建立一种荧光染料叠氮溴化丙锭(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的技术,同时利用羟基萘酚蓝(HNB)染料对婴儿配方奶粉中沙门氏菌活菌进行快速可视化检测。以沙门氏菌siiA基因为靶点,设计特异性引物,利用PMA抑制死菌DNA的扩增反应,反应...建立一种荧光染料叠氮溴化丙锭(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的技术,同时利用羟基萘酚蓝(HNB)染料对婴儿配方奶粉中沙门氏菌活菌进行快速可视化检测。以沙门氏菌siiA基因为靶点,设计特异性引物,利用PMA抑制死菌DNA的扩增反应,反应前向体系中加入HNB染料,通过颜色变化对目标菌进行快速检测。结果表明,PMA的最佳处理浓度为3μg/mL,体系中HNB的最优浓度为150μmol/L,所构建的PMA-LAMP-HNB方法对沙门氏菌纯培养物的检测灵敏度为4.6×10^1CFU/mL,对人工污染婴儿配方奶粉中该菌的检测灵敏度为6.3×10^1CFU/g,是传统PCR方法的100倍,且总检测时间不超过1 h 30 min。展开更多
【目的】将改良版叠氮溴化丙锭(improved propidium monoazide,PMAxx)与微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术相结合,建立一种针对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)活菌的检测方法。【方法】对PMAxx终浓度...【目的】将改良版叠氮溴化丙锭(improved propidium monoazide,PMAxx)与微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术相结合,建立一种针对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)活菌的检测方法。【方法】对PMAxx终浓度、暗处理时间及曝光时间进行优化,建立最佳的PMAxx-ddPCR检测体系,并用不同体积比的LM活菌验证其准确性,考察PMAxx-ddPCR检测方法的特异性、灵敏性和重复性。用不同浓度LM活菌与死菌对奶酪棒样品进行人工污染,比较传统的平板计数法和作者建立的PMAxx-ddPCR检测方法的结果;进一步对市售金针菇和火腿肠进行检测,评估PMAxx-ddPCR检测方法的实际效果。【结果】在PMAxx终浓度为10μmol/L、暗处理时间和曝光时间均为10 min时,PMAxx可显著抑制死菌DNA扩增,但对活菌DNA扩增没有显著影响。建立的PMAxx-ddPCR检测方法仅对LM产生特异性扩增,定量限为147 CFU/mL,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于20%,重复性较好。人工污染奶酪棒试验结果表明,平板计数法和PMAxx-ddPCR检测方法对LM的定量结果差异不显著(P>0.05)。进一步分析17份金针菇和16份火腿肠样品检测结果,PMAxx-ddPCR检测法和平板计数法均从7份金针菇样品中检出LM,且2种方法定量结果没有显著差异(P>0.05)。【结论】作者建立的LM活菌的PMAxx-ddPCR检测方法可对食品中LM活菌进行特异性定量检测。展开更多
文摘建立一种荧光染料叠氮溴化丙锭(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的技术,同时利用羟基萘酚蓝(HNB)染料对婴儿配方奶粉中沙门氏菌活菌进行快速可视化检测。以沙门氏菌siiA基因为靶点,设计特异性引物,利用PMA抑制死菌DNA的扩增反应,反应前向体系中加入HNB染料,通过颜色变化对目标菌进行快速检测。结果表明,PMA的最佳处理浓度为3μg/mL,体系中HNB的最优浓度为150μmol/L,所构建的PMA-LAMP-HNB方法对沙门氏菌纯培养物的检测灵敏度为4.6×10^1CFU/mL,对人工污染婴儿配方奶粉中该菌的检测灵敏度为6.3×10^1CFU/g,是传统PCR方法的100倍,且总检测时间不超过1 h 30 min。
文摘【目的】将改良版叠氮溴化丙锭(improved propidium monoazide,PMAxx)与微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术相结合,建立一种针对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)活菌的检测方法。【方法】对PMAxx终浓度、暗处理时间及曝光时间进行优化,建立最佳的PMAxx-ddPCR检测体系,并用不同体积比的LM活菌验证其准确性,考察PMAxx-ddPCR检测方法的特异性、灵敏性和重复性。用不同浓度LM活菌与死菌对奶酪棒样品进行人工污染,比较传统的平板计数法和作者建立的PMAxx-ddPCR检测方法的结果;进一步对市售金针菇和火腿肠进行检测,评估PMAxx-ddPCR检测方法的实际效果。【结果】在PMAxx终浓度为10μmol/L、暗处理时间和曝光时间均为10 min时,PMAxx可显著抑制死菌DNA扩增,但对活菌DNA扩增没有显著影响。建立的PMAxx-ddPCR检测方法仅对LM产生特异性扩增,定量限为147 CFU/mL,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于20%,重复性较好。人工污染奶酪棒试验结果表明,平板计数法和PMAxx-ddPCR检测方法对LM的定量结果差异不显著(P>0.05)。进一步分析17份金针菇和16份火腿肠样品检测结果,PMAxx-ddPCR检测法和平板计数法均从7份金针菇样品中检出LM,且2种方法定量结果没有显著差异(P>0.05)。【结论】作者建立的LM活菌的PMAxx-ddPCR检测方法可对食品中LM活菌进行特异性定量检测。
