基于逆转录重组酶聚合酶扩增技术的苹果病毒新型快速检测方法 被引量：3

1

作者 焦健 夏炎 +7 位作者 武雪莉 王苗苗 宋春晖 庞宏光 白团辉 宋尚伟 黄松 郑先波 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 2021年第6期1097-1103,共7页

利用逆转录重组酶聚合酶扩增技术(Reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA),为苹果病毒的快速检测提供技术支持。以苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus... 利用逆转录重组酶聚合酶扩增技术(Reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA),为苹果病毒的快速检测提供技术支持。以苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)和苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)为检测对象,通过特异性RPA引物设计以及反应条件优化,对检测方法的灵敏度、特异性进行评价,并与传统RT-PCR方法进行比较。结果表明,所设计的RPA引物特异性高,反应温度为37℃,反应时间为20 min,RT-RPA对4种苹果病毒的检测灵敏度为9.63×10^(1) copies,是普通RT-PCR的10^(2)~10^(3)倍。所建立的RT-RPA检测方法具有等温反应、检测速度快、灵敏度高等优点,可以用于快速检测苹果病毒病。 展开更多

关键词 逆转录重组酶聚合酶扩增 苹果病毒病 快速检测 等温扩增

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反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)快速检测基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒 被引量：2

2

作者 陈耀 仲欣雨 +8 位作者 吴陈雨 丁雪 黄璟 王欢莉 范忠军 孙静 陈星逸 余树培 夏文龙 《中国动物检疫》 CAS 2023年第1期121-127,共7页

为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导... 为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)快速检测方法。结果显示:该方法在40℃恒温孵育25 min即可完成靶序列扩增;特异性强,和猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均无交叉反应;灵敏度高,最低检出限为2×10^(0)TCID_(50)/μL,是常规RT-PCR方法的10倍;应用该方法对39份疑似PRRSV感染的临床样品进行检测,检出阳性样品25份,和实验室前期建立的荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。以上结果说明,本研究建立的RT-RAA检测方法简便快速、特异性强、灵敏度高、临床适用性好,为PRRSV感染的快速诊断提供了新的技术手段。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因2型 反转录-重组酶介导等温扩增 快速检测

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基于RT-RPA-微流控芯片的牛副流感病毒3型可视化快速检测方法

3

作者 张铁男 侯梦媛 毛晓庆 《福建农业学报》 北大核心 2025年第3期245-252,共8页

【目的】采用逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RPA)、磁捕获和微流控芯片相结合的技术,建立一种牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3, BPIV3)快速可视化分子检... 【目的】采用逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RPA)、磁捕获和微流控芯片相结合的技术,建立一种牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3, BPIV3)快速可视化分子检测方法。【方法】根据BPIV3 gp3基因设计特异性引物和探针,以牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛腺病毒3型(bovineadenovirustype3,BADV3)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectiousbovine rhinotracheitis virus, IBRV)为对照组,分析该方法的特异性。通过BPIV3标准菌(毒)株的RNA提取液进行10倍稀释确定该方法的灵敏度。收集56份疑似感染BPIV3急性期病牛的血清和鼻拭子样本,血清样本利用该方法检测,鼻拭子样本经过分离后,通过对比分析反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)检测法和该方法检测结果,以评估其应用价值。【结果】BPIV3标准菌(毒)株的RNA提取液RT-RPA扩增子大小为404 bp,对照组无扩增子,扩增子测序结果显示与BPIV3的高度保守区gp3基因(NC_002161.1)同源性为100%。对不同浓度BPIV3标准菌(毒)株的RNA提取液进行检测,结果显示本检测方法的最低检测限为2.26×10^(3) copies·μL^(-1)。对56份疑似感染BPIV3急性期病牛血清样本进行检测时,发现编号为SD0078、SD0114、SD0319、SD0601、SD0714和SD0755的牛均已感染了BPIV3,与RT-PCR和该方法对鼻拭子分离样本的检测结果一致。本检测方法从样本处理到获得检测结果全流程时长为92 min。【结论】本研究将RT-RPA、磁捕获和微流控芯片技术相结合,建立了一种BPIV3快速可视化分子检测的方法,具有良好的特异性、灵敏度和适用性。 展开更多

关键词 牛副流感病毒3 逆转录重组酶聚合酶扩增技术 磁捕获 微流控芯片技术

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转录介导的扩增技术与real-time RT-PCR在人类免疫缺陷病毒检测中的应用

4

作者 吴大先 陶淑慧 +3 位作者 刘水平 周杰斌 谭德明 侯周华 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期776-782,共7页

目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚... 目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚合酶及PCR底物等建立TMA扩增体系。通过扩增一组10倍梯度稀释的HIV RNA转录标准品,评价TMA体系的灵敏性。收集60例HIV感染患者的血浆,同时采用TMA试剂与Cobas Amplicor HIV-1 Monitor 1.5版试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用线性回归和Bland-Altman法分析两种技术的相关性和一致性。结果:成功建立了TMA扩增体系,这种技术可以检测低至10 copies/m L的HIV转录标准品。60份HIV感染者血浆样本中,TMA及Cobas均检测到阳性46份,均阴性12份,TMA检测阴性而Cobas检测阳性样本2份,检测一致率为96.7%。两种技术阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中46份TMA检测和Cobas检测均有定量结果的血浆进行线性回归分析,两种技术有非常好的相关性(r=0.997,P<0.001)。Bland-Altman分析显示两种检测方法定量Lg差值平均值为0.02,44份(95.7%)样本在95%的一致性界限内。结论:TMA技术具有高灵敏性潜能。TMA与real-time RT-PCR检测血浆中HIV RNA具有非常好的相关性与一致性。 展开更多

关键词 转录介导的扩增技术 人类免疫缺陷病毒 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 线性回归

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齿兰环斑病毒RT-RPA荧光实时检测体系的构建与应用

5

作者 吴洁秋 庄华才 +4 位作者 谭志勇 李早文 范俊强 傅海平 徐匆 《热带作物学报》 北大核心 2025年第7期1745-1753,共9页

齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是危害兰花的主要致病病毒之一,该病毒导致兰花叶片黄化、出现斑块,花朵畸形,对兰花的观赏性和商业价值影响极大。为实现ORSV的早期快速检测,本研究根据Gen Bank数据库中兰花齿兰环斑... 齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是危害兰花的主要致病病毒之一,该病毒导致兰花叶片黄化、出现斑块,花朵畸形,对兰花的观赏性和商业价值影响极大。为实现ORSV的早期快速检测,本研究根据Gen Bank数据库中兰花齿兰环斑病毒外壳蛋白cp基因的保守区域设计、筛选RT-RPA引物和探针,优化扩增条件,建立基于RPA的ORSV快速检测技术;对RT-RPA特异性和灵敏性进行测定,并通过开展田间样品检测试验,以验证该检测技术在生产上的应用可行性。结果表明:RT-RPA的最佳扩增引物组合为F1/R1,荧光探针为P1,最佳扩增温度为41℃,扩增时间为20 min;特异性良好,对建兰花叶病毒、黄瓜花叶病毒无交叉反应;灵敏度较高,ORSV核酸最低检测浓度达到2.8×10^(–5 )ng/μL。田间样品检测中,采用齿兰环斑病毒为阳性对照,dd H_(2)O为阴性对照,20份蝴蝶兰样本均检出ORSV,与Taq Man探针RT-q PCR (real time quantitative PCR)检测结果一致。本研究建立的ORSV RT-RPA荧光实时检测技术,具有快速、灵敏、准确和简便的优点,且适用于田间样品检测,为兰花病害预防、切断感染源和控制ORSV的传播提供有效方法,有助于兰花产业的健康发展。 展开更多

关键词 兰花 齿兰环斑病毒 反转录-重组酶聚合酶扩增(rt-rpa) 检测

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逆转录环介导等温扩增技术

6

《中国猪业》 2010年第12期45-45,共1页

逆转录环介导等温扩增技术（Reverse Transcription Loop,Mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP）是一种新颖的RNA扩增方法。其基本原理是采用4到6条特异引物（针对基因的6到8个区域）及一种具有链置换活性的DNA聚合酶和AMV反转... 逆转录环介导等温扩增技术（Reverse Transcription Loop,Mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP）是一种新颖的RNA扩增方法。其基本原理是采用4到6条特异引物（针对基因的6到8个区域）及一种具有链置换活性的DNA聚合酶和AMV反转录酶． 展开更多

关键词 扩增技术 逆转录 等温 介导 DNA聚合酶 Loop 扩增方法 反转录酶

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环介导等温扩增技术检测建兰花叶病毒 被引量：10

7

作者 许春英 李逢慧 罗超 《现代农业科技》 2009年第8期11-12,14,共3页

为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸... 为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到LAMP检测快速检测方法。所建立的检测方法比RT-PCR更灵敏;且具有特异性,操作简单,不需要复杂的仪器,肉眼可直接观察检测结果。适合基层和现场检测。 展开更多

关键词 建兰花叶病毒 反转录聚合酶链反应 环介导等温扩增技术

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NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

8

作者 樊成 曾昊 +6 位作者 卢星月 康婕 雷兰兰 刘静 郑玉红 钱卫东 王婷 《中国动物检疫》 CAS 2024年第8期90-97,共8页

近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计... 近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计引物、crRNA,经优化反应条件后,建立了NoV GⅡ.2亚型RTRPA-CRISPR/Cas12a检测方法。结果显示:利用引物NoV-GⅡ.2-F1B和NoV-GⅡ.2-R1对NoV GⅡ.2标准RNA进行RT-RPA扩增,结合crRNA1介导的CRISPR/Cas12a报告体系,能在40 min内完成NoV GⅡ.2核酸检测;该方法检测灵敏度为10 copies/μL,且与轮状病毒、腺病毒、星形病毒、人副肠孤病毒、博卡病毒和札如病毒无交叉反应;应用该方法和qRT-PCR法,分别对30份临床模拟样本进行检测,发现总符合率达96.67%。结果表明,本研究建立的NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法无需依赖昂贵设备,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷快速等特点,为NoV GⅡ.2感染的现场检测和防控提供了新方法。 展开更多

关键词 NoV GⅡ.2亚型 反转录重组酶聚合酶扩增 CRISPR/Cas12a系统 快速检测

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RT-RAA-CRISPR/Cas12a试纸条法快速检测苹果坏死花叶病毒方法的建立

9

作者 王思元 侯雨萌 +4 位作者 董铮 赵振兴 王金国 周涛 张永江 《西南农业学报》 北大核心 2025年第5期920-926,共7页

【目的】苹果花叶病是苹果最重要的病害之一,苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus, ApNMV)是引起我国苹果花叶病的主要病原物。针对苹果坏死花叶病毒建立快速、灵敏的检测技术,旨在实现该病毒的早期鉴定和防控。【方法】将反... 【目的】苹果花叶病是苹果最重要的病害之一,苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus, ApNMV)是引起我国苹果花叶病的主要病原物。针对苹果坏死花叶病毒建立快速、灵敏的检测技术,旨在实现该病毒的早期鉴定和防控。【方法】将反转录重组酶等温扩增(Reverse transcription-recombinase aided amplification, RT-RAA)技术与CRISPR/Cas系统相结合,基于CRISPR/Cas12a系统的设计原则,设计特异性识别ApNMV RT-RAA扩增产物的crRNA,通过优化反应体系的报告分子浓度、反应温度和反应时间,获得最佳反应体系和反应条件,并利用侧流层析试纸条展示检测结果。【结果】RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的检测灵敏度是实时荧光定量RT-PCR方法的10倍,对苹果样品RNA的检测极限达到500 fg/μL,并且对其他常见苹果病毒没有交叉反应。使用该方法检测田间采集样品的阳性率高于普通RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法。【结论】基于RT-RAA-CRISPR/Cas12a建立的苹果坏死花叶病毒试纸条检测方法具有强特异性、高灵敏度。本研究为苹果坏死花叶病毒的田间现场诊断提供了新手段。 展开更多

关键词 苹果坏死花叶病毒 反转录重组酶等温扩增 CRISPR/Cas12a 现场检测

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基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法

10

作者 侯雨萌 赵振兴 +4 位作者 王思元 董铮 胡中泽 周涛 张永江 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第2期268-275,共8页

玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有... 玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有试剂集中在一个试管中进行反应,并通过侧向流动试纸条(LFD)检测反应结果。本研究筛选得到的最佳反应条件为,引物添加量2.8μL、FB报告分子浓度100 nmol/L、RT-RAA系统反应时间20 min、CRISPR/Cas12a系统反应时间20 min。本研究构建的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法特异性强、灵敏度高,且所用试验材料方便携带和运输,适用于现场检测。 展开更多

关键词 玉米矮花叶病毒 反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术 CRISPR/Cas12a 侧向流动试纸条

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基于RT-RAA的苹果坏死花叶病毒快速检测方法的建立

11

作者 侯雨萌 赵振兴 +4 位作者 王思元 董铮 胡中泽 周涛 张永江 《植物保护》 北大核心 2025年第4期314-319,共6页

苹果是我国重要的园艺作物,具有较高的经济地位。病毒是引起苹果病害的重要因素,苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是引起苹果坏死和花叶症状的病原之一。为了有效预防ApNMV的侵染,本研究基于反转录重组酶介导恒温扩... 苹果是我国重要的园艺作物,具有较高的经济地位。病毒是引起苹果病害的重要因素,苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是引起苹果坏死和花叶症状的病原之一。为了有效预防ApNMV的侵染,本研究基于反转录重组酶介导恒温扩增(reverse transcription-recombinase aided amplification,RT-RAA)技术,建立ApNMV的快速检测方法。根据ApNMV外壳蛋白编码基因的保守序列设计4对RAA引物,筛选最佳引物序列,并进行反应体系的优化。结果表明,RAA的最佳反应条件为:引物终浓度0.8μmol/L,反应温度42℃,反应时间20 min。该方法能够特异性检测ApNMV。对携带ApNMV样品的RNA进行检测,RT-RAA检测体系的检测极限为5 pg/μL,普通RT-PCR检测体系的检测极限为50 pg/μL,RT-RAA检测体系灵敏度是普通RT-PCR体系的10倍。该检测方法具有快速、简便、灵敏度高等优点。 展开更多

关键词 苹果坏死花叶病毒(ApNMV) 反转录重组酶介导恒温扩增 快速检测

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柑橘衰退病毒RT-RPA-LFD可视化检测方法的建立及应用 被引量：5

12

作者 申世凯 曾婷 +3 位作者 乔兴华 陈力 任杰群 周彦 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期2652-2660,共9页

【目的】柑橘衰退病由柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)引起,是一种世界性的重要柑橘病害。为实现CTV的田间快速检测,建立一种准确、快速且可视化的检测方法。【方法】以CTV外壳蛋白(CP)的保守区域为靶标,设计3对特异性引物和探... 【目的】柑橘衰退病由柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)引起,是一种世界性的重要柑橘病害。为实现CTV的田间快速检测,建立一种准确、快速且可视化的检测方法。【方法】以CTV外壳蛋白(CP)的保守区域为靶标,设计3对特异性引物和探针,通过引物筛选,以及优化引物浓度、反应时间和反应温度等条件,建立CTV的反转录-重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RT-RPA-LFD)快速检测方法,明确其灵敏度,并用于田间疑似样品的检测。【结果】建立了CTV的RT-RPA-LFD检测方法:最佳检测引物为RPA-1F/R,对应探针为RPA-P,最佳反应条件为40℃,25 min,且与其他5种柑橘病毒无交叉反应。该方法的灵敏度是RT-PCR的100倍,最低可检测到2.12×10^(1)拷贝·μL^(-1)的CTV核酸,与RT-qPCR相当。采用RT-RPA-LFD法在67份田间样品中检测出CTV阳性样品41份,与RT-PCR法检测结果一致。【结论】建立的CTV RT-RPA-LFD法具有操作简单、快速、结果可视等优点,适合基层植保工作者对田间样品开展快速检测。 展开更多

关键词 柑橘 柑橘衰退病毒 反转录-重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条 快速检测

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非洲马瘟病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立 被引量：9

13

作者 史卫军 林彦星 +7 位作者 黄超华 曹琛福 曾少灵 吴江 刘建利 陈兵 阮周曦 花群义 《中国动物检疫》 CAS 2022年第7期119-123,共5页

本研究根据非洲马瘟病毒(AHSV)S7基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了检测AHSV的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)方法。该方法特异性强,仅AHSV检测为阳性,蓝舌病病毒(BTV)、马流感病毒(EIV)、马动脉炎病毒(EAV)等病原检测... 本研究根据非洲马瘟病毒(AHSV)S7基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了检测AHSV的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)方法。该方法特异性强,仅AHSV检测为阳性,蓝舌病病毒(BTV)、马流感病毒(EIV)、马动脉炎病毒(EAV)等病原检测均为阴性;灵敏性高,最低检出限为2.36×10^(1)copies/μL;反应快速,检测时间为20 min,同时具有良好的重复性。利用该方法和实时荧光RT-PCR平行检测60份临床样品,符合率为100%。结果表明,本研究建立的AHSV RT-RPA检测方法特异、敏感、快速且结果可靠,适用于AHSV的高通量、快速检测。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒 反转录重组酶聚合酶扩增(rt-rpa) 检测

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犬瘟热病毒实时荧光RT-RPA检测方法的建立及应用 被引量：4

14

作者 张启龙 傅彩霞 +6 位作者 张玮 高晓龙 王林 程敏姮 郑雪莹 刘海莹 周德刚 《动物医学进展》 北大核心 2020年第11期19-23,共5页

为建立犬瘟热病毒(CDV)临床快速检测方法,针对CDV保守N基因依据重组酶聚合酶等温扩增(RPA)引物设计原理进行RPA引物探针设计,通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和临床样品检测,建立了CDV实时荧光RT-RPA检测方法。结果显示,反应... 为建立犬瘟热病毒(CDV)临床快速检测方法,针对CDV保守N基因依据重组酶聚合酶等温扩增(RPA)引物设计原理进行RPA引物探针设计,通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和临床样品检测,建立了CDV实时荧光RT-RPA检测方法。结果显示,反应体系中M-MLV反转录酶最适浓度为4 U/μL,所建CDV实时荧光RT-RPA检测方法特异性较好,敏感性最低可检测到5.68×102 copies/μL,高于国标RT-PCR(GB/T 27532-2011)检测方法。建立的CDV实时荧光RT-RPA检测方法具有较高的敏感性和特异性、操作简便、20 min内判定结果,可用于临床犬瘟热快速诊断,对犬瘟热的防控具有重要意义。 展开更多

关键词 犬瘟热病毒 实时荧光 反转录-重组酶聚合酶等温扩增 检测

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西尼罗河病毒RT-RPA检测方法的建立及初步应用 被引量：5

15

作者 吴江 林彦星 +8 位作者 贾鹏 黄超华 史卫军 曹琛福 曾少灵 孙洁 阮周曦 林永涛 花群义 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2021年第2期35-37,41,I0002,I0003,共6页

为建立快速特异的西尼罗河病毒(WNV)检测方法,本研究根据WNV基因保守区域基因序列,采用Primer Explorer Version 4设计特异性的重组酶聚合酶扩增(RPA)引物和探针。经过引物筛选和条件优化,建立了在39℃恒温条件下15 min内即可完成的实... 为建立快速特异的西尼罗河病毒(WNV)检测方法,本研究根据WNV基因保守区域基因序列,采用Primer Explorer Version 4设计特异性的重组酶聚合酶扩增(RPA)引物和探针。经过引物筛选和条件优化,建立了在39℃恒温条件下15 min内即可完成的实时荧光RT-RPA方法。本方法能特异性检测出WNV,且与蓝舌病毒(BTV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核酸检测没有交叉反应。本方法灵敏性强,最小检出量为5.25×10^(2)拷贝/μL。采用创建的RT-RPA方法检测72份牛或猪的临床样品,结果与实时荧光定量PCR方法相符。说明本试验创建的WNV RT-RPA方法操作简便、灵敏度和特异性高,适用于WNV监测、基层实验室或出入境口岸对WNV的现场快速检测。 展开更多

关键词 西尼罗河病毒 逆转录重组酶聚合酶扩增 等温扩增

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基于ORF7基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RAA检测方法的建立 被引量：1

16

作者 于娜 马佳镁 +6 位作者 张紫薇 黄春媛 范悦轩 郑佳馨 张艳 刘光亮 曹宗喜 《动物医学进展》 北大核心 2024年第8期117-119,共3页

根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)... 根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)copies/μL;与PRVBartha-K61、PCV、CSFV、PRRSVGD、PRRSVXH-GD、PRRSVGM2、PRRSVCH-1a病毒均无交叉反应。分别对157份样品进行荧光RT-RAA法与PCR方法的检测进行比对,结果显示,荧光RT-RAA法敏感性为94.0%,特异性为100%。建立的PRRSV荧光RT-RAA法操作简便,特异性强,灵敏度高。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7基因 反转录-重组酶介导等温扩增 特异性 灵敏度

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基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立 被引量：4

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作者 于晶雪 韦珊珊 +9 位作者 覃绍敏 吴健敏 杨丽华 陈凤莲 许力士 秦树英 华俊 韦珏 方芳 刘金凤 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3237-3246,共10页

[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]... [目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA) CRISPR/Cas12系统

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马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法的建立 被引量：11

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作者 高彦萍 吕和平 +3 位作者 张武 王国祥 吴雁斌 梁宏杰 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1943-1950,共8页

为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度... 为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度、实际应用效果进行评估。结果表明,建立的PLRV RT-LAMP检测方法,在62℃恒温下扩增50 min,扩增产物中加入双链嵌合荧光染色(SYBR GreenⅠ),阳性样品颜色变为绿色,阴性样品颜色仍为褐色,可直接目测判断待检测样品是否感染PLRV。该方法只特异性检测PLRV,不与马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯M病毒(PVM)等其他5种马铃薯主要病毒发生交叉反应。此外,建立的PLRV RT-LAMP检测方法的灵敏度较反转录PCR(RT-PCR)方法高100倍。田间样品检测验证,该方法与标准RT-PCR方法符合率达100%。本研究建立的以SYBR GreenΙ为颜色指示的PLRV可视化检测RT-LAMP方法,特异、灵敏、便捷,成本低,可满足科研、基层单位对该病毒快速诊断和检测的需要。 展开更多

关键词 马铃薯卷叶病毒 反转录环介导等温扩增 反转录聚合酶链式扩增 检测

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牛轮状病毒RT-LAMP检测方法的建立 被引量：5

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作者 李巍 李宁 +1 位作者 袁万哲 孙继国 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第5期39-43,共5页

建立一种适用于牛轮状病毒(BRV)的反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)的快速检测方法。根据GenBank中登录的BRV VP7基因序列,针对其保守区设计了4条引物,利用RT-LAMP方法进行检测,并优化了反应体系与反应时间,检测了该方法的特异性和灵敏... 建立一种适用于牛轮状病毒(BRV)的反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)的快速检测方法。根据GenBank中登录的BRV VP7基因序列,针对其保守区设计了4条引物,利用RT-LAMP方法进行检测,并优化了反应体系与反应时间,检测了该方法的特异性和灵敏度。结果表明,该方法在等温条件下只需要50min就能检测出结果,与普通RT-PCR相比,具有较短的检测时间、良好的特异性和较高的灵敏度。论文针对BRV建立的RT-LAMP快速检测方法操作简便、无需昂贵设备、结果可视,适用于BRV在基层的快速检测。 展开更多

关键词 牛轮状病毒 反转录-环介导等温扩增 反转录-聚合酶链反应

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牛病毒性腹泻病毒内标双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：3

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作者 季新成 段琛 +3 位作者 王克栋 史茜 于学辉 冉多良 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第1期17-21,共5页

为了对BVDV-1和BVDV-2进行同步检测,针对不同基因型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因组高度保守的5′-UTR核苷酸序列设计特异性引物(扩增长度为288bp)。为了指示假阴性结果,以牛GAPDH基因为内标基因,设计特异性引物(扩增序列长度为152bp)。... 为了对BVDV-1和BVDV-2进行同步检测,针对不同基因型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因组高度保守的5′-UTR核苷酸序列设计特异性引物(扩增长度为288bp)。为了指示假阴性结果,以牛GAPDH基因为内标基因,设计特异性引物(扩增序列长度为152bp)。通过反应条件的优化,建立了BVDV通用型内标双重RT-PCR检测方法,该方法可以监测RNA提取与RT-PCR反应过程,指示假阴性结果的发生。该方法的检测灵敏度约为100TCID50/mL,且具有较好的特异性和可重复性。通过对566份临床样品检验,检测到阳性样品19份,阳性率3.36%。该方法可用于临床样品中BVDV检测,并可对检测结果进行质量控制。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 内标 双重反转录-聚合酶链反应 共扩增

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