目的构建适于高通量筛选的激活素受体样激酶4(ALK4),ALK5和ALK7抑制剂的筛选模型。方法利用Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统,构建ALK4激酶结构域(ALK4kd),ALK5kd和ALK7kd及Smad2和Smad3蛋白的病毒表达系统,转染Sf9昆虫细胞,表达目的蛋白...目的构建适于高通量筛选的激活素受体样激酶4(ALK4),ALK5和ALK7抑制剂的筛选模型。方法利用Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统,构建ALK4激酶结构域(ALK4kd),ALK5kd和ALK7kd及Smad2和Smad3蛋白的病毒表达系统,转染Sf9昆虫细胞,表达目的蛋白;通过谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和柱纯化,获得纯化的目的蛋白;分别以纯化的ALK4,ALK5,ALK7激酶片段与纯化的Smad3和ATP构建ALK4,ALK5,ALK7激酶活性测定体系,优化各反应底物浓度及反应条件,建立适于通量化分析的筛选模型;以已知ALK激酶抑制剂SB431542为工具分子,检测其对激酶的抑制活性,确证筛选模型的可靠性。结果经酶切和PCR鉴定,所得重组Bacmid均正确。转染Sf9昆虫细胞后纯化获得相应目的蛋白。经条件优化,反应体系中激酶和底物蛋白Smad3最佳浓度均为10 mg·L^(-1),ATP最佳初始浓度为10 nmol·L^(-1)。所得ALK4,ALK5和ALK7激酶抑制剂筛选体系的Z′因子分别为0.71,0.51和0.74,符合高通量筛选要求。已知SB431542在所建模型上对ALK4kd,ALK5kd和ALK7kd的抑制活性IC50值分别为22,188和91 nmol·L^(-1)。结论成功构建了ALK4,ALK5和ALK7激酶抑制剂的体外筛选模型。展开更多
目的研究急性脑梗死患者血清高迁移率族蛋白B1(HMGBl)与外周血淋巴细胞过氧化小体增殖剂激活型受体γ(PPARγ)mRNA表达的变化,及二者与脑梗死体积的相关性。方法连续收集2010年7月—12月哈尔滨医科大学附属第二医院老年病科及神经内科...目的研究急性脑梗死患者血清高迁移率族蛋白B1(HMGBl)与外周血淋巴细胞过氧化小体增殖剂激活型受体γ(PPARγ)mRNA表达的变化,及二者与脑梗死体积的相关性。方法连续收集2010年7月—12月哈尔滨医科大学附属第二医院老年病科及神经内科就诊的发病3 d以内的急性脑梗死患者72例及对照人群70例。用ELISA法测定两组患者血清中HMGB1,用实时RT-PCR法测定两组患者空腹周围血淋巴细胞PPARγmRNA的表达情况。根据脑梗死患者发病后48～72 h CT检查结果,计算脑梗死体积。结果①梗死组患者PPA脚mRNA表达水平(0.54±0.37)低于对照组(1.98±0.35),血清HMGBl水平(12.7±6.1)μg/L高于对照组(2.2±0.8)μg/L,差异有统计学意义,P<0.01。②脑梗死患者周围血淋巴细胞PPA脚mRNA表达水平与血清HMGBl水平呈负相关,r=-0.843,P<0.01。③经相关性分析,脑梗死患者PPARγmRNA表达水平与脑梗死体积呈负相关,r=-0.886,P<0.01;脑梗死患者HMGB1水平和脑梗死体积呈正相关,r=0.847,P<0.01。结论在脑梗死急性期,PPARγ和HMGB1均参与脑缺血炎性反应,HMGB1及PPARγ脚mRNA表达水平可反映急性脑梗死患者梗死体积的大小。展开更多
目的探讨非诺贝特对人肝瘤细胞株(HepG2)细胞1型纤维酶原激活物抑制剂(PAI-1)表达的影响及机制。方法用不同浓度非诺贝特刺激HepG2细胞,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PAI-1mRNA水平,发色底物法检测PAI-1的活性变化。构建...目的探讨非诺贝特对人肝瘤细胞株(HepG2)细胞1型纤维酶原激活物抑制剂(PAI-1)表达的影响及机制。方法用不同浓度非诺贝特刺激HepG2细胞,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PAI-1mRNA水平,发色底物法检测PAI-1的活性变化。构建4个荧光素酶报告基因质粒,分别由PAI-1启动子序列从-804至+17间不同长度片段驱动,体外转染HepG2细胞,检测荧光素酶的活性。结果非诺贝特能使HepG2细胞PAI-1mRNA表达及蛋白活性显著降低,且呈一定剂量依赖性;还可使PAI-1转录活性显著降低;当转染质粒含有PAI-1启动子序列-636^+17、-449^+17-、276^+17 bp 3个片段时,荧光素酶活性显著增高;共转染过氧化体增殖物激活型受体α(PPARα)表达质粒(PPAR-αpSG5)的细胞在非诺贝特诱导下PAI-1转录活性显著降低。结论非诺贝特可以抑制HepG2细胞PAI-1mRNA表达及其活性,调节PAI-1的基因转录,PPARα参与非诺贝特对PAI-1基因的表达调控。展开更多
目的 :研究多发性骨髓瘤 ( MM)患者血浆尿激酶型纤溶酶原激活物 ( u- PA )及其可溶性受体 ( su PAR )的水平变化 ,并探讨其临床意义。方法 :用 ELISA法检测 34例 MM患者血浆 u- PA及 su PA R的浓度 ,同时观察其中6例 MM患者化疗前后血浆...目的 :研究多发性骨髓瘤 ( MM)患者血浆尿激酶型纤溶酶原激活物 ( u- PA )及其可溶性受体 ( su PAR )的水平变化 ,并探讨其临床意义。方法 :用 ELISA法检测 34例 MM患者血浆 u- PA及 su PA R的浓度 ,同时观察其中6例 MM患者化疗前后血浆 u- PA及 su PAR的浓度变化。结果 :MM患者血浆 u- PA及 su PA R水平均明显高于正常对照组 ,其中进展期 MM患者血浆 u- PA及 su PAR水平明显高于正常对照组和稳定期 MM患者 ( P <0 .0 1) ,而稳定期 MM患者血浆 u- PA及 su PA R水平与正常对照组无显著性差异 ( P>0 .0 5)。 6例 MM患者化疗后血浆 u- PA及 su PA R水平 ,明显低于化疗前血浆 u- PA及 su PAR水平 ( P<0 .0 5)。骨髓涂片瘤细胞比例 >2 0 %的 MM患者血浆 u- PA及 su PA R水平 ,明显高于瘤细胞比例≤ 2 0 % M M患者 ( P<0 .0 5;P<0 .0 1)。M M患者血浆 u- PA及su PA R水平均与骨髓瘤细胞百分比及血清球蛋白呈正相关 ,而与血清白蛋白呈负相关。结论 :血浆 u- PA及 su PA R水平升高可能与多发性骨髓瘤的发生、发展有密切关系 ;其水平可作为临床分期、判断疗效、了解疾病进展情况及预后的一个重要指标。展开更多
文摘目的研究急性脑梗死患者血清高迁移率族蛋白B1(HMGBl)与外周血淋巴细胞过氧化小体增殖剂激活型受体γ(PPARγ)mRNA表达的变化,及二者与脑梗死体积的相关性。方法连续收集2010年7月—12月哈尔滨医科大学附属第二医院老年病科及神经内科就诊的发病3 d以内的急性脑梗死患者72例及对照人群70例。用ELISA法测定两组患者血清中HMGB1,用实时RT-PCR法测定两组患者空腹周围血淋巴细胞PPARγmRNA的表达情况。根据脑梗死患者发病后48～72 h CT检查结果,计算脑梗死体积。结果①梗死组患者PPA脚mRNA表达水平(0.54±0.37)低于对照组(1.98±0.35),血清HMGBl水平(12.7±6.1)μg/L高于对照组(2.2±0.8)μg/L,差异有统计学意义,P<0.01。②脑梗死患者周围血淋巴细胞PPA脚mRNA表达水平与血清HMGBl水平呈负相关,r=-0.843,P<0.01。③经相关性分析,脑梗死患者PPARγmRNA表达水平与脑梗死体积呈负相关,r=-0.886,P<0.01;脑梗死患者HMGB1水平和脑梗死体积呈正相关,r=0.847,P<0.01。结论在脑梗死急性期,PPARγ和HMGB1均参与脑缺血炎性反应,HMGB1及PPARγ脚mRNA表达水平可反映急性脑梗死患者梗死体积的大小。
文摘目的探讨非诺贝特对人肝瘤细胞株(HepG2)细胞1型纤维酶原激活物抑制剂(PAI-1)表达的影响及机制。方法用不同浓度非诺贝特刺激HepG2细胞,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PAI-1mRNA水平,发色底物法检测PAI-1的活性变化。构建4个荧光素酶报告基因质粒,分别由PAI-1启动子序列从-804至+17间不同长度片段驱动,体外转染HepG2细胞,检测荧光素酶的活性。结果非诺贝特能使HepG2细胞PAI-1mRNA表达及蛋白活性显著降低,且呈一定剂量依赖性;还可使PAI-1转录活性显著降低;当转染质粒含有PAI-1启动子序列-636^+17、-449^+17-、276^+17 bp 3个片段时,荧光素酶活性显著增高;共转染过氧化体增殖物激活型受体α(PPARα)表达质粒(PPAR-αpSG5)的细胞在非诺贝特诱导下PAI-1转录活性显著降低。结论非诺贝特可以抑制HepG2细胞PAI-1mRNA表达及其活性,调节PAI-1的基因转录,PPARα参与非诺贝特对PAI-1基因的表达调控。
