基于DNA-launched的猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作系统的建立 被引量：4

1

作者 曹宗喜 焦培荣 +3 位作者 谭树义 叶保国 亓文宝 张桂红 《动物医学进展》 北大核心 2016年第11期1-8,共8页

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作系统,将PRRSV全基因组分6段克隆,构建获得6个重组质粒,先由A1和A2片段或B1和B2片段连接构成A片段或B片段,然后D、C、B和A片段依次亚克隆入pOKq载体。在基因组5′端和3′端分别加上CMV... 为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作系统,将PRRSV全基因组分6段克隆,构建获得6个重组质粒,先由A1和A2片段或B1和B2片段连接构成A片段或B片段,然后D、C、B和A片段依次亚克隆入pOKq载体。在基因组5′端和3′端分别加上CMV启动子序列和BGH终止信号肽,全基因组510位核苷酸突变引入遗传标记位点FseⅠ。测序正确的全基因组质粒命名为pOK-A2BCD。再将pOK-A2BCD质粒转染BHK-21细胞,拯救病毒通过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,结果表明拯救病毒成功,为进一步研究PRRSV致病性等相关分子机制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 反向遗传操作系统 构建

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H4N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的构建 被引量：2

2

作者 王帅 梁立滨 +4 位作者 邓国华 施建忠 姜永萍 关云涛 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期90-93,共4页

为建立H4N2亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究构建了A/Duck/JiangXi/21046/2012(H4N2)(W-DKJX)的8个重组质粒,拯救出A/Duck/JiangXi/21046/2012(H4N2)(R-DKJX)。全基因组序列测序结果表明,拯救病毒R-DKJX与野生病毒W-DKJX的... 为建立H4N2亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究构建了A/Duck/JiangXi/21046/2012(H4N2)(W-DKJX)的8个重组质粒,拯救出A/Duck/JiangXi/21046/2012(H4N2)(R-DKJX)。全基因组序列测序结果表明,拯救病毒R-DKJX与野生病毒W-DKJX的核苷酸序列完全相同。受体结合试验表明,野生病毒与拯救病毒均具有人型受体结合特性。以106EID50/50μL剂量鼻腔感染BALB/c小鼠,病毒均仅在小鼠的呼吸道复制,对BALB/c小鼠呈低致病性,可以在感染早期引起小鼠体重轻微下降但并未引起发病或死亡。以上结果表明,两者保持了一致的生物学特性。H4N2亚型AIV反向遗传操作系统的构建为进一步研究H4亚型AIV的致病机理及其跨种传播分子机制等提供了技术平台。 展开更多

关键词 H4N2 禽流感病毒 反向遗传操作系统

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坦布苏病毒MM1775株反向遗传操作系统的建立

3

作者 闫大为 吴晓刚 +5 位作者 李雪松 石迎 冯琳琳 崔宏锐 李国新 李泽君 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2015年第4期8-13,共6页

本研究将坦布苏病毒MM1775株全基因组分3段克隆,获得3个重组质粒,利用融合PCR方法扩增得到5'端含有T 7启动子的病毒全长c DNA,经体外转录得到感染性的RNA,将RNA转染DF-1细胞,48 h后出现细胞病变。当细胞病变达到90%,将细胞上清接种D... 本研究将坦布苏病毒MM1775株全基因组分3段克隆,获得3个重组质粒,利用融合PCR方法扩增得到5'端含有T 7启动子的病毒全长c DNA,经体外转录得到感染性的RNA,将RNA转染DF-1细胞,48 h后出现细胞病变。当细胞病变达到90%,将细胞上清接种DF-1细胞,72 h后进行间接免疫荧光(indirect immunofulorescence,IFA)和RT-PCR鉴定,结果表明拯救病毒成功。序列测定结果显示,拯救毒的全基因组序列与亲本毒完全一致,表明MM1775反向遗传操作系统构建成功,为进一步研究坦布苏病毒致病性等相关分子机制奠定了基础。 展开更多

关键词 坦布苏病毒 MM1775 反向遗传操作系统

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H3N2亚型犬流感病毒反向遗传操作系统的建立 被引量：4

4

作者 段旭彤 荣广玉 +8 位作者 田巧珍 申伟霞 李雪松 陈鸿军 刘芹防 杨健美 滕巧泱 赵凯 李泽君 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2017年第3期7-11,共5页

H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)可以在犬中迅速的传播,甚至引起犬的死亡,也可感染其他哺乳动物。目前该病毒致病的分子机制尚不清楚。为此,本研究采用RT-PCR技术扩增犬流感病毒A/Canine/Zhejiang/01/2010(H3N2)(简称ZJ... H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)可以在犬中迅速的传播,甚至引起犬的死亡,也可感染其他哺乳动物。目前该病毒致病的分子机制尚不清楚。为此,本研究采用RT-PCR技术扩增犬流感病毒A/Canine/Zhejiang/01/2010(H3N2)(简称ZJ2010)的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS 8个基因片段,并分别克隆至双向表达载体p BD上。采用8质粒系统共转染293T细胞,转染48 h后加入TPCK胰酶作用2 h,将上清和细胞一同接种9~11日龄SPF鸡胚,并检测血凝效价。结果显示,本研究成功拯救获得了病毒株r ZJ2010。r ZJ2010株的8个基因片段的序列均与亲本ZJ2010株的序列相同。r ZJ2010株与ZJ2010株在鼠的肺和鼻中复制水平接近。这些结果证实,本研究已成功建立H3N2亚型犬流感病毒反向株遗传操作系统,为该病毒的致病机理、传播机制以及跨宿主传播机制研究等奠定了技术平台。 展开更多

关键词 犬流感病毒 H3N2亚型 反向遗传操作系统

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H7N9亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗候选株的构建 被引量：2

5

作者 李媛媛 郭晶 +6 位作者 李旭勇 王金良 范俊 梁立滨 邓国华 施建忠 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期407-409,共3页

为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核... 为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核苷酸序列完全一致。同时以A/PueaoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以CK/53的HA和NA的表面基因为供体,构建H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8,疫苗株的8个基因来源与预期完全一致。对rCK/53以及疫苗候选株CK53/PR8在MDCK和A549两种细胞中进行生物学特性的比较,在A549中复制差异不显著,而在MDCK中48 h和72 h两者复制具有明显差异。rCK/53反向遗传操作系统的建立和疫苗候选株CK53/PR8的构建为进一步开展H7N9亚型AIV跨宿主传播机制、致病机理及进一步的免疫保护实验奠定了基础。 展开更多

关键词 H7N9 禽流感病毒 反向遗传操作系统 疫苗候选株

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H6N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立 被引量：2

6

作者 张国权 王国俊 +6 位作者 罗维玉 姜永萍 施建忠 邓国华 田石 杨孝朴 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期346-349,共4页

为建立H6N6亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/GuangDong/S1311/10(W-CKGD)反向遗传操作系统,本研究构建了W-CKGD的8个重组质粒,拯救出AIV A/Chicken/GuangDong/S1311/10(R-CKGD)。全基因序列测定结果表明,救获病毒R-CKGD与野生病毒W-CKGD... 为建立H6N6亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/GuangDong/S1311/10(W-CKGD)反向遗传操作系统,本研究构建了W-CKGD的8个重组质粒,拯救出AIV A/Chicken/GuangDong/S1311/10(R-CKGD)。全基因序列测定结果表明,救获病毒R-CKGD与野生病毒W-CKGD的核苷酸序列完全相同。R-CKGD与W-CKGD具有相同的受体结合特性和对BALB/c小鼠均呈低致病性,以106EID50剂量鼻腔感染BALB/c小鼠,病毒仅在小鼠的呼吸道复制,可以引起小鼠体重下降但均不造成死亡。实验结果表明,R-CKGD与W-CKGD保持了一致的生物学特性,从而为进一步研究H6亚型AIV的致病机理及跨宿主传播机制等提供了良好的平台。 展开更多

关键词 H6N6 禽流感病毒 反向遗传操作系统

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H7N3亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立

7

作者 冯琳琳 滕巧泱 +3 位作者 闫丽萍 李雪松 申之义 李泽君 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2016年第1期27-31,共5页

为建立H7N3亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)A/Duck/Zhejiang/690/2009(H7N3)(ZJ690)、A/Duck/Zhejiang/766/2009(H7N3)(ZJ766)反向遗传操作系统,本研究采用8质粒系统共转染293T细胞,成功拯救出了R-ZJ690和R-ZJ766 2株病毒。... 为建立H7N3亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)A/Duck/Zhejiang/690/2009(H7N3)(ZJ690)、A/Duck/Zhejiang/766/2009(H7N3)(ZJ766)反向遗传操作系统,本研究采用8质粒系统共转染293T细胞,成功拯救出了R-ZJ690和R-ZJ766 2株病毒。对获救病毒株进行全基因序列的测定,证实获救病毒的序列与亲本毒的序列完全一致。将H7N3亚型AIV亲本毒ZJ690株、ZJ766株和拯救病毒R-ZJ690株、R-ZJ766株均以106EID50剂量经鼻腔感染6周龄BALB/c小鼠,病毒均引起小鼠的体重下降但不造成死亡,感染后d4,仅在小鼠的鼻和肺中可以分离到病毒。由此可见,R-ZJ690、R-ZJ766与其亲本毒ZJ690株、ZJ766株保持了一致的生物学特性。本研究成功建立了H7N3 AIV ZJ690、ZJ766株的反向遗传操作系统,为H7亚型AIV的致病机理和跨宿主传播机制研究等奠定了基础。 展开更多

关键词 禽流感病毒 亚型H7N3 反向遗传操作系统

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甲型流感病毒反向遗传操作系统研究进展 被引量：1

8

作者 杨景 郭锦玥 +1 位作者 黄淑坚 温峰 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第4期207-212,共6页

甲型流感病毒(IAV)是一类严重危害人畜健康的人兽共患病病毒。经过三十多年的发展,从基因型到表型的反向遗传操作系统已被熟练应用于IAV各方面的研究。反向遗传操作系统彻底改变了传统的IAV研究策略,能够通过在基因组中引入特定的突变... 甲型流感病毒(IAV)是一类严重危害人畜健康的人兽共患病病毒。经过三十多年的发展,从基因型到表型的反向遗传操作系统已被熟练应用于IAV各方面的研究。反向遗传操作系统彻底改变了传统的IAV研究策略,能够通过在基因组中引入特定的突变而改变病毒生物学特性,也为疫苗的研制提供了新思路。本文就IAV反向遗传操作系统的发展历史和基本原理进行了综述。 展开更多

关键词 甲型流感病毒 反向遗传操作系统 疫苗

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利用反向遗传操作技术拯救重组新城疫病毒 被引量：2

9

作者 郝景波 吴云舟 +3 位作者 刘艾林 尹杰超 任桂萍 李德山 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期73-77,共5页

将新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Anhinga株的全长cDNA的克隆质粒以及L、P、NP的表达质粒共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSRT7/5细胞,得到拯救病毒。通过RT-PCR扩增、酶切鉴定、测序验证拯救病毒中分子标签的存在,并通过血凝... 将新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Anhinga株的全长cDNA的克隆质粒以及L、P、NP的表达质粒共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSRT7/5细胞,得到拯救病毒。通过RT-PCR扩增、酶切鉴定、测序验证拯救病毒中分子标签的存在,并通过血凝试验测定病毒的血凝效价、测定蚀斑形成单位确定病毒滴度,从而证明病毒拯救成功。新城疫病毒Anhinga株的拯救成功为该病毒进行结构基因研究和疫苗研制奠定了基础。 展开更多

关键词 新城疫病毒 病毒拯救 共转染 反向遗传操作系统

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H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作平台的建立 被引量：2

10

作者 陈新武 石晓娜 +6 位作者 潘学 李雪松 杨健美 刘芹防 陈鸿军 滕巧泱 李泽君 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2020年第2期61-65,共5页

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在自然界中广泛存在和传播,给养禽业造成了巨大损失。为了进一步揭示该病毒的致病机制,本研究采用RT-PCR技术扩增禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/1/2006(简称SH1)的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS 8个基因片段... H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在自然界中广泛存在和传播,给养禽业造成了巨大损失。为了进一步揭示该病毒的致病机制,本研究采用RT-PCR技术扩增禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/1/2006(简称SH1)的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS 8个基因片段,并分别克隆至PLLB双向表达载体上。采用8质粒系统共转染293T细胞,转染48 h后加入TPCK胰酶作用2 h,将上清液和细胞一同接种9~11日龄SPF鸡胚,并检测其血凝效价。经序列比对,拯救获得的病毒rSH1的8个基因片段序列均与亲本病毒SH1的序列相同。实验结果表明,本研究成功建立了H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统,为该病毒的致病机理和传播机制研究等奠定了技术平台。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H9N2 反向遗传操作系统 致病

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H3N2禽流感病毒反向遗传操作平台的建立

11

作者 石晓娜 闫婉婉 +6 位作者 陈新武 潘学 李雪松 刘芹防 杨健美 李泽君 滕巧泱 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第5期150-156,共7页

近几年,禽流感病毒(AIV)跨越禽-犬屏障产生新型H3N2犬流感病毒,后者在亚洲多国的犬中广泛流行,造成潜在的公共卫生安全威胁。尽管如此,H3N2 AIV如何跨宿主传播至犬的分子机制尚不清楚。为此,本研究利用早期筛选到的一株不感染犬和鼠,但... 近几年,禽流感病毒(AIV)跨越禽-犬屏障产生新型H3N2犬流感病毒,后者在亚洲多国的犬中广泛流行,造成潜在的公共卫生安全威胁。尽管如此,H3N2 AIV如何跨宿主传播至犬的分子机制尚不清楚。为此,本研究利用早期筛选到的一株不感染犬和鼠,但感染禽的H3N2禽流感病毒A/Duck/Shanghai/01/2009(H3N2)(简称为SH01),通过RT-PCR技术扩增了病毒的8个全基因片段,并分别克隆至PLLB双向表达载体上。将构建成功的8个质粒纯化后共转染293T细胞,转染48 h后加入TPCK胰酶作用2 h,将上清液和细胞一同接种9~11日龄SPF鸡胚,检测其血凝效价。经测序分析,确定获救病毒的8个基因片段序列与亲本毒株的序列完全一致,表明该病毒拯救成功。H3N2禽流感病毒反向遗传操作平台的成功建立为探索该病毒跨宿主传播犬的分子机制提供了工具。 展开更多

关键词 H3N2 禽流感病毒 反向遗传操作系统

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反向遗传学技术应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒研究的进展 被引量：3

12

作者 郑海红 孙竹筠 +2 位作者 张可煜 高飞 韦祖樟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1072-1076,共5页

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinere productive and respiratory syndrome virus, PRRSV)属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员。根据血清学和遗传特性的差异,可将PRRSV分为欧洲型(1型)和美洲型(2型)[1]。... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinere productive and respiratory syndrome virus, PRRSV)属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员。根据血清学和遗传特性的差异,可将PRRSV分为欧洲型(1型)和美洲型(2型)[1]。随着反向遗传操作系统的建立,使对RNA病毒基因组在其cDNA分子水平上进行体外人工操作成为可能,如对基因进行点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造。近年来,科学家通过对PRRSV基因组的反向遗传操作[2-6],在研究PRRSV的基因复制、亚基因组转录与表达调控机理、PRRSV与宿主间的相互作用关系以及PRRSV用于异源基因表达载体来开发抗病毒疫苗等研究,取得了一些显著成果。本文就应用反向遗传学技术来研究PRRSV的进展报告做一综述。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 反向遗传操作系统 动脉炎病毒属 遗传特性 反向遗传学技术 美洲型 RNA病毒 基因复制

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新城疫病毒Mukteswar株反向遗传平台的建立 被引量：1

13

作者 魏家阳 李丽 +7 位作者 王国康 徐英英 曾哲 罗青平 邵华斌 温国元 商雨 潘兹书 《动物医学进展》 北大核心 2023年第2期30-35,共6页

为了建立新城疫疫苗株Mukteswar株的反向遗传操作系统,根据Mukteswar株的基因序列设计了9对引物,扩增获得基因组片段,通过Overlap PCR和In-Fusion无缝克隆的技术,将9个片段拼接和插入至pACNR-T7中,获得了Mukteswar株全长cDNA克隆质粒pAC... 为了建立新城疫疫苗株Mukteswar株的反向遗传操作系统,根据Mukteswar株的基因序列设计了9对引物,扩增获得基因组片段,通过Overlap PCR和In-Fusion无缝克隆的技术,将9个片段拼接和插入至pACNR-T7中,获得了Mukteswar株全长cDNA克隆质粒pAC-Mukteswar。将其和3个辅助质粒(pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L)共转染至预先感染了痘病毒vTF7-3的BHK-21细胞,成功拯救出重组病毒rMukteswar。对rMukteswar的生长曲线、最小致死剂量的平均致死时间(MDT)等生物学特性进行测定,结果显示rMukteswar具有和野生株相似的增殖特性和毒力。成功建立了新城疫疫苗株Mukteswar的反向遗传操作系统,为研发高效率表达外源病原体蛋白的新城疫载体疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 新城疫病毒 Mukteswar株 反向遗传操作系统

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基于真核CMV启动子构建猪瘟病毒感染性cDNA克隆与病毒拯救 被引量：1

14

作者 关飞虎 王静 +6 位作者 宋亚芬 温立佳 田野 蒋颖 杨承槐 张辉 张乾义 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期561-567,607,共8页

为建立猪瘟病毒(CSFV)反向遗传操作系统,本研究将CSFV石门株(SM)全基因组克隆至pBAC11载体中,并采用重叠延伸PCR方法在病毒基因组5'端和3'端分别加入CMV真核启动子序列和RzBGH序列,并将其基因组nt2809的碱基C突变为T,将原有的Af... 为建立猪瘟病毒(CSFV)反向遗传操作系统,本研究将CSFV石门株(SM)全基因组克隆至pBAC11载体中,并采用重叠延伸PCR方法在病毒基因组5'端和3'端分别加入CMV真核启动子序列和RzBGH序列,并将其基因组nt2809的碱基C突变为T,将原有的AfeⅠ酶切位点突变消失作为拯救病毒的遗传标记。将构建的质粒转染PK-15细胞培养后,收集细胞上清盲传3代后通过RT-PCR扩增蛋白编码基因,并经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。RT-PCR鉴定结果显示扩增到CSFV特异性基因;IFA结果显示接种病毒的细胞出现绿色荧光。表明病毒拯救成功,将其命名为BAC-rSM。将BAC-rSM株在PK-15细胞中连续传18代,将第18代病毒经RT-PCR扩增E2基因,并对遗传标记的位点经Afe I酶切和鉴定,分析BAC-rSM病毒的遗传稳定性,结果显示第18代BAC-rSM株遗传标记稳定存在,表明拯救的病毒具有遗传稳定性。将BAC-rSM和SM株病毒分别以MOI 1感染PK-15细胞,在感染后不同时间点收获病毒并测定病毒滴度,结果显示BAC-rSM和SM株生长动力学特征基本一致。对第18代BAC-rSM株与SM株进行全基因组序列比对分析,利用在线软件npsa-prabi.ibcp.fr/对Erns和E2蛋白二级结构预测,采用荧光定量PCR(qPCR)对BAC-rSM和SM株感染PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平。全基因测序比对分析结果显示,BAC-rSM株基因组共存在46个碱基突变,经预测其Erns和E2的突变导致各自的二级结构改变;qPCR检测结果显示,相对SM感染的PK-15细胞,BAC-rSM感染后8 h和24 h PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01)。本研究建立了一种简单、操作方便的CSFV反向遗传操作系统的方法,为进一步开展CSFV的分子生物学、毒力决定因素、分子发病机制、疫苗开发和病毒与宿主相互作用的研究提供了新的技术方法。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 CMV启动子 感染性克隆 反向遗传操作系统

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Clade7．2H5N1亚型禽流感重组病毒疫苗株的构建及免疫效力评价 被引量：4

15

作者 宋洋铭 谷春阳 +3 位作者 曾显营 邓国华 杨孝朴 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期580-584,共5页

致病性禽流感病毒(AIV)编码HA抗原基因的不断进化,进而出现抗原性变异是导致原有疫苗无法提供完全免疫保护的主要原因,因此需要构建并更新疫苗株。本研究在系统分析AIV病毒抗原性基础上,采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8... 致病性禽流感病毒(AIV)编码HA抗原基因的不断进化,进而出现抗原性变异是导致原有疫苗无法提供完全免疫保护的主要原因,因此需要构建并更新疫苗株。本研究在系统分析AIV病毒抗原性基础上,采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以clade7.2 H5亚型A/chicken/He Bei BD/SC007/2012(CK/BD/2012)的c DNA为模板经SOE-PCR扩增,将高致病性AIV的HA基因编码裂解位点序列336PQIEGRRRKR348突变为低致病性特征的336PQRETR343序列,以A/chicken/Shanxi/2/2006(CK/SX/2/2006)作为NA基因的供体,构建clade7.2 AIV疫苗候选株r PR8-BD/2012,并对其进行生物学特性和免疫原性评估。结果显示,该疫苗候选株对鸡胚无致病性,能够在鸡胚中高滴度生长(9 log2),静脉内接种致病指数(IVPI)为0,对雏鸡无致病性。将r PR8-CK/BD/2012作为种毒,按照常规方法制备灭活疫苗,免疫4周龄SPF雏鸡,免疫3周后对亲本强毒株的HI平均抗体效价达7.2 log2;采用亲本强毒A/chicken/He Bei BD/SC007/2012和同分支异源强毒株A/chicken/He Bei/SD001/2013以105 EID50剂量攻击,免疫组均能够得到完全保护。以上结果表明r PR8-CK/BD/2012疫苗候选株具有鸡胚适应性、生物安全性和良好的免疫原性,可以作为有效防控clade7.2 H5N1 AIV的疫苗株。 展开更多

关键词 H5N1 禽流感病毒 反向遗传操作系统 疫苗株 免疫效力评价

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重组新城疫病毒Anhinga株与TRAIL蛋白协同杀伤肿瘤细胞 被引量：5

16

作者 郝景波 王文飞 +5 位作者 吴云舟 刘铭瑶 高振秋 张巧 颜世君 李德山 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期32-39,共8页

将新城疫病毒(Newscastle disease virus,NDV)Anhinga株的全长基因组cDNA克隆质粒、pTM1-L、pTM1-P、pTM1-NP表达质粒共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSRT7/5细胞,得到拯救NDV病毒.通过PCR、酶切法、测序证明拯救病毒中存在引入的分子标签... 将新城疫病毒(Newscastle disease virus,NDV)Anhinga株的全长基因组cDNA克隆质粒、pTM1-L、pTM1-P、pTM1-NP表达质粒共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSRT7/5细胞,得到拯救NDV病毒.通过PCR、酶切法、测序证明拯救病毒中存在引入的分子标签.通过血凝实验、蚀斑测定证明成功拯救病毒.并研究了该重组病毒对4种不同人肿瘤细胞的体外杀伤效果.首次证明重组Anhinga株对SMMC-7721细胞、A549细胞、HepG2细胞和SH-SY5Y细胞均有杀伤作用.该重组病毒主要诱导SMMC-7721细胞和A549细胞凋亡,诱导HepG2细胞和SH-SY5Y细胞坏死.TNF家族成员TRAIL蛋白可以显著增强NDV杀伤肿瘤细胞的效果.本实验为进一步研究重组NDV用于肿瘤治疗奠定基础. 展开更多

关键词 新城疫病毒 反向遗传操作系统 肿瘤治疗

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狂犬病毒糖蛋白基因的重排及病毒的拯救 被引量：24

17

作者 郭霄峰 富振芳 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期104-106,共3页

为了从分子水平研究狂犬病糖蛋白基因(G)从第4位重排至第1位后病毒的结构、功能及病毒致病性的变化,运用基因突变、反向遗传技术的原理与方法,将狂犬病毒(RV)糖蛋白基因从野生型的第4位(N-P-M-G-L)重排于第1位(G-N-P-M-L),并成功地拯救... 为了从分子水平研究狂犬病糖蛋白基因(G)从第4位重排至第1位后病毒的结构、功能及病毒致病性的变化,运用基因突变、反向遗传技术的原理与方法,将狂犬病毒(RV)糖蛋白基因从野生型的第4位(N-P-M-G-L)重排于第1位(G-N-P-M-L),并成功地拯救已发生基因重排的狂犬病毒. 展开更多

关键词 狂犬病毒 反向遗传操作系统 糖蛋白基因 基因重排

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表达绿色荧光蛋白重组猪塞内卡病毒的构建及初步应用 被引量：5

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作者 张晓战 杨磊 +8 位作者 邓同炜 赵攀登 彭志锋 陈露露 郭懿文 夏艳勋 乔宏兴 边传周 王增 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期2978-2985,共8页

塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在... 塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在实验室前期对SVA研究的基础上建立稳定表达绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒,为体外高通量筛选具有抗SVA活性药物提供一种简单快速有效的工具。本研究在pEGFP-C1载体EGFP基因末端引入猪捷申病毒1型的2A基因,构建EGFP-P2A融合基因过度质粒,随后分别设计带有同源臂的克隆引物,通过同源重组技术将EGFP-P2A基因插入SVA毒株CH/HeN-2018基因组2A和2B基因间,并经测序鉴定,成功构建重组载体pSVA-EGFP。将pSVA-EGFP转染PK-15细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的重组SVA荧光毒rCH/HeN-2018-EGFP。通过绿色荧光观察、RT-PCR和生长曲线测定,评估了重组毒株rCH/HeN-2018-EGFP和亲本毒株生长特性。并进一步通过药物细胞毒性试验和病毒感染试验对rCH/HeN-2018-EGFP作为潜在抗SVA药物筛选工具进行评价。结果表明,rCH/HeN-2018-EGFP与亲本毒株wtCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018在PK-15细胞中具有相似的生长特性,且遗传稳定,在P10代能够稳定表达绿色荧光,插入的EGFP-P2A基因没有出现突变现象。抗SVA病毒感染试验结果表明,用终浓度20μmol·L^(-1)的姜黄素和110μmol·L^(-1)黄芩苷预处理PK-15细胞2 h,通过观察荧光细胞的数量直观判断两种药物均能够抑制rCH/HeN-2018-EGFP在细胞中的复制,其中黄芩苷抑制效果极显著。随后在亲本毒株wtCH/HeN-2018感染试验进一步证实了黄芩苷对SVA病毒复制抑制的效果。本研究所构建的携带EGFP基因的重组SVA毒株能够高效稳定地表达绿色荧光蛋白,可以作为一种工具报告病毒应用于抗SVA药物和蛋白的筛选过程。 展开更多

关键词 塞内卡病毒 反向遗传操作系统 报告病毒 绿色荧光蛋白 抗病毒药物筛选

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表达鸡毒支原体TM1蛋白基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究 被引量：5

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作者 冯秋霖 刘茂军 +4 位作者 祁芳 陈曦 邵国青 葛金英 步志高 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期779-782,共4页

为研制安全、有效的新型鸡毒支原体(MG)疫苗,本研究利用新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,构建出表达MG TM1蛋白的重组病毒rLa-TM1,并对其生物学特性进行鉴定,评估其作为MG活载体疫苗的安全性和有效性。通过免疫荧光试... 为研制安全、有效的新型鸡毒支原体(MG)疫苗,本研究利用新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,构建出表达MG TM1蛋白的重组病毒rLa-TM1,并对其生物学特性进行鉴定,评估其作为MG活载体疫苗的安全性和有效性。通过免疫荧光试验表明TM1蛋白获得正确表达;经测定,重组病毒平均鸡胚致死时间(MDT)为132 h,脑内致死指数(ICPI)和静脉内致病指数(IVPI)均为0,保持了LaSota亲本株的低致病性;rLa-TM1接种鸡胚所收集尿囊液中的病毒滴度可高达每毫升109.5EID50以上,证明重组病毒保持了LaSota亲本株高滴度鸡胚生长特性;重组病毒rLa-TM1接种1周龄的雏鸡后,可以诱导显著的MG抗体反应;攻毒保护试验证明其保护率可以达90%,而对照组全部发病(10/10)。本研究表明重组病毒rLa-TM1可以作为MG重组病毒活载体疫苗的候选疫苗。 展开更多

关键词 鸡毒支原体 反向遗传操作系统 重组新城疫病毒

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猫杯状病毒HRB-SS株感染性cDNA克隆的构建与病毒的拯救 被引量：3

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作者 孙伟尧 宋海军 +2 位作者 刘春国 杨德成 王靖飞 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期1080-1084,共5页

为构建猫杯状病毒(FCV)HRB-SS株的感染性克隆,本研究合成3’端含有丁肝病毒核酶(HdvRz)序列的HRB-SS株全长基因组序列,将该序列插入p OK12-CMV载体,获得含FCV HRB-SS全长基因组cDNA克隆的重组质粒p FCV-HRB-SS。将重组质粒p FCV-HRB-SS... 为构建猫杯状病毒(FCV)HRB-SS株的感染性克隆,本研究合成3’端含有丁肝病毒核酶(HdvRz)序列的HRB-SS株全长基因组序列,将该序列插入p OK12-CMV载体,获得含FCV HRB-SS全长基因组cDNA克隆的重组质粒p FCV-HRB-SS。将重组质粒p FCV-HRB-SS转染猫肾细胞(CRFK),48 h即可观察到典型细胞病变,将病变细胞的上清接种未感染的CRFK细胞进行传代培养,连续传5代,从感染的细胞上清中获得拯救病毒。采用FCV VP1蛋白MAb,经间接免疫荧光试验检测,结果显示拯救病毒与亲本病毒均可观察到特异性绿色荧光,而未感染病毒的对照组细胞无荧光信号;各组细胞负染色后经电镜观察均可见病毒粒子呈典型的杯状结构。提取拯救病毒和亲本病毒基因组RNA,反转录为c DNA作为模板,经RT-PCR扩增、Kpn I酶切鉴定及测序分析,结果显示,拯救病毒含C^(5724)G位点突变的分子标记,消除了Kpn I酶切位点,不同于亲本病毒。上述结果表明获得拯救病毒r FCV HRB-SS。采用蚀斑形成试验和绘制病毒的一步生长曲线进一步检测r FCV HRB-SS,结果显示,r FCV HRB-SS与亲本病毒具有一致的复制水平和体外生长能力。本研究利用真核启动子构建的FCV HRB-SS株全长感染性cDNA克隆系统可直接在细胞内转录,减少了体外操作流程,有效防止了操作污染,具有操作简便,拯救效率高的优势,为后续FCV基因功能的研究和新型疫苗的研发奠定了基础。 展开更多

关键词 猫杯状病毒 感染性cDNA克隆 反向遗传操作系统

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