反转录病毒载体介导的EGFP基因在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞中的表达 被引量：7

1

作者 刘朝晖 杨宇 +3 位作者 庄鹏辉 许杰华 马延兵 胡海涛 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期10-13,共4页

目的构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒载体,并且探讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率。方法使用基因重组技术构建携带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGFP)。将稀释的RV病毒液感染NIH3T3细胞,计数NIH... 目的构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒载体,并且探讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率。方法使用基因重组技术构建携带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGFP)。将稀释的RV病毒液感染NIH3T3细胞,计数NIH3T3荧光表达细胞的数量来确定病毒的浓度;使用RV载体感染SK-N-SH细胞,通过流式细胞学荧光检测明确RV在SK-N-SH细胞的感染效率。结果成功构建了基因转移载体RV/EGFP,确定重组病毒的浓度为8.3×106病毒颗粒/mL。在SK-N-SH细胞RV/EGFP稳定转染并有效表达。在SK-N-SH细胞EGFP的荧光表达显示RV的转移并且表达的效率达到30%以上。结论SK-N-SH细胞能被RV病毒载体有效感染,在转基因细胞株外源基因的表达长期稳定并且显示RV病毒载体具有良好的基因转移效率。 展开更多

关键词 SK—N—SH神经母细胞瘤细胞 增强型绿色荧光蛋白 反转录病毒载体

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β-分泌酶底物肽反转录病毒载体及其包装细胞株的构建 被引量：1

2

作者 崔媛媛 胡海涛 +5 位作者 董炜疆 王兰 郑慧媛 赵璇 石明娟 吴志新 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期624-626,共3页

目的用pLXSN反转录病毒载体构建介导β-分泌酶底物肽(BACEsp)基因表达的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立高效、稳定表达BACEsp的包装细胞株。方法根据BACEsp基因序列设计引物,PCR合成的BAC-Esp片段和pLXSN载体用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶... 目的用pLXSN反转录病毒载体构建介导β-分泌酶底物肽(BACEsp)基因表达的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立高效、稳定表达BACEsp的包装细胞株。方法根据BACEsp基因序列设计引物,PCR合成的BAC-Esp片段和pLXSN载体用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后连接,构建成表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体。用脂质体介导转染PT67包装细胞,经抗性筛选后,挑单克隆扩大培养,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,筛选出高效产毒细胞株。结果经酶切、连接后构建成的质粒称为pLXSN-BACEsp,经测序证实构建成功,无任何碱基突变。经脂质体介导转染包装细胞、抗性筛选和测定病毒滴度,筛选出具有高病毒滴度的细胞集落,扩大培养后建立BAC-Esp高效表达的包装细胞株。结论成功构建了能表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立了稳定、高效地产生有活性的BACEsp产毒包装细胞株。 展开更多

关键词 阿尔茨海默病 β分泌酶底物肽 反转录病毒载体 包装细胞株 转染

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牛Klf4基因重组反转录病毒载体的构建及产毒细胞株的建立 被引量：1

3

作者 辛晓玲 吕长荣 +1 位作者 陈冬梅 窦忠英 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期1636-1641,共6页

为了克隆牛Klf4基因并构建重组反转录病毒载体,得到稳定的产毒细胞株,本研究设计了带有酶切位点的一对引物,以接触抑制生长状态的MDBK细胞为材料,用RT-PCR方法克隆出牛Klf4基因的开放阅读框序列,将之插入干细胞反转录病毒载体pMSCVneo... 为了克隆牛Klf4基因并构建重组反转录病毒载体,得到稳定的产毒细胞株,本研究设计了带有酶切位点的一对引物,以接触抑制生长状态的MDBK细胞为材料,用RT-PCR方法克隆出牛Klf4基因的开放阅读框序列,将之插入干细胞反转录病毒载体pMSCVneo构成真核表达载体pMSCV-Klf4;采用脂质体法将pMSCV-Klf4转染包装细胞PT67,通过G418筛选得到稳定的产毒细胞株,电镜观察培养液上清中的病毒颗粒,同时病毒感染NIH3T3细胞测定其病毒滴度。结果表明,本研究克隆的牛Klf4基因开放阅读框序列与已发表序列(NM-001105385)比对有99.9%的高同源性;构建的重组载体质粒可正常包装,电镜下可观察到典型的病毒颗粒,筛选出的产毒细胞株病毒滴度达7.16×107CFU·mL-1。本研究成功构建的真核表达载体pMSCV-Klf4和得到的产毒细胞株,为进一步开展有关牛iPS细胞的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 牛 Klf4基因 IPS细胞 反转录病毒载体

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人MDC1基因shRNA反转录病毒载体的构建及鉴定 被引量：1

4

作者 袁成福 黄秀凝 +5 位作者 程莉 卜友泉 刘涛 刘革力 易发平 宋方洲 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期441-444,共4页

目的建立反转录病毒介导的MDC1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MDC1表达的影响。方法将人MDC1基因的RNA干扰双链DNA片段重组到反转录病毒质粒pSilencer5.1-H1Retro中,构建携带人MDC1基因的RNA干扰反转录病毒载体psiR... 目的建立反转录病毒介导的MDC1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MDC1表达的影响。方法将人MDC1基因的RNA干扰双链DNA片段重组到反转录病毒质粒pSilencer5.1-H1Retro中,构建携带人MDC1基因的RNA干扰反转录病毒载体psiRNA-MDC1。经PT67细胞包装后,产生的重组反转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选稳定的细胞克隆。采用RT-PCR和Western blotting检测细胞中MDC1mRNA和蛋白表达的变化。结果重组psiRNA-MDC1质粒经测序鉴定正确;重组反转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western blotting检测人MDC1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论携带人MDC1基因RNA干扰双链DNA片段的反转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MDC1mRNA和蛋白表达,为进一步研究MDC1在宫颈癌中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 psiRNA-MDC1反转录病毒载体 MDC1基因 宫颈癌

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反转录病毒载体介导可溶性Fas的体外表达

5

作者 王良利 邹萍 +3 位作者 胡中波 刘凌波 李爱香 马艳萍 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2002年第2期97-99,共3页

将含全长FascDNA的质粒利用PCR技术进行特定片段删除 ,获得sFascDNA。通过DNA重组技术 ,将sFascDNA插入到反转录病毒载体 pLXIN ,构建了重组表达载体pLXIN sFas。经酶切鉴定及测序 ,表明成功地构建了重组表达载体 pLXIN sFas。该载体经P... 将含全长FascDNA的质粒利用PCR技术进行特定片段删除 ,获得sFascDNA。通过DNA重组技术 ,将sFascDNA插入到反转录病毒载体 pLXIN ,构建了重组表达载体pLXIN sFas。经酶切鉴定及测序 ,表明成功地构建了重组表达载体 pLXIN sFas。该载体经PA317细胞包装后 ,感染靶细胞COS 7,分别采用ELISA及凋亡抑制实验检测其蛋白表达量为 (2 .2± 0 .7) μg/ml,且具有良好的生物学活性 ,能明显抑制抗 Fas(CH 11)介导的T淋巴瘤细胞株Jurkat的凋亡。 展开更多

关键词 反转录病毒载体 可溶性FAS 基因表达 基因转移 体外表达 白血病 免疫监视

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反转录病毒载体介导含增强子的人β－珠蛋白基因在小鼠胎肝细胞中的表达

6

作者 王宏伟 章静波 +4 位作者 徐炎 韦启泽 刘世广 陶吉中 刘德培 《中国医学科学院学报》 CSCD 北大核心 1996年第4期246-251,共6页

将人β－珠蛋白基因（３．１ｋｂ）反向克隆入反转录病毒载体Ｎ２Ａ，并在Ｎ２Ａ的ＬＴＲ插入３６ｂｐ的增强子ＨＳ２（简称Ｎ２Ａ．β．Ｅ３６）。将此反转录病毒重组体转染ψ－２和ＰＡ３１７包装细胞系，经Ｇ４１８筛选后，分离出完... 将人β－珠蛋白基因（３．１ｋｂ）反向克隆入反转录病毒载体Ｎ２Ａ，并在Ｎ２Ａ的ＬＴＲ插入３６ｂｐ的增强子ＨＳ２（简称Ｎ２Ａ．β．Ｅ３６）。将此反转录病毒重组体转染ψ－２和ＰＡ３１７包装细胞系，经Ｇ４１８筛选后，分离出完整整合的并能产生较高病毒滴度的产病毒细胞系。利用产病毒细胞系，将含增强子人β－珠蛋白基因转入小鼠胎肝细胞，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交表明人β－珠蛋白基因可以完整地整合到靶细胞的基因组上，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示人β－珠蛋白基因可在小鼠胎肝细胞中表达。 展开更多

关键词 反转录病毒载体 Β-珠蛋白基因 基因治疗

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反转录病毒载体RCASBP介导的EGFP基因在DF-1细胞中的表达

7

作者 秦建如 黎娜铭 +2 位作者 许长剑 廖明 曹伟胜 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第10期2538-2543,共6页

为建立反转录病毒载体RCASBP介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在DF-1细胞中的表达体系,本研究将PCR获得的EGFP基因插入反转录病毒载体RCASBP,构建重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP,之后将重组载体转染DF-1细胞;用基于禽白血病病毒(ALV)... 为建立反转录病毒载体RCASBP介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在DF-1细胞中的表达体系,本研究将PCR获得的EGFP基因插入反转录病毒载体RCASBP,构建重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP,之后将重组载体转染DF-1细胞;用基于禽白血病病毒(ALV)p27抗原的ELISA检测盲传至第4代的细胞上清,ELISA阳性结果说明重组病毒拯救成功;荧光显微镜观察发现80%以上DF-1细胞都有明显的绿色荧光信号,证明DF-1细胞表达绿色荧光蛋白;对DF-1细胞基因组进行特异性PCR检测,扩增出特异性条带说明重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP携带的EGFP基因整合到DF-1细胞的基因组中。本研究建立的RCASBP介导反转录病毒表达体系为研究ALV基因的结构和功能奠定了基础。 展开更多

关键词 禽白血病病毒 反转录病毒载体RCASBP 增强型绿色荧光蛋白基因 DF-1细胞

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构建反转录病毒小向导RNA表达载体用于小鼠T细胞基因功能研究 被引量：1

8

作者 赵艳娜 邱荣 +1 位作者 沈南 唐元家 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期1585-1590,共6页

目的·构建反转录病毒小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)表达载体,用于小鼠T细胞分化调控及其基因功能的研究。方法·表达短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的反转录病毒载体(MSCV-LTR-miR30-PIG,LMP)经过Xho1和Sal1双酶切后... 目的·构建反转录病毒小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)表达载体,用于小鼠T细胞分化调控及其基因功能的研究。方法·表达短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的反转录病毒载体(MSCV-LTR-miR30-PIG,LMP)经过Xho1和Sal1双酶切后,回收得到反转录病毒载体骨架。以慢病毒sgRNA表达载体为模版,通过PCR扩增获得U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段。利用同源重组将U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段组装进反转录病毒载体骨架。为了验证系统的有效性,设计靶向Il17a、Rorc和Irf4的sgRNA序列并进行克隆。分离Cas9转基因小鼠CD4 T细胞分别进行sgRNA反转录病毒感染,诱导其向Th17细胞分化。细胞因子染色,流式检测Il17a阳性细胞比例。2组独立样本数据比较采用非配对t检验。结果·①成功构建反转录病毒sgRNA载体。②利用反转录病毒载体向小鼠CD4 T细胞递送sgRNA并实现Il17a基因敲除。③Rorc-sgRNA和Irf4-sgRNA阳性群体中,Il17a阳性群体比率显著降低(P<0.05)。结论·利用sgRNA反转录病毒载体成功向目的细胞递送sgRNA并实现基因敲除。Rorc和Irf4基因敲除结果提示该系统可用于小鼠T细胞基因功能研究。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 Cas9转基因小鼠 反转录病毒载体 TH17细胞分化

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反转录病毒介导的 HSV-tk/ACV 系统基因治疗的安全性研究

9

作者 卢大儒 胡锦 +4 位作者 王之敏 惠国桢 李向东 邱信芳 薛京伦 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 1998年第8期50-55,共6页

研究了反转录病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统基因治疗脑肿瘤的安全性。首先采用ＰＣＲ、反转录ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交以及补救分析方法，对ＨＳＶ－ｔｋ病毒包装细胞（ＴＫ／ＶＰＣ）、Ｃ６转ＴＫ基因细胞... 研究了反转录病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统基因治疗脑肿瘤的安全性。首先采用ＰＣＲ、反转录ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交以及补救分析方法，对ＨＳＶ－ｔｋ病毒包装细胞（ＴＫ／ＶＰＣ）、Ｃ６转ＴＫ基因细胞和实验动物血液进行了检测。结果表明，所采用的反转录病毒基因转移系统没有产生野生型病毒，是安全的；另一方面，采用细胞接种、Ｘ－ｇａｌ染色、ｔｋ基因的ＰＣＲ和病理切片观察方法，对ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统本身的安全性进行了探讨，结果表明ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统用于动物基因治疗，ＡＣＶ及其代谢产物没有发现明显的毒副作用和病理改变。反转录病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统是安全的。 展开更多

关键词 脑肿瘤 反转录病毒载体 基因治疗 安全性

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反转录病毒介导的稳定表达HIV-1 Gag蛋白和增强型绿色荧光蛋白细胞系的建立 被引量：4

10

作者 王婧 李昌 +6 位作者 李林溪 胡博 丛艳昭 任大勇 王卓越 杜寿文 金宁一 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期203-209,共7页

本研究旨在建立中国流行株人免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白(Gag)哺乳动物稳定表达细胞系。将HIV-1核心蛋白基因gag和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP依次串联插入反转录病毒载体pFB-neo,构建重组反转录病毒载体pFB-gag-EGFP,并与含有辅助病毒... 本研究旨在建立中国流行株人免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白(Gag)哺乳动物稳定表达细胞系。将HIV-1核心蛋白基因gag和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP依次串联插入反转录病毒载体pFB-neo,构建重组反转录病毒载体pFB-gag-EGFP,并与含有辅助病毒gag-pol和env基因的质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK293T细胞,包装出的反转录病毒感染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白EGFP表达,验证HIV-1核心蛋白Gag表达,G418抗性筛选阳性细胞。结果表明,HIV-1核心蛋白Gag和增强型绿色荧光蛋白可在SP2/0细胞中稳定表达,HIV-1核心蛋白gag基因稳定表达细胞系成功建立,为抗AIDS治疗用基因工程制剂及靶向药物的活性检测提供了理想方法。 展开更多

关键词 反转录病毒载体 人免疫缺陷病毒 核心蛋白 增强型绿色荧光蛋白 小鼠骨髓瘤细胞SP2/0

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绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶在骨髓基质细胞中的表达 被引量：2

11

作者 赵春礼 段春礼 +5 位作者 张海燕 孙晓红 赵焕英 鲁强 刘玉军 杨慧 《首都医科大学学报》 CAS 2006年第6期774-777,共4页

目的研究反转录病毒介导的绿色荧光蛋白（EGFP）基因和酪氨酸羟化酶（TH）基因在原代培养的骨髓基质细胞（bMSCs）中的表达情况。方法体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs，原代培养8～10d后，同时利用含EGFP和TH基因的反转录病毒上清依次转... 目的研究反转录病毒介导的绿色荧光蛋白（EGFP）基因和酪氨酸羟化酶（TH）基因在原代培养的骨髓基质细胞（bMSCs）中的表达情况。方法体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs，原代培养8～10d后，同时利用含EGFP和TH基因的反转录病毒上清依次转染bMSCs并进行抗性筛选，7～10d可得到稳定表达EGFP的bMSCs，在稳定转染EGFP后10d进行TH病毒上清的转染，7—10d可得到稳定表达TH和EGFP的bMSCs。结果原代培养bMSCs3—4d后生长至70％一80％汇合，病毒转染EGFP后第2天，细胞呈现弱荧光，经G418筛选2—3d后出现阳性细胞，约8～10d生长融合，阳性率60％～70％，第2—5代阳性细胞比率无明显变化。TH阳性率也达60％以上。结论利用反转录病毒载体可有效地将EGFP和TH基因转至bMSCs中，并能在体外稳定表达传代。这种表达EGFP和TH的bMSCs对于研究bMSCs的体内迁移分化及帕金森病（PD）的基因治疗具有重要意义。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白 酪氨酸羟化酶 骨髓基质细胞 反转录病毒载体

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禽类转基因生产及其应用的研究现状和进展(待续) 被引量：3

12

作者 李碧春 钱菊汾 《动物科学与动物医学》 2001年第1期13-15,共3页

综述了禽类转基因方面的制作方法、转基因禽类应用研究概况。分别介绍了成熟卵泡微注射法、精子载体转基因法、反转录病毒载体转基因法、受精卵移植法、单细胞受精卵微注射法、胚盘嵌合体法、原始生殖细胞嵌合体法的进展及发展动态。阐... 综述了禽类转基因方面的制作方法、转基因禽类应用研究概况。分别介绍了成熟卵泡微注射法、精子载体转基因法、反转录病毒载体转基因法、受精卵移植法、单细胞受精卵微注射法、胚盘嵌合体法、原始生殖细胞嵌合体法的进展及发展动态。阐明了转基因在宿主基因组中的表达特征及转基因禽类研究中出现的问题 。 展开更多

关键词 禽类 转基因技术 成熟儿泡微注射法 反转录病毒载体法 胚胎干细胞法

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人类疾病的基因治疗 被引量：1

13

作者 张嘉敏 《生物学教学》 北大核心 2001年第6期40-42,共3页

关键词 基因治疗 ADA 女孩 人类疾病 回输 反转录病毒载体 正常 小组 导入 输入

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