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肠毒性大肠埃希菌肠毒素LTa基因特异性EMA-PCR检测方法的建立
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作者 赵素君 曹冶 +6 位作者 谢晶 李江凌 王秋实 叶勇刚 罗丹丹 叶健强 廖党金 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第11期8-11,共4页
由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,为避免因样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,本研究根据肠毒性大肠埃希菌(ETEC)不耐热肠毒素LTa基因设计特异性引物,利用叠氮溴乙锭(EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PC... 由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,为避免因样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,本研究根据肠毒性大肠埃希菌(ETEC)不耐热肠毒素LTa基因设计特异性引物,利用叠氮溴乙锭(EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法。肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200均能扩增出大小为438bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。经EMA处理,除了完全死菌组外,含有10mL/L~1 000mL/L活菌的混合悬液均可扩增出目的片段。因此,成功建立了一种快速、有效的检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法,该方法较传统PCR大大提高了检测的准确性,灵敏度可达19cfu/mL。 展开更多
关键词 肠毒性大肠埃希菌 不耐热肠毒素基因 叠氮溴乙锭-聚合酶链反应 检测
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肠炎沙门氏菌EMA-PCR检测方法的建立 被引量:6
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作者 颜成英 汤晓艳 +3 位作者 王敏 康大成 李朋颖 郑锌 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第6期90-93,共4页
将荧光染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术相结合,用于肠炎沙门氏菌活菌的检测。实验参数优化结果表明,当EMA终质量浓度50μg/mL、曝光时间10 min时,可以抑制约107 CFU... 将荧光染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术相结合,用于肠炎沙门氏菌活菌的检测。实验参数优化结果表明,当EMA终质量浓度50μg/mL、曝光时间10 min时,可以抑制约107 CFU/mL肠炎沙门氏菌死菌DNA的扩增;活菌灵敏度检测结果显示,EMA-PCR方法检测限与单一PCR方法一样均为27.5 CFU/mL,说明EMA处理既不会影响活菌DNA的扩增也不会影响PCR方法的灵敏度。利用EMA-PCR方法检测死活混合菌液时发现,添加EMA的实验组DNA条带亮度会随着活菌比例的降低而变暗,且当样品中全是死菌时,没有目标条带出现;而不添加EMA的对照组DNA条带亮度没有变化,当样品中全是死菌时,目标条带依然清晰可见。说明添加EMA可以达到区分死活菌的目的,EMA-PCR方法只检测样品中的活菌,避免了死菌DNA造成假阳性的可能性。 展开更多
关键词 叠氮 聚合反应 肠炎沙门氏菌
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EMA-PCR法快速检测啤酒中腐败短乳杆菌 被引量:4
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作者 马艳琳 徐振波 +2 位作者 刘君彦 汪东风 邓阳 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第8期271-276,共6页
将叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术相结合,以酒花耐受基因hor C为靶基因,用啤酒腐败短乳杆菌基因组DNA作为模板进行扩增。结果发现,在前处理过程中加入EMA,当终质量浓... 将叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术相结合,以酒花耐受基因hor C为靶基因,用啤酒腐败短乳杆菌基因组DNA作为模板进行扩增。结果发现,在前处理过程中加入EMA,当终质量浓度小于20μg/m L时,对活的短乳杆菌中靶基因的扩增没有明显抑制作用;而当EMA终质量浓度为1.0μg/m L时可有效抑制10~5 CFU/m L短乳杆菌死细胞的扩增。本实验建立的EMA-PCR检测方法的灵敏度为10~4活细胞/m L酒液样品。验证实验结果表明,在13株乳酸菌中,建立的hor C特异性EMA-PCR能有效检测到其中的全部5株啤酒污染菌,同时可区分这5株菌的活/死细胞混合体系,降低检测过程中的假阳性。 展开更多
关键词 叠氮 聚合反应 啤酒腐败菌 短乳杆菌 酒花耐受基因
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PMA与PCR结合的细菌活细胞检测方法 被引量:28
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作者 罗剑飞 林炜铁 郭勇 《华南理工大学学报(自然科学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2010年第9期142-146,共5页
基于PCR的分子生物技术在检测过程中不能有效区分样品中细菌的死活状态,这会导致对细菌数量的错误估计.文中用叠氮溴化丙锭(PMA)对样品基因组提取进行前处理,使PMA与样品中死细胞的DNA分子共价交联,并抑制该DNA分子的PCR扩增.结果表明:... 基于PCR的分子生物技术在检测过程中不能有效区分样品中细菌的死活状态,这会导致对细菌数量的错误估计.文中用叠氮溴化丙锭(PMA)对样品基因组提取进行前处理,使PMA与样品中死细胞的DNA分子共价交联,并抑制该DNA分子的PCR扩增.结果表明:当样品中PMA质量浓度大于3μg/mL、曝光时间大于3 min时,PMA可抑制细胞膜破裂的E.coli死细胞DNA的PCR扩增;PMA质量浓度高于50μg/mL时对活细胞DNA的PCR扩增有一定影响;当浊度小于10NTU时,PMA能有效地抑制死细胞DNA的PCR扩增,而当浊度大于100NTU时,PMA失去效果. 展开更多
关键词 叠氮化丙 脱氧核糖核酸 聚合反应 活细胞检测
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荧光染料EMA在实时荧光PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用 被引量:7
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作者 祝儒刚 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第20期206-210,共5页
将荧光染料——叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时荧光-聚合酶链式反应(real-time poly-merase chain reaction,RT-PCR)技术相结合,对其在RT-PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用进行研究。纯培养条件下... 将荧光染料——叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时荧光-聚合酶链式反应(real-time poly-merase chain reaction,RT-PCR)技术相结合,对其在RT-PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用进行研究。纯培养条件下,在2.2×102~2.2×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且不添加EMA时的检测灵敏度(22CFU)略大于添加EMA(2.2×102CFU)时的检测灵敏度;人工污染牡蛎样品,利用RT-PCR和EMA RT-PCR以及平板计数法分别进行副溶血弧菌定量检测,结果表明EMA RT-PCR更接近于平板计数的结果,单纯RT-PCR定量的结果偏大;在采集的45份海产品样品中,不经富集培养,利用EMA RT-PCR方法仅有一份牡蛎样品呈阳性,牡蛎样品污染程度为114CFU/g。该方法能够快速、灵敏、准确地进行海产品中致病性副溶血弧菌活细胞的定量检测,具有很好的应用价值。 展开更多
关键词 叠氮(EMA) 实时荧光聚合反应(RT-PCR) 海产品 活细胞 副溶血弧菌检测
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