鸡星状病毒实时荧光逆转录重组酶介导核酸等温扩增检测方法的建立

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作者 赵俊柯 余丹 +4 位作者 喻华英 尹文巧 张艳芳 谢志勤 谢芝勋 《动物医学进展》 北大核心 2025年第9期22-27,共6页

为建立针对鸡星状病毒(CAstV)的实时荧光逆转录重组酶介导核酸等温扩增(RT-RAA)检测方法,基于CAstV的ORF1b基因序列设计引物和探针。通过试验筛选,确定最优的引物和探针组合,并对反应条件进行优化。利用优化好的反应条件进行特异性、敏... 为建立针对鸡星状病毒(CAstV)的实时荧光逆转录重组酶介导核酸等温扩增(RT-RAA)检测方法,基于CAstV的ORF1b基因序列设计引物和探针。通过试验筛选,确定最优的引物和探针组合,并对反应条件进行优化。利用优化好的反应条件进行特异性、敏感性和重复性测试。针对从广西南宁不同地区采集的200份临床样品进行检测,并将结果与RT-PCR和RT-qPCR进行对比。结果显示,建立的实时荧光RT-RAA方法能在20 min内完成反应,最佳反应温度为41℃,显示出极高的灵敏度,最低检测限达到1.4×10^(1)copies/μL,比普通RT-PCR高100倍。所设计的引物特异性高,仅能扩增出CAstV病毒,而对其他病原体无交叉反应。重复性试验结果表明该方法具有良好的稳定性。与RT-qPCR相比,实时荧光RT-RAA的检测结果符合率高达98.27%,而普通RT-PCR与RT-RAA相比符合率仅为82.45%。建立了一种高效、快速、准确、灵敏且特异性强的实时荧光RT-RAA方法,适用于CAstV的临床大规模鉴别检测,为CAstV感染的监控提供了技术支持。 展开更多

关键词 鸡星状病毒 逆转录重组酶介导核酸等温扩增 快速检测 ORF1b基因

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反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)快速检测基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒 被引量：2

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作者 陈耀 仲欣雨 +8 位作者 吴陈雨 丁雪 黄璟 王欢莉 范忠军 孙静 陈星逸 余树培 夏文龙 《中国动物检疫》 CAS 2023年第1期121-127,共7页

为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导... 为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)快速检测方法。结果显示:该方法在40℃恒温孵育25 min即可完成靶序列扩增;特异性强,和猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均无交叉反应;灵敏度高,最低检出限为2×10^(0)TCID_(50)/μL,是常规RT-PCR方法的10倍;应用该方法对39份疑似PRRSV感染的临床样品进行检测,检出阳性样品25份,和实验室前期建立的荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。以上结果说明,本研究建立的RT-RAA检测方法简便快速、特异性强、灵敏度高、临床适用性好,为PRRSV感染的快速诊断提供了新的技术手段。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因2型 反转录-重组酶介导等温扩增 快速检测

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重组酶扩增技术概述及应用研究进展 被引量：2

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作者 陈兴浩 李鑫 +10 位作者 沈海潇 张校培 徐丽娜 张鹤平 葛菲菲 杨显超 刘健 白艺兰 王建 杨德全 赵洪进 《中国动物检疫》 CAS 2023年第11期76-81,共6页

重组酶扩增技术是近几年快速发展起来的一类等温扩增技术,相对于传统的核酸检测方法,具有设备要求低、操作简单等优势,在现场快速检测方面有着广阔的应用前景。本文简要介绍了重组酶扩增技术的技术原理、优点和难点,重点阐述了其在病毒... 重组酶扩增技术是近几年快速发展起来的一类等温扩增技术,相对于传统的核酸检测方法,具有设备要求低、操作简单等优势,在现场快速检测方面有着广阔的应用前景。本文简要介绍了重组酶扩增技术的技术原理、优点和难点,重点阐述了其在病毒、细菌、寄生虫及其他微生物检测领域的应用研究进展,旨在为重组酶扩增技术的进一步发展与应用提供参考。 展开更多

关键词 重组酶聚合酶扩增技术 酶促重组等温扩增技术 重组酶介导等温扩增技术 多酶恒温核酸快速扩增技术

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转录介导的扩增技术与real-time RT-PCR在人类免疫缺陷病毒检测中的应用

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作者 吴大先 陶淑慧 +3 位作者 刘水平 周杰斌 谭德明 侯周华 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期776-782,共7页

目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚... 目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较。方法:利用Taq Man探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚合酶及PCR底物等建立TMA扩增体系。通过扩增一组10倍梯度稀释的HIV RNA转录标准品,评价TMA体系的灵敏性。收集60例HIV感染患者的血浆,同时采用TMA试剂与Cobas Amplicor HIV-1 Monitor 1.5版试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用线性回归和Bland-Altman法分析两种技术的相关性和一致性。结果:成功建立了TMA扩增体系,这种技术可以检测低至10 copies/m L的HIV转录标准品。60份HIV感染者血浆样本中,TMA及Cobas均检测到阳性46份,均阴性12份,TMA检测阴性而Cobas检测阳性样本2份,检测一致率为96.7%。两种技术阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中46份TMA检测和Cobas检测均有定量结果的血浆进行线性回归分析,两种技术有非常好的相关性(r=0.997,P<0.001)。Bland-Altman分析显示两种检测方法定量Lg差值平均值为0.02,44份(95.7%)样本在95%的一致性界限内。结论:TMA技术具有高灵敏性潜能。TMA与real-time RT-PCR检测血浆中HIV RNA具有非常好的相关性与一致性。 展开更多

关键词 转录介导的扩增技术 人类免疫缺陷病毒 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 线性回归

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逆转录环介导等温扩增技术

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《中国猪业》 2010年第12期45-45,共1页

逆转录环介导等温扩增技术（Reverse Transcription Loop,Mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP）是一种新颖的RNA扩增方法。其基本原理是采用4到6条特异引物（针对基因的6到8个区域）及一种具有链置换活性的DNA聚合酶和AMV反转... 逆转录环介导等温扩增技术（Reverse Transcription Loop,Mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP）是一种新颖的RNA扩增方法。其基本原理是采用4到6条特异引物（针对基因的6到8个区域）及一种具有链置换活性的DNA聚合酶和AMV反转录酶． 展开更多

关键词 扩增技术 逆转录 等温 介导 DNA聚合酶 Loop 扩增方法 反转录酶

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环介导等温扩增技术检测建兰花叶病毒 被引量：10

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作者 许春英 李逢慧 罗超 《现代农业科技》 2009年第8期11-12,14,共3页

为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸... 为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到LAMP检测快速检测方法。所建立的检测方法比RT-PCR更灵敏;且具有特异性,操作简单,不需要复杂的仪器,肉眼可直接观察检测结果。适合基层和现场检测。 展开更多

关键词 建兰花叶病毒 反转录聚合酶链反应 环介导等温扩增技术

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小反刍兽疫诊断技术研究进展

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作者 张石豪 张忠湛 +2 位作者 刘笑扬 印春生 赵传芳 《中兽医医药杂志》 2025年第4期42-46,共5页

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种以发热、口炎、肠炎为特征,严重危害家养和野生小型反刍动物的高度接触性传染病。目前,我国的PPR疫情整体平稳,但由周边国家传入疫情的风险持续存在。快速、准确的诊断技术对于及时... 小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种以发热、口炎、肠炎为特征,严重危害家养和野生小型反刍动物的高度接触性传染病。目前,我国的PPR疫情整体平稳,但由周边国家传入疫情的风险持续存在。快速、准确的诊断技术对于及时发现并阻断疫情传播至关重要。目前广泛使用的小反刍兽疫诊断方法可分为病原学检测和血清学检测。病原学检测主要包括病毒分离、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、环介导等温扩增(RT-LAMP)、重组聚合酶扩增(RT-RPA)、重组酶介导的扩增技术(RT-RAA)等。其中病毒分离培养是检测PPRV的金标准,qRT-PCR被认为是PPRV核酸检测的金标准,RT-LAMP、RT-RPA和RT-RAA等恒温扩增技术适用于现场快速诊断。血清学检测包括病毒中和试验(VNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析试纸条、化学发光免疫分析方法(CLIA)和时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)等。其中,VNT是世界动物卫生组织(WOAH)认可的抗体检测金标准;免疫层析试纸条操作简单、检测迅速,适合PPRV的快速检测。此外,RT-PCR、qRT-PCR和竞争ELISA是《小反刍兽疫诊断技术》(GB/T 27982-2011)推荐的主要检测方法。不同检测技术各有优缺点,检测人员可根据实际需求选择合适的诊断技术。根据基层人员的临床需要和疫情监测的需求,未来PPR诊断技术或将朝着操作简单、成本低廉、结果可视化的目标以及更高效率、高灵敏度、强特异性和高通量的方向发展。 展开更多

关键词 小反刍兽疫 诊断 病原学 血清学 反转录荧光定量PCR 环介导等温扩增 酶联免疫吸附试验

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基于RT-RAA的苹果坏死花叶病毒快速检测方法的建立

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作者 侯雨萌 赵振兴 +4 位作者 王思元 董铮 胡中泽 周涛 张永江 《植物保护》 北大核心 2025年第4期314-319,共6页

苹果是我国重要的园艺作物,具有较高的经济地位。病毒是引起苹果病害的重要因素,苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是引起苹果坏死和花叶症状的病原之一。为了有效预防ApNMV的侵染,本研究基于反转录重组酶介导恒温扩... 苹果是我国重要的园艺作物,具有较高的经济地位。病毒是引起苹果病害的重要因素,苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是引起苹果坏死和花叶症状的病原之一。为了有效预防ApNMV的侵染,本研究基于反转录重组酶介导恒温扩增(reverse transcription-recombinase aided amplification,RT-RAA)技术,建立ApNMV的快速检测方法。根据ApNMV外壳蛋白编码基因的保守序列设计4对RAA引物,筛选最佳引物序列,并进行反应体系的优化。结果表明,RAA的最佳反应条件为:引物终浓度0.8μmol/L,反应温度42℃,反应时间20 min。该方法能够特异性检测ApNMV。对携带ApNMV样品的RNA进行检测,RT-RAA检测体系的检测极限为5 pg/μL,普通RT-PCR检测体系的检测极限为50 pg/μL,RT-RAA检测体系灵敏度是普通RT-PCR体系的10倍。该检测方法具有快速、简便、灵敏度高等优点。 展开更多

关键词 苹果坏死花叶病毒(ApNMV) 反转录重组酶介导恒温扩增 快速检测

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恒温扩增技术在鸟类性别鉴定中的应用研究进展

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作者 谭深滦 曾繁文 +2 位作者 李莉 卫恒习 张守全 《中国畜牧兽医》 2025年第9期4237-4247,共11页

鸟类在自然生态系统和人类社会发展中扮演着重要角色,鸟类的性别鉴定技术对于生态学研究和畜牧业的可持续发展至关重要。传统性别鉴定方法如翻肛法,普遍受限于操作人员的经验及熟练度,存在效率低等问题。近年来,分子性别鉴定技术,包括PC... 鸟类在自然生态系统和人类社会发展中扮演着重要角色,鸟类的性别鉴定技术对于生态学研究和畜牧业的可持续发展至关重要。传统性别鉴定方法如翻肛法,普遍受限于操作人员的经验及熟练度,存在效率低等问题。近年来,分子性别鉴定技术,包括PCR技术、分子标记技术和恒温扩增技术在内,已得到迅速发展。这些技术的应用提高了鸟类性别鉴定的准确性和简便性,尤其是恒温扩增技术的出现,加速了鸟类性别鉴定技术的发展,成为鸟类性别鉴定中的新型工具。与PCR和分子标记技术相比,恒温扩增技术以其高效性、特异性好、操作简单的特点在鸟类性别鉴定中展现出显著优势。恒温扩增技术在单一温度下反应30~60 min即可完成待测样品扩增,达到检测水平。笔者回顾了常规性别鉴定方法,并以环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、重组酶聚合酶恒温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)/重组酶介导恒温扩增技术(recombinase-aided polymerase amplification,PAA)和交叉引物恒温扩增技术(cross-priming amplification,CPA)在鸟类性别鉴定中的应用为例,阐述不同恒温扩增技术在鸟类性别鉴定中的研究进展,为后续研究提供参考。 展开更多

关键词 恒温扩增 性别鉴定 环介导等温扩增 重组酶聚合酶恒温扩增技术/重组酶介导恒温扩增技术 交叉引物恒温扩增技术

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猪捷申病毒荧光RT-RAA检测方法的建立及应用

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作者 孙志华 林青 +4 位作者 康龙滨 王隆柏 周伦江 俞道进 陈秋勇 《动物医学进展》 北大核心 2025年第3期130-133,共4页

为快速检测猪捷申病毒(PTV),根据PTV 5′UTR基因保守序列设计特异性引物和探针,优化荧光逆转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)反应条件和体系,并通过特异性、敏感性、重复性试验和临床应用对RT-RAA进行评价。结果表明,在37℃恒温反应22 mi... 为快速检测猪捷申病毒(PTV),根据PTV 5′UTR基因保守序列设计特异性引物和探针,优化荧光逆转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)反应条件和体系,并通过特异性、敏感性、重复性试验和临床应用对RT-RAA进行评价。结果表明,在37℃恒温反应22 min即可完成对PTV核酸扩增,最低检出限度为30.1 copies/μL;与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)均无交叉反应;重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于5%;23份临床样品检测显示PTV阳性率为21.74%(5/23),检测结果与RT-qPCR一致。说明建立的PTV荧光RT-RAA检测方法具有简便、高效、稳定等优点,为PTV的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。 展开更多

关键词 猪捷申病毒 荧光逆转录重组酶介导等温扩增 检测方法

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基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法

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作者 侯雨萌 赵振兴 +4 位作者 王思元 董铮 胡中泽 周涛 张永江 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第2期268-275,共8页

玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有... 玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有试剂集中在一个试管中进行反应,并通过侧向流动试纸条(LFD)检测反应结果。本研究筛选得到的最佳反应条件为,引物添加量2.8μL、FB报告分子浓度100 nmol/L、RT-RAA系统反应时间20 min、CRISPR/Cas12a系统反应时间20 min。本研究构建的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法特异性强、灵敏度高,且所用试验材料方便携带和运输,适用于现场检测。 展开更多

关键词 玉米矮花叶病毒 反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术 CRISPR/Cas12a 侧向流动试纸条

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RT-RAA-CRISPR/Cas12a试纸条法快速检测苹果坏死花叶病毒方法的建立

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作者 王思元 侯雨萌 +4 位作者 董铮 赵振兴 王金国 周涛 张永江 《西南农业学报》 北大核心 2025年第5期920-926,共7页

【目的】苹果花叶病是苹果最重要的病害之一,苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus, ApNMV)是引起我国苹果花叶病的主要病原物。针对苹果坏死花叶病毒建立快速、灵敏的检测技术,旨在实现该病毒的早期鉴定和防控。【方法】将反... 【目的】苹果花叶病是苹果最重要的病害之一,苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus, ApNMV)是引起我国苹果花叶病的主要病原物。针对苹果坏死花叶病毒建立快速、灵敏的检测技术,旨在实现该病毒的早期鉴定和防控。【方法】将反转录重组酶等温扩增(Reverse transcription-recombinase aided amplification, RT-RAA)技术与CRISPR/Cas系统相结合,基于CRISPR/Cas12a系统的设计原则,设计特异性识别ApNMV RT-RAA扩增产物的crRNA,通过优化反应体系的报告分子浓度、反应温度和反应时间,获得最佳反应体系和反应条件,并利用侧流层析试纸条展示检测结果。【结果】RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的检测灵敏度是实时荧光定量RT-PCR方法的10倍,对苹果样品RNA的检测极限达到500 fg/μL,并且对其他常见苹果病毒没有交叉反应。使用该方法检测田间采集样品的阳性率高于普通RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法。【结论】基于RT-RAA-CRISPR/Cas12a建立的苹果坏死花叶病毒试纸条检测方法具有强特异性、高灵敏度。本研究为苹果坏死花叶病毒的田间现场诊断提供了新手段。 展开更多

关键词 苹果坏死花叶病毒 反转录重组酶等温扩增 CRISPR/Cas12a 现场检测

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齿兰环斑病毒RT-RPA荧光实时检测体系的构建与应用

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作者 吴洁秋 庄华才 +4 位作者 谭志勇 李早文 范俊强 傅海平 徐匆 《热带作物学报》 北大核心 2025年第7期1745-1753,共9页

齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是危害兰花的主要致病病毒之一,该病毒导致兰花叶片黄化、出现斑块,花朵畸形,对兰花的观赏性和商业价值影响极大。为实现ORSV的早期快速检测,本研究根据Gen Bank数据库中兰花齿兰环斑... 齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是危害兰花的主要致病病毒之一,该病毒导致兰花叶片黄化、出现斑块,花朵畸形,对兰花的观赏性和商业价值影响极大。为实现ORSV的早期快速检测,本研究根据Gen Bank数据库中兰花齿兰环斑病毒外壳蛋白cp基因的保守区域设计、筛选RT-RPA引物和探针,优化扩增条件,建立基于RPA的ORSV快速检测技术;对RT-RPA特异性和灵敏性进行测定,并通过开展田间样品检测试验,以验证该检测技术在生产上的应用可行性。结果表明:RT-RPA的最佳扩增引物组合为F1/R1,荧光探针为P1,最佳扩增温度为41℃,扩增时间为20 min;特异性良好,对建兰花叶病毒、黄瓜花叶病毒无交叉反应;灵敏度较高,ORSV核酸最低检测浓度达到2.8×10^(–5 )ng/μL。田间样品检测中,采用齿兰环斑病毒为阳性对照,dd H_(2)O为阴性对照,20份蝴蝶兰样本均检出ORSV,与Taq Man探针RT-q PCR (real time quantitative PCR)检测结果一致。本研究建立的ORSV RT-RPA荧光实时检测技术,具有快速、灵敏、准确和简便的优点,且适用于田间样品检测,为兰花病害预防、切断感染源和控制ORSV的传播提供有效方法,有助于兰花产业的健康发展。 展开更多

关键词 兰花 齿兰环斑病毒 反转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA) 检测

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十足目虹彩病毒1 RAA-LFD快检方法建立与应用

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作者 田飞焱 吴众怡 +6 位作者 徐节华 黄海莉 裴建明 孟霞 刘文珍 周文华 谢世红 《中国动物检疫》 2025年第2期100-107,共8页

为建立一种适用于现场检测十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)的方法,利用DIV1 ATPase编码基因保守序列设计RAA-nfo特异性引物和探针,并结合侧向流试纸条(LFD)技术,通过优化反应时间和温度等条件,建立了可现场检测DIV1的... 为建立一种适用于现场检测十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)的方法,利用DIV1 ATPase编码基因保守序列设计RAA-nfo特异性引物和探针,并结合侧向流试纸条(LFD)技术,通过优化反应时间和温度等条件,建立了可现场检测DIV1的RAA-LFD方法。该方法能够在37℃下恒温反应20 min,并在LFD显色5 min后判读结果;对嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾肝肠胞虫(EHP)以及致急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌(Vp_(AHPND))等虾类病原无交叉反应,仅对DIV1检测呈阳性;最低检测限为5.25×10^(1) copies/反应;组内和组间重复性试验结果良好。使用该方法与已报道的套式PCR和qPCR方法对采集的60份克氏原螯虾样品进行平行检测,检测结果与套式PCR一致,与qPCR方法相比,其敏感性和特异性分别为83.3%和100%。结果表明,该方法反应快速、操作简便、灵敏度高、特异性好,具有良好的重复性和可信度,适用于临床样品的现场检测。 展开更多

关键词 十足目虹彩病毒1 重组酶介导扩增技术 侧流层析技术 恒温扩增 快速检测

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口蹄疫病毒通用型RT-RAA-LFD快速检测方法的建立 被引量：2

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作者 寇美玲 谢佳芮 +5 位作者 李占鸿 张振兴 苏晓航 王轶男 宋建领 苗海生 《中国动物检疫》 CAS 2024年第6期97-102,共6页

为建立一种操作简便、有效的口蹄疫病毒(FMDV)核酸通用型检测方法,以FMDV 3D基因为靶基因,设计标记引物及探针,建立了一种新的检测FMDV的反转录-重组酶介导链置换核酸扩增结合侧流层析试纸检测(RT-RAA-LFD)方法。该方法操作简便,耗时短... 为建立一种操作简便、有效的口蹄疫病毒(FMDV)核酸通用型检测方法,以FMDV 3D基因为靶基因,设计标记引物及探针,建立了一种新的检测FMDV的反转录-重组酶介导链置换核酸扩增结合侧流层析试纸检测(RT-RAA-LFD)方法。该方法操作简便,耗时短,40℃35 min内即可完成检测,通过肉眼观察可判定结果;具有较好的覆盖面,能够检出我国O型、A型FMDV主要流行拓扑型病毒,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等其他猪病病原无交叉反应;对RNA标准品的最低检测限为10^(-7)拷贝/μL,敏感性较高。利用建立的FMDV RT-RAA-LFD方法对5份临床样品进行检测,其结果与RT-PCR结果一致。结果表明,本研究建立的FMDVRT-RAA-LFD方法具有快速、直观、特异强、重复性好等优点,适合在基层兽医防疫部门和养殖场推广应用。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 重组酶介导链置换核酸扩增 侧流层析试纸 恒温扩增 快速检测

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基于ORF7基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RAA检测方法的建立 被引量：1

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作者 于娜 马佳镁 +6 位作者 张紫薇 黄春媛 范悦轩 郑佳馨 张艳 刘光亮 曹宗喜 《动物医学进展》 北大核心 2024年第8期117-119,共3页

根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)... 根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)copies/μL;与PRVBartha-K61、PCV、CSFV、PRRSVGD、PRRSVXH-GD、PRRSVGM2、PRRSVCH-1a病毒均无交叉反应。分别对157份样品进行荧光RT-RAA法与PCR方法的检测进行比对,结果显示,荧光RT-RAA法敏感性为94.0%,特异性为100%。建立的PRRSV荧光RT-RAA法操作简便,特异性强,灵敏度高。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7基因 反转录-重组酶介导等温扩增 特异性 灵敏度

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基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立 被引量：4

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作者 于晶雪 韦珊珊 +9 位作者 覃绍敏 吴健敏 杨丽华 陈凤莲 许力士 秦树英 华俊 韦珏 方芳 刘金凤 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3237-3246,共10页

[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]... [目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA) CRISPR/Cas12系统

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NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

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作者 樊成 曾昊 +6 位作者 卢星月 康婕 雷兰兰 刘静 郑玉红 钱卫东 王婷 《中国动物检疫》 CAS 2024年第8期90-97,共8页

近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计... 近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计引物、crRNA,经优化反应条件后,建立了NoV GⅡ.2亚型RTRPA-CRISPR/Cas12a检测方法。结果显示:利用引物NoV-GⅡ.2-F1B和NoV-GⅡ.2-R1对NoV GⅡ.2标准RNA进行RT-RPA扩增,结合crRNA1介导的CRISPR/Cas12a报告体系,能在40 min内完成NoV GⅡ.2核酸检测;该方法检测灵敏度为10 copies/μL,且与轮状病毒、腺病毒、星形病毒、人副肠孤病毒、博卡病毒和札如病毒无交叉反应;应用该方法和qRT-PCR法,分别对30份临床模拟样本进行检测,发现总符合率达96.67%。结果表明,本研究建立的NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法无需依赖昂贵设备,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷快速等特点,为NoV GⅡ.2感染的现场检测和防控提供了新方法。 展开更多

关键词 NoV GⅡ.2亚型 反转录重组酶聚合酶扩增 CRISPR/Cas12a系统 快速检测

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施马伦贝格病毒实时荧光RT-RAA快检方法的建立 被引量：1

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作者 陈嘉仪 黄晓琪 +8 位作者 王炜杰 莫竣喻 王苏艳 丹珍翁姆 陈劲松 张瑞 周泷 李彦敏 张志东 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3740-3744,共5页

旨在建立一种快速检测施马伦贝格病毒(SBV)的方法。本研究对于SBV S基因,设计特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立SBV反转录重组酶介导核酸恒温扩增(RT-RAA)检测方法。结果显示,该方法在38℃条件下,8 min内即可特异性检出SBV,与口... 旨在建立一种快速检测施马伦贝格病毒(SBV)的方法。本研究对于SBV S基因,设计特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立SBV反转录重组酶介导核酸恒温扩增(RT-RAA)检测方法。结果显示,该方法在38℃条件下,8 min内即可特异性检出SBV,与口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、非洲马瘟病毒(AHSV)、塞内卡谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)无交叉反应,其敏感性为103拷贝/反应,且批内和批间重复性变异系数均小于5%。对模拟阳性和阴性绵羊样品的检出率为100%,与SBV的RT-qPCR检测结果一致。本研究成功建立了一种快速、敏感、特异的SBV实时荧光RT-RAA方法,为SBV防控提供新技术手段。 展开更多

关键词 施马伦贝格病毒 重组酶介导核酸恒温扩增方法 快速检测

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马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法的建立 被引量：11

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作者 高彦萍 吕和平 +3 位作者 张武 王国祥 吴雁斌 梁宏杰 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1943-1950,共8页

为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度... 为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度、实际应用效果进行评估。结果表明,建立的PLRV RT-LAMP检测方法,在62℃恒温下扩增50 min,扩增产物中加入双链嵌合荧光染色(SYBR GreenⅠ),阳性样品颜色变为绿色,阴性样品颜色仍为褐色,可直接目测判断待检测样品是否感染PLRV。该方法只特异性检测PLRV,不与马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯M病毒(PVM)等其他5种马铃薯主要病毒发生交叉反应。此外,建立的PLRV RT-LAMP检测方法的灵敏度较反转录PCR(RT-PCR)方法高100倍。田间样品检测验证,该方法与标准RT-PCR方法符合率达100%。本研究建立的以SYBR GreenΙ为颜色指示的PLRV可视化检测RT-LAMP方法,特异、灵敏、便捷,成本低,可满足科研、基层单位对该病毒快速诊断和检测的需要。 展开更多

关键词 马铃薯卷叶病毒 反转录环介导等温扩增 反转录聚合酶链式扩增 检测

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