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用差异显示反转录PCR银染技术研究植物基因表达的差异 被引量：7
1
作者 毛爱军 王台 宋艳茹 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第5期736-739,共4页
通过调整差异显示反转录PCR (DDRT PCR)中总RNA、锚定引物、随机引物、cDNA和dNTP等关键试剂的用量 ,优化了适用于银染检测的DDRT PCR方法 .PCR扩增产物经 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离后 ,银染能检测到多而清晰的条带 .泳道中的... 通过调整差异显示反转录PCR (DDRT PCR)中总RNA、锚定引物、随机引物、cDNA和dNTP等关键试剂的用量 ,优化了适用于银染检测的DDRT PCR方法 .PCR扩增产物经 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离后 ,银染能检测到多而清晰的条带 .泳道中的条带数最少为 40个 ,最多达 80个 ,平均为 6 0个 ,条带大小分布在 10 0～ 90 0bp范围 ,灵敏度为 5pg/mm2 .此方法操作简便快速 ,灵敏度高 ,重复性好 .采用这个改良的方法 ,分析了拟南芥野生型和ast突变型基因表达的差异 .从 16 0 0 0个cDNA扩增产物条带中筛选出 2 8个差异条带 .二次PCR扩增后 ,进一步筛选出 13个差异条带 ,其中 7个是野生型特异表达的 ,6个是突变型特异表达的 。 展开更多
关键词 差异显示反转录pcr 银染 拟南芥 ast突变型 植物 基因表达
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应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性 被引量：3
2
作者 许炎 张晨 +5 位作者 徐庆文 黄江平 刘亚楠 邹凯南 平原 周怀谷 《法医学杂志》 CAS CSCD 2013年第4期259-262,共4页
目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse tr... 目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术反转录成cDNA,根据3种生物检材不同的目标基因设计3对特异性引物,进行实时荧光定量PCR扩增,通过熔解曲线测定不同的熔解温度(Tm)和不同长度的扩增片段来区分生物检材。结果血液(斑)的Tm值为(84.5±0.2)℃,片段长度177 bp;唾液(斑)的Tm值为(76.9±0.3)℃,片段长度134 bp;精液(斑)的Tm值为(88.5±0.2)℃,片段长度294 bp。结论与常规检验法比较,联合应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术判定检材的生物属性特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠,可应用于日常法医物证检验。 展开更多
关键词 法医遗传学 反转录pcr 实时荧光定量pcr 血液 唾液 精液
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苏太猪肌内脂肪沉积相关基因SRC-1的差异显示反转录PCR鉴定 被引量：1
3
作者 薛春阳 汪秀星 +4 位作者 王晓娜 刘红林 徐银学 程占军 陈杰 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期126-129,共4页
采取90头180日龄去势苏太猪的背最长肌组织测定肌内脂肪含量,从中选取肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01)的最高和最低各6头组成RNA池,采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)鉴定两组间差异表达的基因,结果共获得14条表达序列标签(expressed ... 采取90头180日龄去势苏太猪的背最长肌组织测定肌内脂肪含量,从中选取肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01)的最高和最低各6头组成RNA池,采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)鉴定两组间差异表达的基因,结果共获得14条表达序列标签(expressed sequence tags),即EST序列,通过GenBank比对发现其中3条为已知序列。为进一步验证这3个已知基因与肌内脂肪之间的关系,从90个个体中选取肌内脂肪最高和最低各15个个体进行实时定量PCR检测。结果表明,细胞核受体共激活因子1基因(SRC-1)mRNA表达水平与肌内脂肪含量存在负相关关系(r=-0.38,P<0.05)。提示:SRC-1蛋白有可能参与了肌内脂肪沉积的调节。 展开更多
关键词 差异显示反转录pcr 肌内脂肪 实时荧光定量pcr 细胞核受体共激活因子1基因(SRC-1) 苏太猪
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mRNA差异显示反转录PCR技术的发展及其在神经科学中的应用 被引量：1
4
作者 胡震 杨树源 《现代神经疾病杂志》 2003年第5期286-290,共5页
关键词 mRNA差异显示反转录pcr技术 神经科学 差别性表达 功能基因组
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反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒 被引量：19
5
作者 王艳 马文丽 +6 位作者 宋艳斌 肖维威 张宝 黄海 王洪敏 马晓冬 郑文岭 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第5期421-423,共3页
目的探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA,用巢式PCR外侧下游引物进行反转录,以反转录产物为模板,进行巢式第一次、第二次PCR。PCR产物克隆到pMD18-T载体后进... 目的探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA,用巢式PCR外侧下游引物进行反转录,以反转录产物为模板,进行巢式第一次、第二次PCR。PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行测序鉴定。结果被检样品扩增出特异片段,经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列,证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。 展开更多
关键词 SARS冠状病毒 巢式反转录pcr 早期诊断
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新城疫强毒特异性反转录荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：4
6
作者 徐敏丽 于江 +7 位作者 逯璐 张玉玉 任素芳 陈智 孙文博 郭立辉 吴家强 张琳 《山东农业科学》 北大核心 2021年第8期112-118,共7页
为建立一种敏感性高、特异性强、成本更低的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)特异性反转录荧光定量PCR(reverse transcription fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测方法,基于对所有已知NDVF基因序列特征的分析,设计了... 为建立一种敏感性高、特异性强、成本更低的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)特异性反转录荧光定量PCR(reverse transcription fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测方法,基于对所有已知NDVF基因序列特征的分析,设计了一对强毒特异性引物,以体外转录制备的RNA标准品为阳性模板,构建了标准曲线,并对该方法的敏感性、特异性和准确性进行了验证。结果表明,基于SYBRGreenⅠ嵌合荧光技术建立的检测方法能够特异性扩增NDV强毒,最低可检测1拷贝/μL的RNA,用于临床毒株的检测结果与序列测定一致,可作为适合大规模监测NDV强毒的方法和工具。 展开更多
关键词 新城疫病毒 强毒 反转录荧光定量pcr 监测
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基因Ⅵ型新城疫病毒反转录数字PCR检测方法的建立与应用 被引量：2
7
作者 王静静 舒波 +4 位作者 于晓慧 克军宏 邢安琪 彭真奇 刘华雷 《中国动物检疫》 CAS 2022年第9期115-120,共6页
基因Ⅵ型新城疫病毒(NDV)是导致我国当前鸽新城疫流行的主要基因型。国家新城疫参考实验室监测数据表明,鸽NDV分离率近年来有上升趋势。为了实现基因Ⅵ型NDV快速检测和精确定量,针对国内流行的基因Ⅵ型NDV F基因保守区域设计特异性引物... 基因Ⅵ型新城疫病毒(NDV)是导致我国当前鸽新城疫流行的主要基因型。国家新城疫参考实验室监测数据表明,鸽NDV分离率近年来有上升趋势。为了实现基因Ⅵ型NDV快速检测和精确定量,针对国内流行的基因Ⅵ型NDV F基因保守区域设计特异性引物和探针,建立了反转录数字PCR(RT-dPCR)方法,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果显示,建立的RT-dPCR方法线性关系良好,灵敏度高,最低检测限为1.97 copies/μL;特异性强,与其他基因型NDV强毒株和常见禽病病毒无交叉反应;重复性好,变异系数为2.2%。利用本方法对临床采集的180份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,检测结果与病毒分离结果一致。以上结果表明,本研究建立的RT-dPCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于基因Ⅵ型NDV的快速检测和精准定量,同时也为基因Ⅵ型NDV核酸标准物质研制奠定了基础。 展开更多
关键词 新城疫病毒 基因Ⅵ型 反转录数字pcr
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基因Ⅶ.2亚型新城疫病毒反转录数字PCR检测方法的建立与应用 被引量：1
8
作者 王静静 克军宏 +3 位作者 于晓慧 彭真奇 邢安琪 刘华雷 《中国动物检疫》 CAS 2023年第5期82-87,共6页
基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)是严重危害我国家禽养殖业健康发展的主要病原之一。国家新城疫参考实验室监测表明,目前国内NDV流行毒株已由基因Ⅶ.1.1亚型转变为Ⅶ.2亚型。为实现基因Ⅶ.2亚型NDV的快速检测和精准定量,针对其国内流行毒株F基... 基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)是严重危害我国家禽养殖业健康发展的主要病原之一。国家新城疫参考实验室监测表明,目前国内NDV流行毒株已由基因Ⅶ.1.1亚型转变为Ⅶ.2亚型。为实现基因Ⅶ.2亚型NDV的快速检测和精准定量,针对其国内流行毒株F基因保守区域设计了特异性引物和探针,建立了一种可快速检测基因Ⅶ.2亚型NDV的反转录数字PCR(RT-dPCR)方法,并评估了该方法的敏感性、特异性和重复性。结果显示:建立的RT-dPCR方法检测下限为1.30 copies/μL,敏感性较高;特异性强,与基因Ⅵ型、Ⅻ型NDV以及其他常见禽病病毒(禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒)无交叉反应;重复性试验变异系数为2.6%,小于3%,重复性好。利用本方法对从活禽市场采集的200份鸡口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,发现检测结果与病毒分离鉴定结果一致。结果表明,本研究建立的RT-dPCR方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和准确性,可用于基因Ⅶ.2亚型NDV的快速检测和精准定量,同时也为其核酸标准物质的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 新城疫病毒 基因Ⅶ.2亚型 反转录数字pcr 性能评估
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小反刍兽疫诊断技术研究进展 被引量：1
9
作者 张石豪 张忠湛 +2 位作者 刘笑扬 印春生 赵传芳 《中兽医医药杂志》 2025年第4期42-46,共5页
小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种以发热、口炎、肠炎为特征,严重危害家养和野生小型反刍动物的高度接触性传染病。目前,我国的PPR疫情整体平稳,但由周边国家传入疫情的风险持续存在。快速、准确的诊断技术对于及时... 小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种以发热、口炎、肠炎为特征,严重危害家养和野生小型反刍动物的高度接触性传染病。目前,我国的PPR疫情整体平稳,但由周边国家传入疫情的风险持续存在。快速、准确的诊断技术对于及时发现并阻断疫情传播至关重要。目前广泛使用的小反刍兽疫诊断方法可分为病原学检测和血清学检测。病原学检测主要包括病毒分离、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、环介导等温扩增(RT-LAMP)、重组聚合酶扩增(RT-RPA)、重组酶介导的扩增技术(RT-RAA)等。其中病毒分离培养是检测PPRV的金标准,qRT-PCR被认为是PPRV核酸检测的金标准,RT-LAMP、RT-RPA和RT-RAA等恒温扩增技术适用于现场快速诊断。血清学检测包括病毒中和试验(VNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析试纸条、化学发光免疫分析方法(CLIA)和时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)等。其中,VNT是世界动物卫生组织(WOAH)认可的抗体检测金标准;免疫层析试纸条操作简单、检测迅速,适合PPRV的快速检测。此外,RT-PCR、qRT-PCR和竞争ELISA是《小反刍兽疫诊断技术》(GB/T 27982-2011)推荐的主要检测方法。不同检测技术各有优缺点,检测人员可根据实际需求选择合适的诊断技术。根据基层人员的临床需要和疫情监测的需求,未来PPR诊断技术或将朝着操作简单、成本低廉、结果可视化的目标以及更高效率、高灵敏度、强特异性和高通量的方向发展。 展开更多
关键词 小反刍兽疫 诊断 病原学 血清学 反转录荧光定量pcr 环介导等温扩增 酶联免疫吸附试验
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反转录差异显示技术及其方法的改进 被引量：6
10
作者 朱靖 杜立新 《动物医学进展》 CSCD 2005年第1期19-21,共3页
运用mRNA反转录差异显示技术可以了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况 ,为研究生命活动过程提供重要信息。文章对差异显示反转录聚合酶链式反应技术的基本原理 ,优点与缺点 ,以及近年来对该技术涉及的R... 运用mRNA反转录差异显示技术可以了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况 ,为研究生命活动过程提供重要信息。文章对差异显示反转录聚合酶链式反应技术的基本原理 ,优点与缺点 ,以及近年来对该技术涉及的RT PCR方法、引物设计、PCR反应参数、电泳及差异条带的显示方法以及杂交方式进行了论述和评价 ,并对其应用前景进行了简单分析。 展开更多
关键词 反转录差异显示pcr 反向northern印迹 银染
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马铃薯Y病毒的RT-PCR检测 被引量：30
11
作者 李浩戈 吴元华 赵秀香 《沈阳农业大学学报》 CAS CSCD 1999年第3期244-246,共3页
通过两种方法提取了烟草病叶中PVY病毒的RNA，然后针对PVY^N的CP基因序列，设计合成了一对特异性引物，运用反转录PCR技术对提取的PVY－RNA进行了体外扩增，结果得到与预期大小相一致的780bp片段，而对照未得到任何产物，从而建立了运... 通过两种方法提取了烟草病叶中PVY病毒的RNA，然后针对PVY^N的CP基因序列，设计合成了一对特异性引物，运用反转录PCR技术对提取的PVY－RNA进行了体外扩增，结果得到与预期大小相一致的780bp片段，而对照未得到任何产物，从而建立了运用RT－PCR手段检测植物中PVY的又一有效途径，并运用此方法对东北三省部分地区马铃薯种薯中PVY的带毒情况进行了检测。 展开更多
关键词 反转录pcr 马铃薯 Y病毒 检测
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烟草环斑病毒DB-RT-Realtime PCR检测方法研究 被引量：11
12
作者 郑耘 杨伟东 +4 位作者 陈枝楠 李明福 章桂明 余道坚 张永江 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期117-120,共4页
本研究首次应用直接结合反转录实时荧光PCR技术(direct binding reverse transcription realtime PCR,DB-RT-Re-altime PCR)检测烟草环斑病毒,由于综合运用了PCR管吸附病毒外壳蛋白、病毒核酸分子杂交、高灵敏度实时荧光PCR技术的优点,... 本研究首次应用直接结合反转录实时荧光PCR技术(direct binding reverse transcription realtime PCR,DB-RT-Re-altime PCR)检测烟草环斑病毒,由于综合运用了PCR管吸附病毒外壳蛋白、病毒核酸分子杂交、高灵敏度实时荧光PCR技术的优点,从而使病毒检测在特异性、灵敏度、稳定性等技术指标上比传统的DAS-ELISA方法都有所提高,解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、干扰物质存在而影响检测结果的问题,为病毒检测提供了一个快速、简便有效的检测方法。 展开更多
关键词 烟草环斑病毒 反转录pcr 检测
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人端粒酶催化亚单位mRNA的实时荧光RT-PCR定量检测 被引量：7
13
作者 郭颖 刘军 +2 位作者 薛采芳 吴静 宋天保 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期618-620,共3页
目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定... 目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定量测定人 β 肌动蛋白 (hBA)的mRNA作为内对照。用梯度稀释的克隆的人 β 肌动蛋白基因制作标准曲线。结果 :标准曲线的相关系数为 1.0 0。实时荧光反转录PCR方法的平均变异系数为 7.1%。HepG2细胞hTERTmRNA与hBAmRNA的比值为 (1.3± 0 .3)× 10 -4。结论 :建立了可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。 展开更多
关键词 RNA 端粒酶催化亚单位 实时荧光pcr 反转录pcr HepG2细胞 定量测定 Β-肌动蛋白 BA 稀释 特异引物
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杨树Na^+/H^+反向运输蛋白基因(PtNHX_1、PtNHX_6)的克隆和检测 被引量：7
14
作者 张德强 赵树堂 +1 位作者 卢孟柱 田林 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2006年第11期29-36,共8页
Na+/H+反向运输蛋白基因(NHX)是在细菌、植物和动物体内普遍存在的一类膜蛋白基因家族。迄今已在模式植物拟南芥中分离出AtNHX1、AtNHX2、AtNHX3、AtNHX4、AtNHX5和AtNHX6共6个成员,并发现部分成员对盐胁迫有不同程度的响应。以AtNHX1和... Na+/H+反向运输蛋白基因(NHX)是在细菌、植物和动物体内普遍存在的一类膜蛋白基因家族。迄今已在模式植物拟南芥中分离出AtNHX1、AtNHX2、AtNHX3、AtNHX4、AtNHX5和AtNHX6共6个成员,并发现部分成员对盐胁迫有不同程度的响应。以AtNHX1和AtNHX6的cDNA核苷酸序列为信息探针,基于可利用的杨树EST数据库和毛果杨全基因组测序结果,通过电子杂交辅助的克隆技术,从毛白杨形成层cDNA中分离得到长度分别为1635bp和1709bp的2个cDNA,其分别含有编码544个和526个氨基酸残基的完整开放阅读框。由它们所推导的蛋白质序列与拟南芥、水稻、小麦和玉米的NHX1和NHX6基因的蛋白质序列高度同源,同源性分别为79%、76%、69%和74%以及82%、82%、27%和26%,故将其命名为PtNHX1和PtNHX6(GenBank注册号分别为AY660749和AY832912)。Southern杂交分析表明,PtNHX1和PtNHX6均为低拷贝基因(或有一些高度同源的基因),在杨树基因组中以1～4个拷贝形式存在。组织特异性RT-PCR结果显示,PtNHX1和PtNHX6基因在杨树根、茎和叶片中均有表达,但其表达模式稍有不同:PtNHX1在根部、形成层、未成熟木质部、成熟叶和嫩叶中均高度表达,在韧皮部和成熟木质部中有少量表达,而PtNHX6在根部、成熟叶和嫩叶中表达丰度较高,在韧皮部、形成层、未成熟木质部表达丰度较低,在成熟木质部中表达丰度极低。NaCl诱导的杨树叶片差异表达RT-PCR检测结果初步表明,PtNHX1和PtNHX6基因均受盐诱导表达,当溶液中NaCl浓度在100～400mmol.L-1内,随着盐浓度的提高,PtNHX1和PtNHX6基因的表达丰度逐渐增强,但超过400mmol.L-1后,其表达丰度均有所降低,这与所测定的叶片ABA含量匹配。 展开更多
关键词 杨树 Na^+/H^+反向运输蛋白 反转录pcr 盐诱导的差异表达
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人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞的初步研究 被引量：3
15
作者 翟惠虹 郭新宁 +4 位作者 时永全 王新 兰梅 杨力 樊代明 《中国肿瘤临床》 CAS CSCD 北大核心 2002年第11期785-789,共5页
目的:扩增人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR,以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法:采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列,利用... 目的:扩增人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR,以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法:采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列,利用DNA重组技术构建正、反义真核表达载体,经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR,筛选正、反义基因稳定转染细胞,RNA斑点杂交法检测正、反义稳定转染细胞mRNA水平的变化。结果:从高表达RPS13的SGC7901/VCR耐药细胞中提取细胞总RNA,RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列,并经测序证实;目的基因按正、反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),并经酶切鉴定证实;经脂质体介导将正义真核表达载体转染SGC7901细胞,反义真核表达载体转染SGC7901/VCR细胞,G418筛选获得稳定转染细胞;RNA斑点杂交试验证实:正义稳定转染细胞RPS13mRNA水平上调,反义稳定转染细胞RPS13mRNA水平下调。结论:成功克隆了人RPS13编码基因序列,并构建了其正、反义真核表达载体。在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中得到稳定转染细胞株,正义转染细胞中RPS13mRNA表达明显增加,反义转染细胞中表达明显受抑。 展开更多
关键词 人核糖体蛋白S13 反转录pcr 基因转染 胃癌 基因克隆
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RT-PCR方法检测贝类中诺沃克样病毒的研究 被引量：7
16
作者 张颖 吴风亮 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第5期347-351,共5页
目的:本研究从病毒富集和核酸提取两方面进行探索,旨在建立一个反转录(RT)PCR技术检测贝类中诺沃克样病毒(NLVs)的方法。方法:利用脊髓灰质炎病毒作为参照毒株,优化了甘氨酸缓冲液-聚乙二醇(PEG)病毒浓缩方法;同时比较了异硫氰酸胍法、S... 目的:本研究从病毒富集和核酸提取两方面进行探索,旨在建立一个反转录(RT)PCR技术检测贝类中诺沃克样病毒(NLVs)的方法。方法:利用脊髓灰质炎病毒作为参照毒株,优化了甘氨酸缓冲液-聚乙二醇(PEG)病毒浓缩方法;同时比较了异硫氰酸胍法、SDS-蛋白酶K法、Trizol-异丙醇法、试剂盒法四种RNA提取方法;对市售贝类样品进行了检测,并利用基因测序对阳性样品进行验证。结果:本研究采用的pH9.5甘氨酸缓冲液-16%聚乙二醇病毒浓缩法,病毒的回收率为16.8%,利用Trizol-异丙醇法提取RNA,检出限为8.1×102RT-PCR50/5g贝肉,实际检测贝类样品25件,其中3件样品为阳性,基因测序结果亦证实为阳性。结论:本研究建立了一个灵敏度较高、较为有效的RT-PCR技术检测贝类中诺沃克样病毒的方法。 展开更多
关键词 诺沃克样病毒 反转录pcr 贝类 检测
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1型鸭肝炎病毒RT-PCR快速检测方法的建立 被引量：2
17
作者 王永娟 朱善元 +3 位作者 王安平 吴双 洪伟鸣 左伟勇 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2017年第2期116-119,共4页
为建立快速检测临床1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)感染的方法,根据DHAV-1的vp1基因序列设计1对引物,以DHAV-1及其他常见的感染鸭的病毒基因组为模板,建立了DHAV-1的特异性RT-PCR检测方法;以10倍梯度稀释的DHAV-1 RNA为模板,测定该方法的灵敏度... 为建立快速检测临床1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)感染的方法,根据DHAV-1的vp1基因序列设计1对引物,以DHAV-1及其他常见的感染鸭的病毒基因组为模板,建立了DHAV-1的特异性RT-PCR检测方法;以10倍梯度稀释的DHAV-1 RNA为模板,测定该方法的灵敏度;采集江苏多地的疑似DHAV-1感染病料,提取基因组进行RT-PCR扩增,产物经测序鉴定后判断所建立方法的检测率。结果显示,建立的方法可以特异性扩增DHAV-1 vp1基因保守区360 bp的序列,最低可检测1 fg基因组模板,对临床样品检测率为100%。表明,成功建立了特异性强、灵敏度高且可以用于临床快速诊断DHAV-1感染的方法。 展开更多
关键词 鸭 1型鸭肝炎病毒 反转录pcr 检测
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番茄叶片液泡转化酶基因植物反义表达载体的构建与瞬时表达 被引量：2
18
作者 程智慧 吴正景 +1 位作者 孟焕文 许小勇 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2007年第4期155-158,共4页
在分析植物液泡转化酶基因保守区序列的基础上,设计1对PCR引物,以番茄(中蔬四号)叶片总RNA的反转录产物为模板,扩增出长为668 bp的cDNA片段,并克隆入pMD-18 T simple载体。测序结果表明,所获得的片段为番茄液泡转化酶基因TIV1的片段;PC... 在分析植物液泡转化酶基因保守区序列的基础上,设计1对PCR引物,以番茄(中蔬四号)叶片总RNA的反转录产物为模板,扩增出长为668 bp的cDNA片段,并克隆入pMD-18 T simple载体。测序结果表明,所获得的片段为番茄液泡转化酶基因TIV1的片段;PCR和酶切分析表明,该片段已成功定向连入到双无载体pBinAR的CaMV 35S启动子和OCS终止子间,构建成反义植物表达载体pBinAR-aTIV1;菌落PCR表明质粒成功转化入农杆菌EHA105;瞬时表达证明该反义片段对番茄叶片液泡转化酶活性具有明显的抑制效果。 展开更多
关键词 番茄 液泡转化酶 反转录pcr 反义表达载体构建 瞬时表达
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ApoE基因型对JAR细胞系芳香化酶mRNA转录的影响
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作者 庄骏 刘雅静 +1 位作者 刘际 周江宁 《中国科学技术大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期434-438,共5页
载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)和雌激素之间的相互作用机理被认为与阿尔兹海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)的病理过程密切相关.芳香化酶是体内雌二醇合成的限速酶.为了检测ApoE不同亚型对芳香化酶表达的影响,在JAR细胞系中转染不... 载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)和雌激素之间的相互作用机理被认为与阿尔兹海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)的病理过程密切相关.芳香化酶是体内雌二醇合成的限速酶.为了检测ApoE不同亚型对芳香化酶表达的影响,在JAR细胞系中转染不同ApoE基因型的质粒,在转染效率没有差异的情况下,利用RT-PCR技术检测芳香化酶的表达情况,结果发现E2组的芳香化酶mRNA表达(118.37±26.46%)显著高于E3(95.25±23.21%)和E4(92.20±14.69%)组(p<0.05),而E3组和E4组之间没有显著差异(p=0.771).该结果提示不同亚型的ApoE可能通过调节芳香化酶的表达来影响雌激素的分泌,从而参与AD的发病机制. 展开更多
关键词 载脂蛋白E 芳香化酶 JAR细胞系 反转录pcr(RT-pcr)
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犬瘟热病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：5
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作者 杨井泉 韩猛立 +2 位作者 朱艳平 黄新 薄新文 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期1098-1103,共6页
【目的】建立一种犬瘟热病毒(CDV)RT-nested PCR检测方法。【方法】根据CDV弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计套式引物,进行特异性、敏感性、重复性实验。【结果】特异性试验表明,该方法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但... 【目的】建立一种犬瘟热病毒(CDV)RT-nested PCR检测方法。【方法】根据CDV弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计套式引物,进行特异性、敏感性、重复性实验。【结果】特异性试验表明,该方法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、DNA病毒犬细小病毒(CPV)以及正常Vero细胞中均未扩增出该条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-3稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。重复性实验表明,不同情况下的3次重复实验,结果相同。用RT-nested PCR对石河子地区疑似感染CDV的病料进行检测,结果表明,该研究建立的RT-nested PCR不仅能有效的检测CDV感染,而且能够检测不同组织的样品。【结论】建立的RT-nested PCR检测方法,适用于动物CDV的快速诊断和流行病学调查。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 反转录巢式pcr lit—pcr NP基因
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