPCHC。将GMBPCHC克隆至pET28a-(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,分别在15和37℃两种温度条件下诱导表达。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的目的蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白rMBPCHC。将rMBPCHC与Montanide ISA 201佐剂混合制备成疫苗,免疫4只家兔,剂量为100μg/只。根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免后21 d及二免后14 d家兔血清的中和抗体效价。同时,在二免后14 d对家兔进行攻毒。结果表明,rMBPCHC在37℃的诱导温度下,主要以包涵体的形式表达;在15℃的诱导温度下,可溶性表达的比例可达50%。一次免疫后,免疫组4只家兔血清对C型肉毒梭菌天然毒素(简称天然毒素)的中和效价均可达到1(0.1 mL血清中和1个小鼠最小致死量(MLD)的天然毒素)。二免后,家兔血清的中和抗体效价可达到4~8。用10个家兔MLD的天然毒素攻毒后,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护,而用1个家兔MLD的天然毒素攻毒后,对照组家兔100%(2/2)死亡。以上结果说明,rMBPCHC具有良好的免疫原性,从而为C型肉毒梭菌病基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。 展开更多

关键词 C型肉毒梭菌毒素 C末端 可溶表达 免疫保护

在线阅读 下载PDF 职称材料

细菌脂肪氧合酶酶学性质分析及表达优化 被引量：1

18

作者 庞翠萍 刘松 +2 位作者 周景文 张国强 李江华 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2020年第19期1-8,共8页

脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)是一类含有非血红素铁的双加氧酶,在食品、医药和化工等行业具有广泛应用。利用Escherichia coli BL21(DE3)重组表达来源于Pseudomonas aeruginosa和Burkholderia thailandensis的脂肪氧合酶PaLOX、BtLOX,... 脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)是一类含有非血红素铁的双加氧酶,在食品、医药和化工等行业具有广泛应用。利用Escherichia coli BL21(DE3)重组表达来源于Pseudomonas aeruginosa和Burkholderia thailandensis的脂肪氧合酶PaLOX、BtLOX,并对其酶学性质进行比较分析。通过对酶学性质分析发现:PaLOX、BtLOX的最适反应温度分别为25和35℃;最适反应pH分别为7.0和7.5。PaLOX的K_(cat)/K_m较BtLOX高16.7倍,展现出更好的开发应用潜力。为优化PaLOX的可溶性表达,采取了2种优化策略:首先利用乳糖作为诱导剂代替异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG),使胞内酶活力提高了1.53倍,可溶表达水平提高了2.41倍;进一步与触发因子(triggering factor,TF)融合表达,TF-PaLOX酶活力提高了1.85倍,可溶表达水平提高3.19倍。该研究通过分析细菌来源脂肪氧合酶酶学性质及优化表达条件,为脂肪氧合酶的高效生产及应用提供了重要参考。 展开更多

关键词 脂肪氧合酶 酶学性质 可溶表达 触发因子

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组缩胆囊素融合蛋白制备及其免疫原性研究 被引量：1

19

作者 刘洁珠 毕英佐 +1 位作者 薛春宜 曹永长 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期70-74,共5页

成功扩增了猪缩胆囊素(CCK)基因C末端片段,并在大肠杆菌中成功表达,SDS-PAGE检测到相对分子质量约为45 000的融合蛋白,最高表达量占菌体总蛋白的40.21%,蛋白可溶性分析表明,融合蛋白主要是以可溶性形式表达.Western-blotting证实,可溶... 成功扩增了猪缩胆囊素(CCK)基因C末端片段,并在大肠杆菌中成功表达,SDS-PAGE检测到相对分子质量约为45 000的融合蛋白,最高表达量占菌体总蛋白的40.21%,蛋白可溶性分析表明,融合蛋白主要是以可溶性形式表达.Western-blotting证实,可溶表达的融合蛋白能与CCK-8阳性血清具有良好的免疫反应性.以纯化后的蛋白为免疫原制备油乳剂疫苗免疫蛋鸡,结果表明,CCK蛋白可在鸡体内引起免疫反应,加强免疫后蛋鸡血清和卵黄中CCK抗体可维持在较高水平.为了研究含有CCK抗体的蛋黄粉对鸡生长性能的影响,将其作为添加剂饲喂20日龄肉鸡,试验结果表明,饲喂添加100和300 g/t含CCK抗体蛋黄粉的肉鸡与阴性对照组相比,试验全期体增质量分别提高2.34%、3.80%,采食量分别提高0.91%、2.65%,且对饲料体增质量比无显著影响. 展开更多

关键词 缩胆囊素 克隆 高效可溶表达 卵黄抗体 生长性能

在线阅读 下载PDF 职称材料

缩胆囊素主动免疫对猪生产性能的影响 被引量：1

20

作者 刘洁珠 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第21期12868-12870,12930,共4页

[目的]利用分子生物学技术扩增猪CCK基因活性片段,检验主动免疫CCK融合蛋白对肉猪生长是否有促进作用。[方法]采用RT-PCR技术成功扩增猪缩胆囊素基因C-端活性片段,并在大肠杆菌中进行表达。[结果]主动免疫0.5和1.5mg/mlCCK疫苗处理组肉... [目的]利用分子生物学技术扩增猪CCK基因活性片段,检验主动免疫CCK融合蛋白对肉猪生长是否有促进作用。[方法]采用RT-PCR技术成功扩增猪缩胆囊素基因C-端活性片段,并在大肠杆菌中进行表达。[结果]主动免疫0.5和1.5mg/mlCCK疫苗处理组肉猪,试验期肉猪平均日增重较空白对照组分别提高5.81%和7.36%(P<0.05),采食量分别提高4.04%和2.53%。利用SDS-PAGE可获得相对分子质量45000的融合蛋白。融合蛋白主要以可溶形式表达。Wesrtern Blot证实融合蛋白与CCK-8阳性血清具有良好的免疫反应性。[结论]主动免疫CCK对肉猪生长具有一定促进作用。 展开更多

关键词 缩胆囊素 克隆 高效可溶表达 肉猪 生长性能

在线阅读 下载PDF 职称材料