【目的】人微小纤溶酶原是由261个氨基酸组成的肽链,位于人纤溶酶原第549~790位,含有纤溶酶原活性区域,被激活后具有纤溶活性,能够降解纤维蛋白。本文旨在优化人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的表达条件。【方法】在NCBI中获取人微小纤...【目的】人微小纤溶酶原是由261个氨基酸组成的肽链,位于人纤溶酶原第549~790位,含有纤溶酶原活性区域,被激活后具有纤溶活性,能够降解纤维蛋白。本文旨在优化人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的表达条件。【方法】在NCBI中获取人微小纤溶酶原氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性原理,设计对应的DNA序列,然后进行人工合成。合成的基因序列经测序验证后酶切与表达载体pPICZαA连接形成重组表达质粒pPICZαA-mPlg,转入大肠杆菌JM109中扩增质粒,提取阳性菌落中的重组质粒,双酶切获得人微小纤溶酶原的表达单元,然后构建4拷贝(表达单元)pPICZαA-mPlg,单酶切线性化质粒。然后电转化导入感受态毕赤酵母SMD1168中,经表型筛选、PCR筛选阳性克隆,获得高表达人微小纤溶酶原工程菌。培养工程菌后,甲醇诱导工程菌细胞让人微小纤溶酶c DNA表达,用SDS-PAGE检查其分子量,发色底物法检测微小纤溶酶原活性,通过发酵条件优化提高人微小纤溶酶原的产量,用SP-Sepharose fast flow凝胶层析方法纯化目标蛋白。【结果】SDS-PAGE检测到符合人微小纤溶酶原分子量大小的蛋白条带,同时发色底物法检测出样品中含有纤溶活性,其水平达到90 U/mL。【结论】本文为后续进行大规模表达人微小纤溶酶原打下了基础。展开更多
文摘【目的】人微小纤溶酶原是由261个氨基酸组成的肽链,位于人纤溶酶原第549~790位,含有纤溶酶原活性区域,被激活后具有纤溶活性,能够降解纤维蛋白。本文旨在优化人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的表达条件。【方法】在NCBI中获取人微小纤溶酶原氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性原理,设计对应的DNA序列,然后进行人工合成。合成的基因序列经测序验证后酶切与表达载体pPICZαA连接形成重组表达质粒pPICZαA-mPlg,转入大肠杆菌JM109中扩增质粒,提取阳性菌落中的重组质粒,双酶切获得人微小纤溶酶原的表达单元,然后构建4拷贝(表达单元)pPICZαA-mPlg,单酶切线性化质粒。然后电转化导入感受态毕赤酵母SMD1168中,经表型筛选、PCR筛选阳性克隆,获得高表达人微小纤溶酶原工程菌。培养工程菌后,甲醇诱导工程菌细胞让人微小纤溶酶c DNA表达,用SDS-PAGE检查其分子量,发色底物法检测微小纤溶酶原活性,通过发酵条件优化提高人微小纤溶酶原的产量,用SP-Sepharose fast flow凝胶层析方法纯化目标蛋白。【结果】SDS-PAGE检测到符合人微小纤溶酶原分子量大小的蛋白条带,同时发色底物法检测出样品中含有纤溶活性,其水平达到90 U/mL。【结论】本文为后续进行大规模表达人微小纤溶酶原打下了基础。
