番木瓜β-Gal基因RNAi双T-DNA植物表达载体的构建及其遗传转化的初步研究 被引量：2

1

作者 何玮毅 陈晓静 +2 位作者 申艳红 卢秉国 潘东明 《热带亚热带植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期556-561,共6页

克隆了番木瓜(Carica papaya L.)果肉的细胞壁水解关键酶β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因保守区,将其反向重复插入载体pKANNIBAL,构建RNAi中间表达载体pKAN/RG,将其上的发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA1300上hptⅡ基因,构建中间表达载体p130... 克隆了番木瓜(Carica papaya L.)果肉的细胞壁水解关键酶β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因保守区,将其反向重复插入载体pKANNIBAL,构建RNAi中间表达载体pKAN/RG,将其上的发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA1300上hptⅡ基因,构建中间表达载体p1300-/MFRG,分离单T-DNA区段,与载体pCAMBIA2301构建RNAi双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG。酶切分析和PCR检测表明,p2301/TTRG已被成功导入农杆菌EHA105。通过遗传转化,初步获得了GUS染色呈阳性且具Kan抗性的番木瓜胚性愈伤组织。 展开更多

关键词 番木瓜 Β-半乳糖苷酶 RNA干扰 双t—dna植物表达载体 遗传转化

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可去除选择标记的DREB基因双T-DNA载体共转化玉米 被引量：6

2

作者 谭登峰 韩兆雪 +2 位作者 曹墨菊 潘光堂 荣廷昭 《四川农业大学学报》 CSCD 2008年第1期15-19,共5页

通过体外重组构建双T-DNA双元载体pCDMARpWDT-Hyg,选择标记基因hpt(hygromycin phospho-transferase)和抗逆转录因子基因DREB分别位于两个独立的T-DNA。用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,通过在抗性培养基上严格筛选,在获得的再生转... 通过体外重组构建双T-DNA双元载体pCDMARpWDT-Hyg,选择标记基因hpt(hygromycin phospho-transferase)和抗逆转录因子基因DREB分别位于两个独立的T-DNA。用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,通过在抗性培养基上严格筛选,在获得的再生转化植株中,同时整合hpt基因和DREB基因的共转化率达到26·3%。该转化系统的建立为下一步得到无选择标记的转基因植株奠定基础。此外,本实验还通过gus基因的瞬时表达分析了农杆菌转化玉米的影响因素。 展开更多

关键词 玉米 DREB基因 双t—dna载体 农杆菌介导法 瞬时表达

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CMO,BADH双基因植物表达载体的构建 被引量：1

3

作者 何宇锋 刘君 +1 位作者 韩烈保 陈其军 《生物技术通报》 CAS CSCD 2005年第5期63-66,共4页

以pC1303质粒和pC1391质粒为基础,利用载体pBIUC和pBIB构建了分别有Ubi启动子、35S启动子调控的带有控制甜菜碱合成的CMO和BADH的植物表达载体pC1303-Ubi-CMO-35S-BADH,为进一步开展提高植物抗逆性基因工程提供了基础。

关键词 双基因表达载体 甜菜碱 CMO BADH 植物表达载体 BADH 基因工程 CMO 构建 35S启动子 植物抗逆性 甜菜碱 基础

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利用双T-DNA载体获得无筛选标记的转基因猕猴桃

4

作者 刘艺 周罗琴 +3 位作者 黄苛 苑平 朱杰 田宏现 《江苏农业科学》 北大核心 2013年第6期56-57,共2页

以美味猕猴桃品种米良1号的当年生嫩枝及叶片为外植体,构建了1个双T-DNA载体pCAMBIA1300-actin-term-2,通过根癌农杆菌EHA105菌株作为介导,将aco反义基因导入米良1号猕猴桃中。通过后代植株的遗传分离,以期获得无潮霉素筛选标记的转基... 以美味猕猴桃品种米良1号的当年生嫩枝及叶片为外植体,构建了1个双T-DNA载体pCAMBIA1300-actin-term-2,通过根癌农杆菌EHA105菌株作为介导,将aco反义基因导入米良1号猕猴桃中。通过后代植株的遗传分离,以期获得无潮霉素筛选标记的转基因植株。结果表明,愈伤组织预培养20 d,侵染30 min,EHA105菌液浓度Dnm=0.6,培养5 d,经PCR法检测证明aco反义基因已转入转化植株基因组中。 展开更多

关键词 ACO反义基因 遗传转化 双t—dna载体

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基于phy基因的双边界植物表达载体构建

5

作者 赵鄢鹏 李杰 +4 位作者 刘琦 夏善勇 吴立成 王秀君 李希臣 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期394-397,共4页

采用同源克隆方法从泡盛曲霉中克隆了1515bp的植酸酶基因,与黑曲霉(A.niger963)phyA2的核苷酸同源性为95%。以植物表达载体pTTBUG8为基础,构建了由35S启动子调控、具有磷高效利用功能基因(phy)的双边界植物表达载体pBSP。解决了bar基因... 采用同源克隆方法从泡盛曲霉中克隆了1515bp的植酸酶基因,与黑曲霉(A.niger963)phyA2的核苷酸同源性为95%。以植物表达载体pTTBUG8为基础,构建了由35S启动子调控、具有磷高效利用功能基因(phy)的双边界植物表达载体pBSP。解决了bar基因及其产物PAT蛋白的安全性及产权等问题,并为植物养分高效利用基因工程研究奠定了重要基础。 展开更多

关键词 phy基因 BAR基因 双边界植物表达载体 安全性

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多基因植物表达载体的构建 被引量：13

6

作者 冯道荣 邱国华 +2 位作者 许新萍 刘秋云 李宝健 《西北植物学报》 CAS CSCD 2001年第4期609-614,共6页

将功能互补的抗真菌病基因或抗虫基因共同转化水稻植株 ,可望获得既抗病又抗虫的转基因水稻植株。马铃薯蛋白酶抑制剂 基因 Pin ,苏云金杆菌毒蛋白 Cry ( b)基因 B.t.,以及 PPT乙酰转移酶基因 bar构建在一个载体上。水稻碱性几丁质酶基... 将功能互补的抗真菌病基因或抗虫基因共同转化水稻植株 ,可望获得既抗病又抗虫的转基因水稻植株。马铃薯蛋白酶抑制剂 基因 Pin ,苏云金杆菌毒蛋白 Cry ( b)基因 B.t.,以及 PPT乙酰转移酶基因 bar构建在一个载体上。水稻碱性几丁质酶基因 RC2 4与大麦核糖体失活蛋白基因 B- RIP构建在另一个载体上。两载体共同转化水稻植株的工作正在进行之中。 展开更多

关键词 PinⅡ B.t RC24 B-RIP 植物 表达载体 转基因 多基因表达 抗病抗虫性

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eGfp/Gus融合基因植物表达载体的构建和转化验证 被引量：4

7

作者 吴学龙 何海燕 +1 位作者 刘智宏 黄锐之 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第4期645-650,共6页

绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是广泛应用的2个报告基因,在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。为联合使用这2个报告基因,根据报告基因序列设计2对带有特异限制性内切酶位点的引物,PCR法分别扩增... 绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是广泛应用的2个报告基因,在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。为联合使用这2个报告基因,根据报告基因序列设计2对带有特异限制性内切酶位点的引物,PCR法分别扩增增强型Gfp(eGfp)和Gus基因,连接到植物表达载体pF-GC5941中,构建含CaMV35S启动子驱动的eGfp/Gus基因融合表达载体,命名为pFGC-DR。注射农杆菌法转化烟草叶片,以及花器官农杆菌浸泡法转化拟南芥,发现融合基因成功地在烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥中稳定表达,表明融合报告基因在烟草和拟南芥中都能高效表达。 展开更多

关键词 eGfp/Gus双报告基因 植物表达载体 瞬时表达 转基因表达

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节瓜抗镰刀菌酸突变体内切几丁质酶基因的克隆与植物表达载体构建 被引量：3

8

作者 赵芹 谢大森 +3 位作者 何晓明 彭庆务 罗少波 陈俊秋 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2016年第3期539-547,共9页

根据节瓜与枯萎病菌互作构建抑制消减文库获得的内切几丁质酶基因EST序列,以节瓜抗镰刀菌酸突变体＂LT3＂为试材,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,获得了该基因全长c DNA序列,命名为Cq Chi I。序列测定和生物信息学分析结果表明,该基因c ... 根据节瓜与枯萎病菌互作构建抑制消减文库获得的内切几丁质酶基因EST序列,以节瓜抗镰刀菌酸突变体＂LT3＂为试材,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,获得了该基因全长c DNA序列,命名为Cq Chi I。序列测定和生物信息学分析结果表明,该基因c DNA序列全长1 139 bp,编码区在38~982 bp之间,编码314个氨基酸,蛋白质分子量为33.94 ku,等电点为8.43,具有chitinase_gluco_hydro_19及lysozome_like superfamily功能域,推测该蛋白可能兼具几丁质酶与溶菌酶活性。结构分析表明,该蛋白二级结构中α螺旋、延伸链、β转角与无规则卷曲分别占24.20%、18.15%、7.96%和49.68%,该蛋白为亲水性非跨膜蛋白,1~23氨基酸预测为信号肽。其三级结构高度保守,为class I碱性几丁质酶,属于几丁质酶第19家族,为分泌细胞外蛋白。序列比对与系统进化分析结果显示,Cq Chi I与黄瓜、甜瓜、葫芦、苦瓜等植物几丁质酶基因亲缘关系紧密,与黄瓜碱性内切几丁质酶（XP004134833）相似性最高为85%。进一步构建了植物表达载体p Cambia1300并转化农杆菌EHA105,通过蘸花法转化拟南芥,为后续开展基因功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 节瓜 抗镰刀菌酸突变体 内切几丁质酶基因 c dna克隆 植物表达载体

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冷相关转录因子CBF2基因的克隆及其植物表达载体的构建 被引量：2

9

作者 刘俊 蔡平钟 +4 位作者 马林 张志雄 向跃武 王闵霞 张志勇 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2009年第2期428-432,共5页

从拟南芥Columbia基因组DNA中分别克隆了CBF2基因和低温诱导型启动子Rd29A。测序结果显示:克隆的CBF2基因长725 bp,编码216个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸同源性为99.8%;启动子Rd29A全长为956 bp,与已报道的该启动子序... 从拟南芥Columbia基因组DNA中分别克隆了CBF2基因和低温诱导型启动子Rd29A。测序结果显示:克隆的CBF2基因长725 bp,编码216个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸同源性为99.8%;启动子Rd29A全长为956 bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸同源性为99.5%。以双元载体pCAMBIA1301为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF2,为利用CBF2基因提高植物的耐寒性创造了条件。 展开更多

关键词 CBF2 启动子 克隆 双酶切 植物表达载体

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无选择标记的高光效基因植物表达载体的构建 被引量：2

10

作者 刘峰 许明 +2 位作者 陈福禄 郑回勇 郑金贵 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2003年第2期270-272,共3页

构建无选择标记的玉米高光效基因植物表达载体,旨在利用共转化系统获得无标记基因的高光效转基因植物.

关键词 玉米 高光效基因 共转化系统 表达载体 无选择标记 双质粒双农杆菌 转基因植物

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木薯MeGWD3基因克隆及植物表达载体构建 被引量：1

11

作者 付莉莉 韩冰莹 +2 位作者 谭德冠 孙雪飘 张家明 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期1057-1063,共7页

【目的】克隆木薯葡聚糖水合双激酶(Me GWD3)基因并构建其植物表达载体,为开展木薯Me GWD3基因调控及功能研究提供参考。【方法】采用RT-PCR从木薯华南124(SC124)中克隆Me GWD3基因,对其进行序列分析,并将其连接至改造的p CAMBIA2300载... 【目的】克隆木薯葡聚糖水合双激酶(Me GWD3)基因并构建其植物表达载体,为开展木薯Me GWD3基因调控及功能研究提供参考。【方法】采用RT-PCR从木薯华南124(SC124)中克隆Me GWD3基因,对其进行序列分析,并将其连接至改造的p CAMBIA2300载体,构建植物表达载体p CAMBIA2300-Me GWD3。【结果】Me GWD3基因全长3522 bp,编码1173个氨基酸。经序列比对,发现Me GWD3基因序列与木薯Phytozome数据库中公布的GWD基因(cassava4.1_000497m)只存在2个碱基差异,同源性高达99.94%;与NCBI数据库中收录的木薯GWD基因(JN618460)同源性高达99.00%,与蓖麻GWD基因(XM_002518566)同源性达86.00%;成功构建植物表达载体p CAMBIA2300-Me GWD3。【结论】成功构建的植物表达载体p CAMBIA2300可用于Me GWD3基因功能及木薯淀粉代谢研究。 展开更多

关键词 木薯 葡聚糖水合双激酶 克隆 植物表达载体

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IL-2与猪瘟病毒E_2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用的研究 被引量：1

12

作者 陈创夫 余兴龙 +4 位作者 乔军 马正海 李作生 涂长春 殷震 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2001年第2期90-94,共5页

应用DNA重组技术构建了猪瘟病毒E2 基因与IL 2基因的双表达真核表达载体 ,观察其表达水平 ,并对其免疫增强效果进行了观察。结果是构建了猪瘟病毒E2 基因与白细胞介素 2的真核表达质粒pIRSTIL 2。将质粒转染BHK 2 1细胞 ,可在体外表达E2... 应用DNA重组技术构建了猪瘟病毒E2 基因与IL 2基因的双表达真核表达载体 ,观察其表达水平 ,并对其免疫增强效果进行了观察。结果是构建了猪瘟病毒E2 基因与白细胞介素 2的真核表达质粒pIRSTIL 2。将质粒转染BHK 2 1细胞 ,可在体外表达E2 和有生物活性IL 2。pIRSTIL 2质粒能诱导产生CSFV的特异性免疫反应。pIRSTIL 2所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒pIRST强。实验表明 :IL 2与猪瘟病毒E2 展开更多

关键词 双表达质粒 IL-2 猪瘟 基因疫苗 dna重组技术 免疫增强作用 真核表达载体

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番木瓜β-Gal基因的克隆分析与植物表达载体构建 被引量：1

13

作者 何玮毅 陈晓静 +1 位作者 申艳红 卢秉国 《热带作物学报》 CSCD 2010年第2期217-223,共7页

番木瓜果实采后贮藏期间的迅速软化与β-Gal基因的表达密切相关。利用常规PCR结合反向PCR技术,分离了一条4501bp的番木瓜β-Gal基因组序列。其共含有17个内含子,外显子部分与相应的cDNA序列只有1个碱基的差异。生物信息学分析结果表明,... 番木瓜果实采后贮藏期间的迅速软化与β-Gal基因的表达密切相关。利用常规PCR结合反向PCR技术,分离了一条4501bp的番木瓜β-Gal基因组序列。其共含有17个内含子,外显子部分与相应的cDNA序列只有1个碱基的差异。生物信息学分析结果表明,该番木瓜β-GAL属于糖苷水解酶超级家族42中家族35的成员,在进化过程中与拟南芥的亲缘关系较近,与鳄梨和北美云杉则较远。同时,它还具有一段定位于胞外的信号肽,再次表明其可能参与了果肉细胞壁的降解和果实软化。进一步分离了β-Gal基因启动子,初步验证了其果实表达特异性。将该启动子替换载体p2301/TTRG上的CaMV 35S启动子,构建出RNAi-β-Gal双T-DNA植物表达载体。酶切分析和PCR检测结果表明,载体p2301/BPTTRG已被成功导入农杆菌,可用于后续的遗传转化研究。 展开更多

关键词 番木瓜 Β-半乳糖苷酶 果实特异性启动子 双t-dna植物表达载体

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K88-ST融合基因的克隆及真核表达载体的构建

14

作者 任雪艳 包慧芳 +1 位作者 陈创夫 孔庆军 《动物科学与动物医学》 2004年第11期1-4,共4页

利用DNA重组技术,将编码K88-ST融合基因的序列片段克隆到植物表达载体pCAMBIA1302中,成功的构建了植物重组表达质粒pCAMBIA-K88-ST。并将其转化农杆菌EHA105,为K88-ST基因的进一步研究奠定基础。

关键词 融合基因 真核表达载体 克隆 St 重组表达质粒 构建 dna重组技术 植物表达载体 农杆菌 片段

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条纹斑竹鲨鱼再生肝组织cDNA质粒文库的构建和鉴定 被引量：6

15

作者 赵艳景 胡亚楠 +5 位作者 刘睿 王颖 余江河 叶波平 王旻 吴梧桐 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期82-86,共5页

建立了鲨鱼肝脏的部分切除模型,获得了再生24h的鲨鱼肝组织,分离了再生肝组织的总RNA,纯化了mRNA,利用含BamHI酶切位点的Oligo(dT)16为引物合成cDNA第一链,通过末端转移酶在cDNA第一链3'末端加入Oligo(dC)尾,进而以Oligo(dT)16和含H... 建立了鲨鱼肝脏的部分切除模型,获得了再生24h的鲨鱼肝组织,分离了再生肝组织的总RNA,纯化了mRNA,利用含BamHI酶切位点的Oligo(dT)16为引物合成cDNA第一链,通过末端转移酶在cDNA第一链3'末端加入Oligo(dC)尾,进而以Oligo(dT)16和含HindIII酶切位点的Oligo(dG)10为引物,通过LD-PCR (long- distance-PCR)方法合成双链cDNA,将双链cDNA经BamHI和HindIII双酶切,通过T4DNA连接酶连接到经相同酶切的pUC19载体后构建成cDNA文库.对文库质量的分析结果表明,通过本方法构建的鲨鱼再生肝组织cDNA文库容量至少为4.92×105个/μg dscDNA,重组率达96.7%.对随机提取30个克隆的质粒进行分析,获得了其中25个插入片段的序列,未见重复序列,经与GenBank和dbEST数据库比对分析发现新基因在其中占较大的比例(76%).鲨鱼再生肝组织cDNA文库的成功构建为进一步通过差异显示技术筛选、克隆肝再生过程中差异表达的相关功能基因奠定了一个良好的基础. 展开更多

关键词 肝组织 鲨鱼 构建 质粒文库 cdna第一链 t4dna连接酶 cdna文库 GENBANK 鉴定 斑竹 条纹 ESt数据库 差异显示技术 酶切位点 末端转移酶 总RNA mRNA 分析结果 重复序列 比对分析 功能基因 差异表达 再生过程 双酶切 库容量

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细纤维介导的植物转化

16

作者 朱遐 《生物技术通报》 CAS CSCD 1993年第5期21-21,共1页

寻找转化植物细胞新途径的工作一直在进行着。发表在 Theoretical and Applied Genetits84,560～566上的一篇论文提供了一种有效的新方法,可简单廉价地进行操作。明尼苏达大学的 D.A.So-mers 和 H.F.Kaeppler 博士及其协作者在含碳化硅... 寻找转化植物细胞新途径的工作一直在进行着。发表在 Theoretical and Applied Genetits84,560～566上的一篇论文提供了一种有效的新方法,可简单廉价地进行操作。明尼苏达大学的 D.A.So-mers 和 H.F.Kaeppler 博士及其协作者在含碳化硅纤维和质粒 DNA 展开更多

关键词 碳化硅纤维 协作者 植物细胞 明尼苏达大学 dna 基因导入 表达载体 菌悬液 转化法 弹法

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夏威夷椰子超氧化物歧化酶基因片段的克隆与序列分析 被引量：5

17

作者 韩闯 谢潮添 +3 位作者 游学明 云叶 钟然 杨盛昌 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第B06期167-170,共4页

以热带植物夏威夷椰子(Chamaedoreacostricana)基因组DNA为模板,根据SOD基因保守序列设计特异引物进行PCR扩增,得到特异基因片段.回收该基因片段,与pMD182T载体连接,并转化到感受态大肠杆菌ER2566细胞,获得Cu·ZnSOD基因片段的克隆... 以热带植物夏威夷椰子(Chamaedoreacostricana)基因组DNA为模板,根据SOD基因保守序列设计特异引物进行PCR扩增,得到特异基因片段.回收该基因片段,与pMD182T载体连接,并转化到感受态大肠杆菌ER2566细胞,获得Cu·ZnSOD基因片段的克隆.序列分析表明夏威夷椰子Cu·ZnSOD基因片段含3个外显子和3个内含子,编码64个氨基酸,与玉米、红薯和白杨相应氨基酸序列的同源性分别为82.81%,81.25%,81.25%和79.69%. 展开更多

关键词 夏威夷椰子 基因片段 超氧化物歧化酶 序列分析 克隆 基因组dna PCR扩增 SOD基因 氨基酸序列 热带植物 大肠杆菌 特异引物 序列设计 感受态 t载体 内含子 外显子 分析表 同源性 Cu 细胞

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农杆菌介导的猕猴桃ACO反义基因遗传转化 被引量：1

18

作者 刘艺 朱杰 +1 位作者 苑平 田宏现 《江苏农业科学》 北大核心 2013年第5期26-27,共2页

以猕猴桃米良1号的当年生嫩枝及叶片为外植体,构建了双右边界双元载体pCAMBIA1300-actin-term-2,通过根癌农杆菌EHA105菌株介导,将ACO反义基因导入猕猴桃植株基因组。结果表明,愈伤组织预培养20 d,农杆菌侵染30 min,EHA105菌液浓度D=0.6... 以猕猴桃米良1号的当年生嫩枝及叶片为外植体,构建了双右边界双元载体pCAMBIA1300-actin-term-2,通过根癌农杆菌EHA105菌株介导,将ACO反义基因导入猕猴桃植株基因组。结果表明,愈伤组织预培养20 d,农杆菌侵染30 min,EHA105菌液浓度D=0.6,共培养5 d,经PCR法检测证明ACO反义基因已转入转化植株基因组中。 展开更多

关键词 猕猴桃 ACO反义基因 遗传转化 双t—dna载体

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