反转录-环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌 被引量：1

1

作者 丁梦璇 刘秀 +4 位作者 刘伯扬 梁玉林 周振森 尹建军 宋全厚 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期193-199,共7页

建立了反转录-环介导等温扩增技术的志贺氏菌快速检测方法。针对志贺氏菌特异保守基因ipa H设计多套引物,建立优化了的反应体系,并评价其准确性、特异性、灵敏度。以人工污染脱脂乳样品比较RT-LAMP与RT-PCR的灵敏度。结果表明,在65℃等... 建立了反转录-环介导等温扩增技术的志贺氏菌快速检测方法。针对志贺氏菌特异保守基因ipa H设计多套引物,建立优化了的反应体系,并评价其准确性、特异性、灵敏度。以人工污染脱脂乳样品比较RT-LAMP与RT-PCR的灵敏度。结果表明,在65℃等温条件下,RT-LAMP反应可在30 min内完成。在活菌/损伤菌模型中,该方法表现出比国标法更好的准确性。在23株细菌标准菌株中仅对4株志贺氏菌有特异性检出。志贺氏菌RNA模板的检测灵敏度为7 fg/μL。人工污染脱脂乳样品检测灵敏度达到40 CFU/g,比RT-PCR方法高出2个数量级。表明所建立的志贺氏菌RT-LAMP扩增方法可以准确的检测志贺氏菌,同时具有快速、特异、灵敏的优势,可用于志贺氏菌的快速筛查和现场监控。 展开更多

关键词 反转录环介导等温扩增 志贺氏菌 IPAH基因 快速检测

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反转录-环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测马铃薯病毒 被引量：3

2

作者 陈恩发 李其义 +2 位作者 邓宽平 卢扬 彭慧元 《贵州农业科学》 CAS 2015年第3期74-77,共4页

为寻求低成本快速准确灵敏度高的马铃薯病毒检测方法,根据马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的外壳蛋白基因序列设计4条特异引物,建立LAMP检测技术。结... 为寻求低成本快速准确灵敏度高的马铃薯病毒检测方法,根据马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的外壳蛋白基因序列设计4条特异引物,建立LAMP检测技术。结果表明:LAMP检测方法灵敏度下限是10个拷贝的病毒量,该方法检测PVX、PVY和PLRV特异性好,灵敏度高,1h可完成检测,且检测成本低。 展开更多

关键词 马铃薯X病毒 马铃薯Y病毒 马铃薯卷叶病毒 反转录-环介导等温扩增技术 (RT-LAMP) 病毒检测

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基于反转录环介导等温扩增技术检测大肠杆菌O157 被引量：4

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作者 梁玉林 刘秀 +2 位作者 周鹏飞 周振森 尹建军 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期59-65,共7页

建立反转录环介导等温扩增(Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification RT-LAMP)方法特异性检测大肠杆菌O157。针对大肠杆菌O157的特异性保守rfb E基因设计多组引物,通过对引物筛选和反应条件优化,建立了检测大肠杆... 建立反转录环介导等温扩增(Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification RT-LAMP)方法特异性检测大肠杆菌O157。针对大肠杆菌O157的特异性保守rfb E基因设计多组引物,通过对引物筛选和反应条件优化,建立了检测大肠杆菌O157的实时荧光RT-LAMP方法。利用大肠杆菌O157及其人工污染脱脂乳样品,研究了方法的特异性和灵敏度,并与r RTPCR(Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)方法的灵敏度进行比较。结果显示,等温65℃条件下,30 min内能完成RT-LAMP扩增反应。所建立的实时荧光RT-LAMP方法特异性强,除了2株大肠杆菌O157以外其余菌株均未产生特异性扩增反应。同时该方法灵敏度高,对人工污染脱脂乳样品检测灵敏度能达到20 CFU/g,比r RT-PCR方法高10倍。建立的实时荧光RT-LAMP方法将为大肠杆菌O157现场快速检测提供有力手段。 展开更多

关键词 反转录-环介导等温扩增 大肠杆菌O157 检测 脱脂乳

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反转录环介导等温扩增技术对丙型肝炎病毒可视化分型检测 被引量：1

4

作者 赵娜 刘金霞 孙殿兴 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期383-387,共5页

目的应用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)可视化检测丙型肝炎病毒(HCV)1b和2a基因型,为RTLAMP技术应用于现场或基层医院提供初步探索经验。方法首先,收集临床阳性样本并用荧光定量PCR分型检测,把样本基本分为1型和非1型。然后分别根... 目的应用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)可视化检测丙型肝炎病毒(HCV)1b和2a基因型,为RTLAMP技术应用于现场或基层医院提供初步探索经验。方法首先,收集临床阳性样本并用荧光定量PCR分型检测,把样本基本分为1型和非1型。然后分别根据HCV 1b和2a基因型设计RT-LAMP引物并优化反应条件,通过互换模板实验验证这2套引物的特异性,并通过检测稀释的模板以验证引物的灵敏度。同时用钙黄绿素进行产物显色,使HCV分型检测可视化。最后用RT-LAMP方法检测临床样本,并计算阳性率,应用配对卡方检验比较RT-LAMP和荧光定量PCR的统计学差异。结果优化好的RT-LAMP体系的特异性好,对HCV 1b型的检测灵敏度为103 IU/mL,2a型的检测灵敏度为104 IU/mL。另外,利用钙黄绿素进行产物检测的效果和电泳结果相当。通过对临床样本分型检测,HCV 1b型样本的RTLAMP检测结果和荧光定量PCR差异无统计学意义(P>0.05),HCV 2a型样本的RT-LAMP检测结果和荧光定量PCR差异有统计学意义(P<0.05),但是未检出的样本中有2例为HCV 2b型。结论 RT-LAMP对HCV的可视化分型检测具有较好的特异性和灵敏度,操作简便,具有在现场或基层医院的应用前景。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒(HCV) 反转录环介导等温扩增(RT-LAMP) 分型检测

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反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)快速检测基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒 被引量：3

5

作者 陈耀 仲欣雨 +8 位作者 吴陈雨 丁雪 黄璟 王欢莉 范忠军 孙静 陈星逸 余树培 夏文龙 《中国动物检疫》 CAS 2023年第1期121-127,共7页

为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导... 为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)快速检测方法。结果显示:该方法在40℃恒温孵育25 min即可完成靶序列扩增;特异性强,和猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均无交叉反应;灵敏度高,最低检出限为2×10^(0)TCID_(50)/μL,是常规RT-PCR方法的10倍;应用该方法对39份疑似PRRSV感染的临床样品进行检测,检出阳性样品25份,和实验室前期建立的荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。以上结果说明,本研究建立的RT-RAA检测方法简便快速、特异性强、灵敏度高、临床适用性好,为PRRSV感染的快速诊断提供了新的技术手段。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因2型 反转录-重组酶介导等温扩增 快速检测

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环介导等温扩增技术检测建兰花叶病毒 被引量：10

6

作者 许春英 李逢慧 罗超 《现代农业科技》 2009年第8期11-12,14,共3页

为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸... 为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到LAMP检测快速检测方法。所建立的检测方法比RT-PCR更灵敏;且具有特异性,操作简单,不需要复杂的仪器,肉眼可直接观察检测结果。适合基层和现场检测。 展开更多

关键词 建兰花叶病毒 反转录聚合酶链反应 环介导等温扩增技术

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肠道病毒71型环介导等温扩增检测方法的建立

7

作者 戴颖 刘峰涛 +1 位作者 何书 汪奇伟 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期240-243,共4页

目的:采用一步逆转录-环介导等温扩增(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification,RTLAMP)肠道病毒71型(EV71)特异性基因,以建立一种快速、敏感、经济的EV71检测方法。方法:针对EV71病毒VP1基因特异性序列的8个区... 目的:采用一步逆转录-环介导等温扩增(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification,RTLAMP)肠道病毒71型(EV71)特异性基因,以建立一种快速、敏感、经济的EV71检测方法。方法:针对EV71病毒VP1基因特异性序列的8个区域设计6条环介导等温扩增引物,Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶63℃扩增目的基因1 h,GoldView染色,日光下观察结果,并评价其特异性和灵敏度。结果:该方法与柯萨奇病毒A16型、轮状病毒、诺如病毒无交叉反应发生。建立的RT-LAMP检测方法灵敏,最低检测限为50拷贝/管,比定量PCR灵敏10倍。93份咽拭子标本中,RTLAMP检测示46份阳性,实时荧光定量PCR检测示44份阳性,经卡方检验分析,两者间无显著统计学差异。结论:RT-LAMP是一种快速、敏感、特异、经济的方法,适用于基层医疗机构临床检测普及。 展开更多

关键词 逆转录-环介导等温扩增技术 肠道病毒71型 手口足病

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禽波纳病毒分离鉴定及其恒温扩增检测分析 被引量：3

8

作者 田纯见 王宏 +11 位作者 罗琼 林志雄 赵吟 罗长保 鱼海琼 刘志玲 陈茹 唐羿 周小明 常彦磊 吴晓薇 朱道中 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1847-1854,共8页

利用腺胃扩张症(PDD)患病鹦鹉腺胃RT-PCR阳性病料,接种猪睾丸(ST)传代细胞,分离禽波纳病毒(ABV),建立实时RT-LAMP检测方法。将阳性病料接种ST细胞单层传代,出现细胞圆缩、脱落,ABV基质蛋白(M)基因扩增产物出现预计大小351bp条带,测序后... 利用腺胃扩张症(PDD)患病鹦鹉腺胃RT-PCR阳性病料,接种猪睾丸(ST)传代细胞,分离禽波纳病毒(ABV),建立实时RT-LAMP检测方法。将阳性病料接种ST细胞单层传代,出现细胞圆缩、脱落,ABV基质蛋白(M)基因扩增产物出现预计大小351bp条带,测序后进化树分析显示为ABV5基因型。针对M基因设计ID37、ID30、ID19、ID6和ID1共5组引物,后3组引物RT-LAMP呈阳性反应。利用钙黄绿素建立实时RT-LAMP,分别在36(ID30)、38(ID37)和49(ID19)min出现扩增反应曲线,60min内扩增达到峰值。对各种临床样品检测与RT-PCR结果一致,新城疫等类症病毒未见阳性反应,显示较高的特异性;对细胞培养物检测10-1～10-5为阳性,比较RT-PCR敏感性提高约100倍。RT-LAMP检测方法的建立为PDD防制提供新的检测方法,也是波纳病公共卫生研究有益的参考。 展开更多

关键词 禽波纳病毒 腺胃扩张症 环介导逆转录恒温扩增 快速检测 进化树分析

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基于N基因的RT-LAMP技术检测PEDV、TGEV、PDCoV三种猪腹泻冠状病毒的研究 被引量：1

9

作者 邓可辉 陈志飞 +6 位作者 俞婷 王志林 王修武 郭智轩 李松倍 魏文康 贺东生 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期70-79,共10页

本研究成功建立了检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)3种猪冠状病毒的反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),为现场快速诊断提供技术支持。根据GenBank公布的PEDV、TGEV、PDCoV的N基因保守序... 本研究成功建立了检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)3种猪冠状病毒的反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),为现场快速诊断提供技术支持。根据GenBank公布的PEDV、TGEV、PDCoV的N基因保守序列作为靶序列设计了3套LAMP检测引物,并通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及临床样品检测,分别建立了3种快捷、敏感的猪冠状病毒RT-LAMP检测方法。结果显示:所建立的PEDV、TGEV、PDCoV 3种冠状病毒RT-LAMP检测方法的最佳反应温度分别为65℃、63℃、63℃,3种检测方法均可在45 min左右完成恒温扩增,扩增出特异性阶梯状条带,且不依赖于PCR仪等昂贵设备,仅需普通恒温装置即可反应。所建立的检测方法对PEDV、TGEV、PDCoV分别可以达到的检测下限为20、23、10拷贝/μL,敏感性较好;所建立的3种检测方法分别只检测出PEDV、TGEV、PDCoV,且与常见的猪源性病毒均无交叉反应,特异性好。用所建立的3种RT-LAMP检测方法对45份猪腹泻病料进行检测,PEDV、TGEV、PDCoV阳性率分别为33.33%(15/45)、22.22%(10/45)、13.33%(6/45),均比常规RT-PCR检测阳性率高。与常规RT-PCR相比较,本研究建立的方法操作简便快速、经济,且检测设备门槛低,更适用于基层临床检测。 展开更多

关键词 猪 冠状病毒 反转录环介导等温扩增 检测方法

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小反刍兽疫诊断技术研究进展 被引量：1

10

作者 张石豪 张忠湛 +2 位作者 刘笑扬 印春生 赵传芳 《中兽医医药杂志》 2025年第4期42-46,共5页

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种以发热、口炎、肠炎为特征,严重危害家养和野生小型反刍动物的高度接触性传染病。目前,我国的PPR疫情整体平稳,但由周边国家传入疫情的风险持续存在。快速、准确的诊断技术对于及时... 小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种以发热、口炎、肠炎为特征,严重危害家养和野生小型反刍动物的高度接触性传染病。目前,我国的PPR疫情整体平稳,但由周边国家传入疫情的风险持续存在。快速、准确的诊断技术对于及时发现并阻断疫情传播至关重要。目前广泛使用的小反刍兽疫诊断方法可分为病原学检测和血清学检测。病原学检测主要包括病毒分离、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、环介导等温扩增(RT-LAMP)、重组聚合酶扩增(RT-RPA)、重组酶介导的扩增技术(RT-RAA)等。其中病毒分离培养是检测PPRV的金标准,qRT-PCR被认为是PPRV核酸检测的金标准,RT-LAMP、RT-RPA和RT-RAA等恒温扩增技术适用于现场快速诊断。血清学检测包括病毒中和试验(VNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析试纸条、化学发光免疫分析方法(CLIA)和时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)等。其中,VNT是世界动物卫生组织(WOAH)认可的抗体检测金标准;免疫层析试纸条操作简单、检测迅速,适合PPRV的快速检测。此外,RT-PCR、qRT-PCR和竞争ELISA是《小反刍兽疫诊断技术》(GB/T 27982-2011)推荐的主要检测方法。不同检测技术各有优缺点,检测人员可根据实际需求选择合适的诊断技术。根据基层人员的临床需要和疫情监测的需求,未来PPR诊断技术或将朝着操作简单、成本低廉、结果可视化的目标以及更高效率、高灵敏度、强特异性和高通量的方向发展。 展开更多

关键词 小反刍兽疫 诊断 病原学 血清学 反转录荧光定量PCR 环介导等温扩增 酶联免疫吸附试验

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基于RT-RAA的苹果坏死花叶病毒快速检测方法的建立

11

作者 侯雨萌 赵振兴 +4 位作者 王思元 董铮 胡中泽 周涛 张永江 《植物保护》 北大核心 2025年第4期314-319,共6页

苹果是我国重要的园艺作物,具有较高的经济地位。病毒是引起苹果病害的重要因素,苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是引起苹果坏死和花叶症状的病原之一。为了有效预防ApNMV的侵染,本研究基于反转录重组酶介导恒温扩... 苹果是我国重要的园艺作物,具有较高的经济地位。病毒是引起苹果病害的重要因素,苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是引起苹果坏死和花叶症状的病原之一。为了有效预防ApNMV的侵染,本研究基于反转录重组酶介导恒温扩增(reverse transcription-recombinase aided amplification,RT-RAA)技术,建立ApNMV的快速检测方法。根据ApNMV外壳蛋白编码基因的保守序列设计4对RAA引物,筛选最佳引物序列,并进行反应体系的优化。结果表明,RAA的最佳反应条件为:引物终浓度0.8μmol/L,反应温度42℃,反应时间20 min。该方法能够特异性检测ApNMV。对携带ApNMV样品的RNA进行检测,RT-RAA检测体系的检测极限为5 pg/μL,普通RT-PCR检测体系的检测极限为50 pg/μL,RT-RAA检测体系灵敏度是普通RT-PCR体系的10倍。该检测方法具有快速、简便、灵敏度高等优点。 展开更多

关键词 苹果坏死花叶病毒(ApNMV) 反转录重组酶介导恒温扩增 快速检测

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基于RT-RAA-CRISPR/Cas13a的猪流行性腹泻病毒检测方法的建立与初步应用

12

作者 郑江涛 刘哲言 +2 位作者 王永富 青易 朱玲 《四川农业大学学报》 北大核心 2025年第4期1034-1042,共9页

【目的】开发一种针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的高特异性、高灵敏度且便捷的检测方法。【方法】结合重组酶辅助扩增(RAA)技术与CRISPR-Cas13a系统,针对PEDV的M基因设计RT-RAA引物、CRISPR RNA及报告探针。通过优化反应条件,构建具备双... 【目的】开发一种针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的高特异性、高灵敏度且便捷的检测方法。【方法】结合重组酶辅助扩增(RAA)技术与CRISPR-Cas13a系统,针对PEDV的M基因设计RT-RAA引物、CRISPR RNA及报告探针。通过优化反应条件,构建具备双读数功能的RT-RAA-CRISPR/Cas13a可视化平台,并对其检测能力进行了评估。【结果】该方法可特异性检测PEDV,与猪德尔塔冠状病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应,且检测灵敏度达到1 copy/µL;与行业标准RT-qPCR方法的检测结果相比,其符合率达到100%。【结论】建立的RT-RAA-CRISPR/Cas13a可视化检测方法可在1 h内完成对PEDV的检测,为快速现场诊断和防控提供了有力的技术保障。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 反转录-重组酶介导等温核酸扩增技术 规律间隔成簇短回文重复序列-关联蛋白13a 可视化检测

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番茄黑环病毒RT-LAMP检测方法的建立 被引量：6

13

作者 辛言言 刘洪义 +3 位作者 杨长志 刘忠梅 杨立群 张永江 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2015年第4期88-92,共5页

为了快速有效地检测出植物样品中的番茄黑环病毒(tomato black ring virus,TBRV),根据TBRV的保守序列设计RT-LAMP反应的特异引物,通过试验成功建立了TBRV的RT-LAMP特异性检测方法。该方法检测快速,约27 min即可检测到扩增曲线;特异性强... 为了快速有效地检测出植物样品中的番茄黑环病毒(tomato black ring virus,TBRV),根据TBRV的保守序列设计RT-LAMP反应的特异引物,通过试验成功建立了TBRV的RT-LAMP特异性检测方法。该方法检测快速,约27 min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同样侵染马铃薯的马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯Y病毒(PVY)、番茄斑萎病毒(TSWV)及番茄环斑病毒(ToRSV);灵敏度高,比普通RT-PCR灵敏度至少高10倍;并可通过肉眼观察反应颜色的变化直接进行结果判断。该方法适用于TBRV的快速检测。 展开更多

关键词 番茄黑环病毒 反转录-环介导等温扩增 检测

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地黄花叶病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用 被引量：1

14

作者 秦艳红 鲁书豪 +5 位作者 文艺 高素霞 李绍建 刘玉霞 王飞 鲁传涛 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期246-253,共8页

基于反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术建立了针对地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus,ReMV)的快速、特异、灵敏的RT-LAMP检测方法。根据ReMV外壳蛋白(coat protein,... 基于反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术建立了针对地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus,ReMV)的快速、特异、灵敏的RT-LAMP检测方法。根据ReMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列设计了3组LAMP引物,通过引物筛选确定最佳引物组合;利用电泳检测及可视化方法(加SYBR GreenⅠ显色剂)进行RT-LAMP温度优化、特异性检测、灵敏度比较。结果表明:本研究建立的RT-LAMP方法最适检测温度为60℃,优化后的LAMP方法能特异性检测ReMV,灵敏度是常规PCR的1000倍,可检测到1.2×10^(-1)拷贝/μL的模板浓度。对60份地黄样品的检测结果表明,RT-LAMP方法的阳性检出率为98.3%,高于常规RT-PCR方法(75%)。本研究建立的RT-LAMP检测技术为ReMV的准确检测提供了快速、高效的方法。 展开更多

关键词 地黄花叶病毒 反转录环介导等温扩增(RT-LAMP) 快速检测

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草莓白化伴随病毒RT-LAMP检测方法的建立 被引量：1

15

作者 王涌 曾祥国 +4 位作者 肖桂林 温昕 周鑫鑫 邓江丽 韩永超 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期237-245,253,共10页

草莓白化伴随病毒(strawberry pallidosis-associated virus,SPaV)能引起草莓白化病,与其他病毒复合侵染后会加重症状。本研究建立了SPaV的反转录环介导等温扩增方法(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-... 草莓白化伴随病毒(strawberry pallidosis-associated virus,SPaV)能引起草莓白化病,与其他病毒复合侵染后会加重症状。本研究建立了SPaV的反转录环介导等温扩增方法(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),对反应体系的各条件进行评估优化后,检测了RT-LAMP的特异性和灵敏度,且对田间样品进行了测试。结果表明,优化后的反应体系包含2.5μL 10×Isothermal Amplification Buffer、6 mmol/L Mg^(2+)、1 mmol/L dNTPs、1μmol/L SPaV-FIP和SPaV-BIP,0.1μmol/L SPaV-F3和SPaV-B3,0.3μmol/L SPaV-LB,0.4 mol/L Betaine,0.256 U/μL WarmStart Bst 2.0 DNA Polymerase,0.12 U/μL WarmStart RTx Reverse Transcriptase,1μL RNA,反应条件为61℃恒温孵育40 min。采用优化后的反应体系,在特异性检测中,只有携带了病毒SPaV的样品才能发生阳性扩增。灵敏度测试中,RT-LAMP比RT-PCR灵敏度高10倍。田间应用中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致。本研究建立的SPaV RT-LAMP检测方法操作简便、快速、特异,可供实验室及生产实践中应用,助力脱毒种苗的鉴定和田间病毒病调查。 展开更多

关键词 草莓白化伴随病毒 反转录环介导等温扩增 可视化 快速检测

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一步法RT-LAMP-HNB检测兰花建兰花叶病毒和齿舌兰环斑病毒方法的建立 被引量：4

16

作者 徐匆 黄皓 +5 位作者 罗华建 杜见南 黄晓彦 陈彦 梁卫驱 胡珊 《广东农业科学》 CAS 2022年第5期95-101,共7页

【目的】全世界兰花病毒有50余种,建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿舌兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是其中最常见的两种病毒。目前仍没有有效的措施能够控制病毒病,因此建立针对病毒的高效监测、检测方... 【目的】全世界兰花病毒有50余种,建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿舌兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是其中最常见的两种病毒。目前仍没有有效的措施能够控制病毒病,因此建立针对病毒的高效监测、检测方法,对控制兰花病毒感染具有至关重要的意义。【方法】以兰花病毒CymMV和ORSV为试验材料,采用反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)进行病毒RNA的扩增,从而建立CymMV和ORSV的快速检测方法。分别根据两种病毒的cp基因序列保守区设计RT-LAMP引物,在一步法RT-LAMP反应体系中加入羟基萘酚蓝(HNB,终浓度200 μmol/L)作为扩增产物指示剂,不需开盖进行凝胶电泳检测,便可直接根据体系颜色变化判读反应结果。【结果】利用该检测方法能够在2 h测出样品中是否存在CymMV和ORSV病毒RNA,其灵敏度是RT-PCR的10倍。对20株田间样品进行一步法RT-LAMP-HNB检测,根据田间检测结果显示,CymMV检出率为70%,ORSV检出率为55%,与RT-PCR结果保持一致,该法适用于田间样品检测。【结论】建立的一步法RT-LAMP-HNB是一种灵敏、快速、特异、便捷的CymMV和ORSV检测方法,仅需要简单控温设备如水浴锅便可进行核酸扩增,适用于在基层或不便利地区推广使用。 展开更多

关键词 建兰花叶病毒 齿舌兰环斑病毒 反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP) 羟基萘酚蓝(HNB) CP基因

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基于ORF7基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RAA检测方法的建立 被引量：1

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作者 于娜 马佳镁 +6 位作者 张紫薇 黄春媛 范悦轩 郑佳馨 张艳 刘光亮 曹宗喜 《动物医学进展》 北大核心 2024年第8期117-119,共3页

根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)... 根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)copies/μL;与PRVBartha-K61、PCV、CSFV、PRRSVGD、PRRSVXH-GD、PRRSVGM2、PRRSVCH-1a病毒均无交叉反应。分别对157份样品进行荧光RT-RAA法与PCR方法的检测进行比对,结果显示,荧光RT-RAA法敏感性为94.0%,特异性为100%。建立的PRRSV荧光RT-RAA法操作简便,特异性强,灵敏度高。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7基因 反转录-重组酶介导等温扩增 特异性 灵敏度

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猪急性腹泻综合征冠状病毒RT-LAMP快速检测方法的建立与应用 被引量：10

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作者 韩郁茹 石达 +5 位作者 张记宇 时洪艳 陈建飞 张鑫 刘建波 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期35-39,共5页

为建立简捷、灵敏的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)检测方法,本研究针对SADS-CoV N基因片段保守区域设计特异性的反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,经条件优化后显示建立的SADS-CoV RTLAMP检测方法最佳反应条件为64℃,50 min,初... 为建立简捷、灵敏的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)检测方法,本研究针对SADS-CoV N基因片段保守区域设计特异性的反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,经条件优化后显示建立的SADS-CoV RTLAMP检测方法最佳反应条件为64℃,50 min,初步建立SADS-CoV的RT-LAMP快速检测方法。利用该方法检测SADS-CoV、猪流行性腹泻性病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪肠道病毒9型(PEV9),评估其特异性,结果显示除SADS-CoV外,该方法与其它病原无交叉反应,特异性较强;将病毒RNA 10倍倍比稀释后作为模板,利用该RT-LAMP与普通RT-PCR同时检测,结果显示,RTLAMP方法比普通RT-PCR方法的敏感性高103倍,敏感性较高。以同一批次或不同批次的SADS-CoV核酸为模板进行RT-LAMP试验,结果显示RT-LAMP批内批间均可稳定的检出阳性样本,表明该方法具有良好的重复性和稳定性。对经口服感染SADS-CoV和未感染仔猪的临床样本进行检测,结果显示RT-LAMP与普通RT-PCR检测结果高度一致。本实验首次建立的SADS-CoV可视化RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高,操作简便、快速和高通量检测的优点,为临床SADS-CoV感染的快速诊断和综合防控提供检测手段。 展开更多

关键词 猪急性腹泻综合征病毒 N基因 反转录-环介导恒温扩增技术 快速检测

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赤羽病病毒RT-LAMP检测方法的建立 被引量：15

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作者 张吉红 潘登 +4 位作者 黄素文 黄绍棠 李如松 王建峰 倪健波 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期829-832,共4页

为建立一种赤羽病病毒(AKAV)的快速检测方法,本研究根据环介导等温扩增技术(LAMP)原理,设计了针对AKAV S基因的特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了AKAV的RT-LAMP方法。特异性和灵敏度试验结果显示,所建立的RT-LAMP检测... 为建立一种赤羽病病毒(AKAV)的快速检测方法,本研究根据环介导等温扩增技术(LAMP)原理,设计了针对AKAV S基因的特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了AKAV的RT-LAMP方法。特异性和灵敏度试验结果显示,所建立的RT-LAMP检测方法具有良好的特异性,与蓝舌病、牛病毒性腹泻及传染性牛鼻气管炎等病毒无交叉反应,敏感度可达11.5拷贝/μL,采用SYBR Green I染色,肉眼即可判定检测结果。该方法能够简便、快速、灵敏、特异地检测AKAV。 展开更多

关键词 反转录环介导等温扩增 赤羽病病毒 检测

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马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法的建立 被引量：11

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作者 高彦萍 吕和平 +3 位作者 张武 王国祥 吴雁斌 梁宏杰 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1943-1950,共8页

为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度... 为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度、实际应用效果进行评估。结果表明,建立的PLRV RT-LAMP检测方法,在62℃恒温下扩增50 min,扩增产物中加入双链嵌合荧光染色(SYBR GreenⅠ),阳性样品颜色变为绿色,阴性样品颜色仍为褐色,可直接目测判断待检测样品是否感染PLRV。该方法只特异性检测PLRV,不与马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯M病毒(PVM)等其他5种马铃薯主要病毒发生交叉反应。此外,建立的PLRV RT-LAMP检测方法的灵敏度较反转录PCR(RT-PCR)方法高100倍。田间样品检测验证,该方法与标准RT-PCR方法符合率达100%。本研究建立的以SYBR GreenΙ为颜色指示的PLRV可视化检测RT-LAMP方法,特异、灵敏、便捷,成本低,可满足科研、基层单位对该病毒快速诊断和检测的需要。 展开更多

关键词 马铃薯卷叶病毒 反转录环介导等温扩增 反转录聚合酶链式扩增 检测

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