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传染性造血器官坏死病毒和传染性胰脏坏死病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 张文 徐立蒲 +7 位作者 吕晓楠 潘勇 王小亮 曹欢 王静波 王姝 阴鸿达 王澎 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期494-500,共7页
为建立一种快速、高效、敏感的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的双重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参照世界动物卫生组织(WOAH)最新推荐的IHNV RT-qPCR方法,根据IHNV N基因合成1对特异性引物和1条经... 为建立一种快速、高效、敏感的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的双重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参照世界动物卫生组织(WOAH)最新推荐的IHNV RT-qPCR方法,根据IHNV N基因合成1对特异性引物和1条经FAM标记的Taq Man探针;根据本研究室建立的6种基因型IPNV(VP2基因)RT-qPCR方法合成1对特异性引物和1条经VIC标记的Taq Man探针。经优化各反应条件,初步建立了IHNV的和IPNV双重RT-qPCR检测方法。分别以IHNV、IPNV、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的cDNA以及病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)的重组质粒作为模板,采用本研究建立的双重RT-qPCR检测,评估该方法的特异性;以终浓度分别为1.0×10^(1)拷贝/μL~1.0×10^(9)拷贝/μL pIHNV和p IPNV质粒标准品的混合物作为模板,采用建立的双重RT-qPCR方法扩增,评估该方法的敏感性;以3个不同终浓度的质粒标准品混合物作为模板,采用本研究建立的双重RT-qPCR分别于同一时间和不同时间检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增IHNV和IPNV及二者的质粒标准品混合物,其他相关水生动物病毒均无扩增曲线,特异性较强;对pIHNV和pIPNV质粒标准品的检测限均为1.25拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。将本实验室保存的45份虹鳟组织上清液传1~2代后,取出现典型CPE的细胞培养物,采用本实验建立的双重RT-qPCR方法和国标中的IHNV RT-PCR及已报道的IPNV RT-PCR方法同时检测。结果显示,3种方法均检出35份阳性样品,其中,IHNV的阳性检出率均为33.3%(15/45),IPNV的阳性检出率均为44.4%(20/45),3种方法的符合率均达100%。本研究首次建立了同时鉴别检测IHNV和IPNV的双重RT-qPCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好,可为IHNV和IPNV的鉴别检测及流行病学调查提供新的技术手段。 展开更多
关键词 传染性造血器官坏死病毒 传染性胰脏坏死病毒 双重荧光定量rt-pcr
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非洲马瘟病毒和西尼罗病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
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作者 钱佳豪 刘丹 +8 位作者 周师众 张博源 高建帅 蒋卉 范学政 张广智 丁家波 王春凤 沈青春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5873-5879,共7页
本研究旨在建立一种可同时检测非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)和西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的双重荧光定量RT-PCR检测方法。根据AHSV VP 7基因序列和WNV Poly Protein基因的高度保守区域设计特异性引物和探针,... 本研究旨在建立一种可同时检测非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)和西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的双重荧光定量RT-PCR检测方法。根据AHSV VP 7基因序列和WNV Poly Protein基因的高度保守区域设计特异性引物和探针,优化反应条件及体系,绘制标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行测定,并采用该方法对临床样品进行检测验证。结果显示:该方法能够同时检测AHSV和WNV,且特异性良好,与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马传染性贫血病毒、马腺疫链球菌、马流感病毒等马病核酸均无交叉反应;敏感性高,AHSV和WNV最低检测限均为10 copies·μL^(-1);组内变异系数为0.04%~0.93%,组间变异系数为0.17%~4.83%,重复性良好;使用该方法对30份马全血样品进行检测,结果均为阴性。本试验建立的检测方法对马属动物检疫、非洲马瘟和西尼罗热的监测与防控具有重要意义。 展开更多
关键词 双重荧光定量rt-pcr 非洲马瘟病毒 西尼罗病毒
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猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30毒株鉴别诊断荧光RT-PCR检测方法的建立
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作者 覃国喜 米树运 +3 位作者 孙竹筠 刘德清 罗婷婷 熊炜 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期84-90,共7页
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的危害生猪养殖业的重要传染病之一。NADC30毒株是PRRSV的一种新毒株,其Nsp2存在131个不连续氨基酸缺失。该毒株在临床流行中致病力不同,且常规PRRSV疫苗免疫无法有效预... 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的危害生猪养殖业的重要传染病之一。NADC30毒株是PRRSV的一种新毒株,其Nsp2存在131个不连续氨基酸缺失。该毒株在临床流行中致病力不同,且常规PRRSV疫苗免疫无法有效预防其感染,给养殖企业防控PRRSV带来困难。本研究基于TaqMan探针技术,针对经典型PRRSV保守基因序列及PRRSV NADC30缺失区域保守序列,设计不同荧光标记探针,建立双重实时荧光RT-PCR鉴别方法,可区分经典型PRRSV与PRRSV NADC30毒株。结果表明,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可快速区分经典型PRRSV毒株与PRRSV NADC30毒株,对PRRSV经典型疫苗毒株及临床NADC30毒株样本检测效果良好,适用于猪场临床样品中PRRSV NADC30毒株的快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 NDAC30毒株 双重实时荧光rt-pcr
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非洲马瘟病毒VP7和NS2双重荧光RT-PCR检测技术的建立与应用 被引量:3
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作者 高志强 张鹤晓 +6 位作者 乔彩霞 蒲静 张伟 谷强 刘环 张利峰 马贵平 《中国动物检疫》 CAS 2013年第4期34-38,共5页
利用DNAMAN软件对非洲马瘟病毒不同基因型代表株的序列进行分析,选择其高度保守的VP7和NS2基因设计合成引物和探针。人工分别合成包含有扩增区域的VP7和NS2核苷酸片段进行双向(T7和SP6)体外转录制备双链RNA(dsRNA)。使用制备的dsRNA在... 利用DNAMAN软件对非洲马瘟病毒不同基因型代表株的序列进行分析,选择其高度保守的VP7和NS2基因设计合成引物和探针。人工分别合成包含有扩增区域的VP7和NS2核苷酸片段进行双向(T7和SP6)体外转录制备双链RNA(dsRNA)。使用制备的dsRNA在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上,建立了适用于非洲马瘟病毒检测的双重通用荧光定量RT-PCR检测技术。应用建立的方法对非洲马瘟病毒核酸,马流感病毒核酸,马流产沙门氏菌核酸,马链球菌兽疫亚种核酸,东、西部马脑脊髓炎病毒核酸进行检测,结果显示该检测技术可以有效检测非洲马瘟病毒核酸,而对其它病原核酸检测结果为阴性,证实本技术的特异性强、可靠性好。对已知拷贝数的dsRNA检测结果表明,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达1.0×102拷贝/反应,相比于基于凝胶电泳常规RT-PCR方法,其灵敏度高10倍;而且双基因的检测设计思路更能保证病毒核酸的有效检测,防止漏检。在对248份临床样品的检测中,进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好,可满足非洲马瘟病毒快速诊断的需要。 展开更多
关键词 非洲马瘟病毒 VP7和NS2 双重通用荧光rt-pcr
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H10N8亚型禽流感病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量:4
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作者 包红梅 田国彬 +2 位作者 曾显营 王秀荣 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期1233-1238,共6页
为建立检测H10N8亚型禽流感病毒(AIV)的双重荧光定量RT-PCR方法,本研究选取H10N8亚型AIV血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因中高度保守区域的核苷酸序列,设计引物和探针。通过反应条件优化,建立了针对H10N8亚型AIV的双重荧光定量RT-PCR方... 为建立检测H10N8亚型禽流感病毒(AIV)的双重荧光定量RT-PCR方法,本研究选取H10N8亚型AIV血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因中高度保守区域的核苷酸序列,设计引物和探针。通过反应条件优化,建立了针对H10N8亚型AIV的双重荧光定量RT-PCR方法。该方法可特异性地检测出H10N8亚型AIV的HA和NA基因,与其它亚型AIV及其他常见禽呼吸道病原均无交叉反应;能够检测到AIV的最低检出量为10-1 EID50/0.1 mL,比常规RT-PCR方法敏感100倍;批内和批间重复性试验的变异系数(CV)均小于2%。SPF鸡感染试验样品检测结果显示,该双重荧光定量RT-PCR方法和病毒分离鉴定方法的符合率为94.44%,与常规RT-PCR方法的符合率为88.23%,而常规RT-PCR方法与病毒分离方法的符合率为83.33%,表明该方法与病毒分离方法的准确率更接近,可以用于临床检测。本实验结果表明H10N8亚型AIV的双重荧光定量RT-PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便,为H10N8亚型AIV的检测及监测提供了有力的技术手段。 展开更多
关键词 禽流感 H10N8 双重荧光定量rt-pcr 检测方法
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一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量:3
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作者 刘师文 熊英 +3 位作者 施勇 李健雄 王倩 龚甜 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期478-483,共6页
目的建立一种汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)和汉城病毒(Seoul virus,SEOV)双重实时定量荧光RT-PCR检测方法。方法根据HTNV和SEOV S基因设计引物和探针、优化反应条件,建立2种汉坦病毒的双重实时荧光定量RT-PCR方法。以甲型流感病毒、登... 目的建立一种汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)和汉城病毒(Seoul virus,SEOV)双重实时定量荧光RT-PCR检测方法。方法根据HTNV和SEOV S基因设计引物和探针、优化反应条件,建立2种汉坦病毒的双重实时荧光定量RT-PCR方法。以甲型流感病毒、登革热病毒、新布尼亚病毒、寨卡病毒、新冠病毒阳性核酸为模板验证方法的特异性,将建立的方法与巢氏RT-PCR比较,确定方法对临床样本的适用性。结果建立了一种HTNV和SEOV双重实时定量荧光RT-PCR检测方法,该方法对2种型别病毒的最低检测限均为10 copies/μL,不同浓度标准品Ct值批内和批间差异均小于2%。与登革热病毒、新布尼亚病毒、寨卡病毒、新型冠状病毒、甲型流感病毒均无交叉反应。对10份肾综合征出血热急性期血清样本进行检测,结果9份为HTNV、1份为SEOV,与巢式RT-PCR方法结果一致。结论建立的双重实时荧光定量RT-PCR方法可以快速对HTNV和SEOV进行分型和定量检测,适用于肾综合征出血热临床早期诊断。 展开更多
关键词 汉滩病毒 汉城病毒 双重实时荧光定量rt-pcr
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鹅星状病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量:6
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作者 王宏宇 朱寅初 +2 位作者 云涛 张存 鲍恩东 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1616-1623,共8页
鹅星状病毒(goose astroviruses,GAstV)作为一种雏鹅新发病原,对养鹅业造成巨大经济损失,在尚无有效治疗手段情况下,加强疫病及时检测和防控十分重要。为建立快速、特异且灵敏的鉴别GAstVⅠ型和GAstVⅡ型的病毒检测方法,本研究根据GAst... 鹅星状病毒(goose astroviruses,GAstV)作为一种雏鹅新发病原,对养鹅业造成巨大经济损失,在尚无有效治疗手段情况下,加强疫病及时检测和防控十分重要。为建立快速、特异且灵敏的鉴别GAstVⅠ型和GAstVⅡ型的病毒检测方法,本研究根据GAstVⅠ和GAstVⅡ的保守区域RdRp基因序列,设计合成2对特异性引物和2种不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了一种双重荧光定量PCR检测方法,以达到在同一反应体系中同时定量检测GAstVⅠ和GAstVⅡ的目的。结果显示,GAstVⅠ和GAstVⅡ的最小检出量分别为43.3、6.49 copies·μL^(-1);重复试验的变异系数不超过0.5%;该方法对DPV、GPV、GTMUV、GRV、AIV(H9N2)等病毒核酸无交叉反应。综上表明,本研究建立的可鉴别GAstVⅠ和GAstVⅡ的双重荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好。可用于临床GAstVⅠ和GAstVⅡ的快速鉴别诊断,也可用于两种基因型GAstV的定量分析。 展开更多
关键词 鹅星状病毒Ⅰ型 鹅星状病毒Ⅱ型 双重荧光定量rt-pcr TAQMAN探针
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尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量:4
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作者 王建华 赵祥平 +7 位作者 董志珍 肖妍 王玉玲 张俊哲 陈小金 王乃福 陈本龙 赵丹 《动物医学进展》 北大核心 2016年第1期11-16,共6页
根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果... 根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)和SIV M基因的RNA标准对照(SIV-M-RNA),定量线性范围分别为4.6×101copies/μL^4.6×108 copies/μL和5.8×101copies/μL^5.8×108 copies/μL,检出限分别为46个拷贝和58个拷贝。该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%,显示其良好的可重复性。该方法仅对NiV-M-RNA和SIV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用该方法对236份猪的鼻拭子样品进行NiV和SIV的同时检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,有1份样本的SIV检测结果为阳性。本研究建立的方法可为猪临床样本中NiV和SIV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 展开更多
关键词 尼帕病毒 猪流感病毒 TAQMAN-MGB探针 双重荧光定量rt-pcr
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一步法CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR诊断方法的建立与初步应用 被引量:3
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作者 袁秀芳 路斌 +2 位作者 徐丽华 李军星 王一成 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第4期537-543,共7页
根据猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,分别设计了1对特异性引物和1条Taq Man探针,建立了一步法检测CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法特异性高,与PCV2,PRV,PPV,PEDV,JEV,BVDV无交叉反应... 根据猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,分别设计了1对特异性引物和1条Taq Man探针,建立了一步法检测CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法特异性高,与PCV2,PRV,PPV,PEDV,JEV,BVDV无交叉反应;可以检出20个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)低于4%,方法重复性好。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对50份疑似病例组织进行检测,结果荧光定量RT-PCR检出30份PRRSV阳性,13份CSFV阳性,均高于常规RT-PCR方法的检出数(24份PRRSV阳性,10份CSFV阳性)。本研究建立的双重实时荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高的特点,可用于PRRSV和CSFV的实验室快速诊断和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 双重实时荧光定量rt-pcr
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高致病性PRRSV GD疫苗株与野毒株双重荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立 被引量:4
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作者 张文利 孙丰廷 +3 位作者 王海光 刘灿 英聪 宁宜宝 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期898-902,共5页
为建立一种能够快速鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GDr180疫苗株与GD野毒株的双重荧光定量RT-PCR方法,本研究在PPRSV的Nsp2基因和Orf7基因区域分别设计不同荧光标记的MGB探针及特异性引物。这两种MGB探针能够分别特异结合GD野... 为建立一种能够快速鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GDr180疫苗株与GD野毒株的双重荧光定量RT-PCR方法,本研究在PPRSV的Nsp2基因和Orf7基因区域分别设计不同荧光标记的MGB探针及特异性引物。这两种MGB探针能够分别特异结合GD野毒株和GDr180疫苗株。通过对PRRSV培养液、感染猪血清和组织样品检测证明了该方法的可行性;采用双重实时荧光定量RT-PCR方法检测PRRSV GDr180疫苗株和GD强毒株时敏感性分别达到19.4拷贝/μL和34.2拷贝/μL;该方法与PRRSV其他8个病毒株和猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪细小病毒不发生交叉反应,表明该方法具有良好的特异性;因此可以用于PRRSV GDr180疫苗株与野毒株的鉴别检测。 展开更多
关键词 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDr180 双重荧光rt-pcr MGB探针 鉴别检测
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H1、H3亚型猪流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:4
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作者 王博 王慧煜 +4 位作者 赵宝华 罗静 王承民 何宏轩 韩雪清 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第10期3035-3041,共7页
为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒(swine influence virus,SIV)的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条Taq Man探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该... 为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒(swine influence virus,SIV)的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条Taq Man探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法敏感性高,可检测到最低拷贝数为102拷贝/μL;重复性良好,重复孔Ct值的变异系数均在5%以下;特异性好,除H1和H3亚型SIV外,H4、H5、H7、H9亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒检测均为阴性;在田间样品中成功检出1株H1和1株H3亚型SIV,检出率为1.16%。该方法准确、快速、灵敏、特异,可为H1、H3亚型SIV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。 展开更多
关键词 H1和H3亚型猪流感病毒(SIV) 双重实时荧光定量rt-pcr TAQMAN探针
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鉴别H5亚型两种分支禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用 被引量:2
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作者 彭程 刘朔 +7 位作者 张琳 李金平 于晓慧 侯广宇 王静静 李阳 蒋文明 刘华雷 《中国动物检疫》 CAS 2021年第1期100-105,共6页
为准确区分H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支的毒株,通过对GenBank和GISAID数据库中发表的以及本实验室保存的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行比对,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H5亚型禽流感病毒不同分支毒株的实时... 为准确区分H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支的毒株,通过对GenBank和GISAID数据库中发表的以及本实验室保存的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行比对,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H5亚型禽流感病毒不同分支毒株的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化,同时开展了特异性和敏感性试验,以及临床应用检测。结果显示:该方法具有良好的特异性,与其他亚型禽流感病毒及常见禽病病毒无交叉反应;对H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支毒株的检测灵敏度分别为495.0 copies/μL和22.3 copies/μL;100份临床家禽拭子禽流感病毒检测结果与常规RT-PCR和病毒分离检测结果一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异、敏感、准确、耗时少,同时还可区分不同分支,可应用于H5亚型禽流感病毒的准确、快速检测。 展开更多
关键词 H5亚型禽流感病毒 分支 双重实时荧光rt-pcr 敏感性 特异性
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H5N8亚型流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价 被引量:1
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作者 孙洁 廖立珊 +9 位作者 于力 吴绍精 刘建利 陶虹 杨俊兴 曾少灵 林彦星 黄超华 林庆燕 秦智锋 《上海畜牧兽医通讯》 2018年第6期2-5,共4页
流感病毒变异迅速,为研究和建立一种针对H5 N8亚型流感病毒核酸准确灵敏的检测方法,分别选择H5 N8亚型流感毒株序列相对保守的HA基因和NA基因作为H5 N8亚型流感病毒检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,选择两种不同的荧光标记,建... 流感病毒变异迅速,为研究和建立一种针对H5 N8亚型流感病毒核酸准确灵敏的检测方法,分别选择H5 N8亚型流感毒株序列相对保守的HA基因和NA基因作为H5 N8亚型流感病毒检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,选择两种不同的荧光标记,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5 N8亚型禽流感病毒检测方法。实验结果表明,所建立的H5 N8亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10-5,NA基因检测的灵敏度为10-5,重复性好,特异性佳。结果表明:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5 N8亚型流感病毒,耗时短,可很快作出判定结果,适用于H5 N8流感病毒的分子生物学检测和监测。对于控制流感流行,减少经济损失,最大限度保护社会人群健康具有很大意义。 展开更多
关键词 HSN8亚型禽流感病毒 双重实时荧光rt-pcr 快速检测
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鉴别检测裂谷热病毒NSs缺失型疫苗株与野生株模拟物的双重荧光定量RT-PCR方法的建立
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作者 杨蕾蕾 毛立 +5 位作者 李基棕 江杰元 刘茂军 张纹纹 孙敏 李文良 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期1128-1133,共6页
为了建立一种能够鉴别检测裂谷热病毒野毒株与NSs缺失型疫苗株的荧光定量RT-PCR方法,本研究通过对裂谷热病毒基因组序列进行比较分析,选择其S节段NSs基因及L节段L基因的无二级结构且保守的区段,分别设计多对引物和探针,通过试验验证并... 为了建立一种能够鉴别检测裂谷热病毒野毒株与NSs缺失型疫苗株的荧光定量RT-PCR方法,本研究通过对裂谷热病毒基因组序列进行比较分析,选择其S节段NSs基因及L节段L基因的无二级结构且保守的区段,分别设计多对引物和探针,通过试验验证并优化反应条件,筛选出最佳引物和探针的组合,建立了可以快速检测裂谷热病毒并区分NSs基因缺失疫苗株和野毒株的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测羊临床常见病原,结果显示该方法仅对裂谷热质粒标准品样品检测为阳性,不与羊常见的其他病原出现阳性反应,特异性强;将裂谷热质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的方法进行检测,结果显示,该方法对NSs和L基因重组质粒标准品的检测下限分别为10拷贝/μL和100拷贝/μL,敏感度高;重复性实验结果显示,该方法组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。将NSs缺失型和非缺失型质粒分别转染细胞,提取核酸,利用本方法进行检测,结果显示该方法可有效区分NSs基因缺失型和非缺失型核酸样品。本研究建立的双重荧光定量RT-PCR方法为鉴别野生病毒株和NSs缺失型疫苗株奠定了技术基础。 展开更多
关键词 裂谷热病毒 双重荧光定量rt-pcr 鉴别 NSs基因 L基因 模拟物
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流感病毒H1/H3亚型通用双重短探针实时RT-PCR检测技术与标准质控品研究
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作者 高志强 张鹤晓 +4 位作者 乔彩霞 蒲静 张利峰 张伟 谷强 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2012年第9期3-6,共4页
采用TaqMan方法,在对人、禽、猪以及马流感病毒代表株HA序列多重比对基础上,设计合成动物流感病毒H1亚型和H3亚型的兼并引物和LNA和MGB修饰短探针,经反应条件优化,建立了针对流感病毒H1亚型及H3亚型的双重实时RT-PCR检测方法。应用建立... 采用TaqMan方法,在对人、禽、猪以及马流感病毒代表株HA序列多重比对基础上,设计合成动物流感病毒H1亚型和H3亚型的兼并引物和LNA和MGB修饰短探针,经反应条件优化,建立了针对流感病毒H1亚型及H3亚型的双重实时RT-PCR检测方法。应用建立的方法分别对人、禽、猪以及马流感病毒核酸进行检测,结果显示,建立的方法通用性良好,可有效检测和鉴别H1和H3亚型流感病毒,但对其他亚型的流感病毒以及新城疫病毒核酸检测结果为阴性,表明建立的方法特异性强。进一步经体外转录制备了猪流感病毒H1和H3亚型HA完成编码区的核酸标准品cRNA,经稀释、分装、定量、均匀性和稳定性检验后,作为方法的质控品对建立的方法进行评价,结果表明,所建立的双重短探针实时RT-PCR方法灵敏度可达2.0×102拷贝/反应。在对586份临床样品的检测中,进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好,可满足动物流感病毒H1/H3亚型的早期快速检测的需求。 展开更多
关键词 动物流感病毒 H1/H3亚型 通用双重 短探针 实时rt-pcr
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双重荧光实时RT-PCR技术鉴定H9N2亚型禽流感病毒
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作者 李燕 单军 韩晓冬 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期486-490,共5页
采用双重荧光实时RT-PCR技术,建立一种简便易行的H9N2亚型禽流感病毒的快速鉴定方法。通过比对GenBank甲型禽流感病毒H9N2亚型的HA和NA基因序列,设计特异性针对HA和NA的引物,分别选用FAM和JOE两种不同荧光标记探针,构建双重实时荧光PCR... 采用双重荧光实时RT-PCR技术,建立一种简便易行的H9N2亚型禽流感病毒的快速鉴定方法。通过比对GenBank甲型禽流感病毒H9N2亚型的HA和NA基因序列,设计特异性针对HA和NA的引物,分别选用FAM和JOE两种不同荧光标记探针,构建双重实时荧光PCR一步法反应体系,同时检测样本中的HA和NA基因。结果显示:扩增曲线和特异性实验结果显示,该体系具有很好的扩增效率,且仅特异性识别H9N2亚型AIV的HA、NA基因,与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用重组质粒pMD19-T构建HA、NA阳性质粒,10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。结果证实,本研究所建立的双重荧光定量RT-PCR体系敏感性能达到10个RNA拷贝数。采用本方法检测60份感染动物样品及60份环境样品,与传统PCR方法相比,检测敏感性提高了100倍;与病毒分离鉴定方法比较,二者的鉴定结果完全吻合。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速易操作等优点,是H9N2亚型禽流感病毒鉴定的有效方法。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H9N2 双重荧光实时rt-pcr技术
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H5N6亚型流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法的建立
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作者 廖立珊 孙洁 +13 位作者 刘建利 吕建强 杨俊兴 曹琛福 曾少灵 陶虹 张彩虹 林彦星 唐金明 黄超华 阮周曦 林庆燕 花群义 秦智锋 《上海畜牧兽医通讯》 2017年第3期2-5,共4页
为研制H5N6亚型流感病毒核酸快速检测试剂盒,选择H5N6亚型流感毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5N6亚型禽流感病毒的方法。实验结果表... 为研制H5N6亚型流感病毒核酸快速检测试剂盒,选择H5N6亚型流感毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5N6亚型禽流感病毒的方法。实验结果表明,所建立的H5N6亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10^(-5),NA基因检测的灵敏度为10^(-4),重复性良好,特异性佳。结论:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5N6亚型流感病毒。 展开更多
关键词 H5N6亚型禽流感病毒 双重实时荧光rt-pcr
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H5和H7亚型高致病性禽流感病毒新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用 被引量:5
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作者 高晓艺 韩焘 +8 位作者 王乃迪 王传彬 杨林 王新杰 高姗姗 孙晓明 胡祥钰 石玉祥 刘玉良 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期911-917,共7页
为建立鉴别检测H5和H7亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)双重荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据已登录的H5和H7亚型HPAIV HA基因裂解位点序列差异分别设计引物和探针,对反应体系各条件优化后首次建立了同时鉴别检测H5与H7亚型HPAIV的新型... 为建立鉴别检测H5和H7亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)双重荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据已登录的H5和H7亚型HPAIV HA基因裂解位点序列差异分别设计引物和探针,对反应体系各条件优化后首次建立了同时鉴别检测H5与H7亚型HPAIV的新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR方法。特异性试验结果显示,该方法除对H5和H7亚型HPAIV检测结果为阳性外,对其它几种常见的禽病病原检测结果均为阴性,该方法特异性强;敏感性试验结果显示,该方法检测下限为病毒浓度1×101TCID50/mL,而常规荧光定量RT-PCR检测下限为1×102TCID50/mL,敏感性高;标准曲线分析后结果显示,本研究所建立方法的扩增效率比常规荧光定量RT-PCR高,二者相关系数均为0.997;批内和批间重复性试验结果显示,Ct值的变异系数均小于2%以下,重复性高。临床样品检测结果显示,该方法所需样本微量仅为1μL^2μL;操作简便、快速,检测过程<40 min,可用于现场检测;而且利用该方法与常规荧光定量PCR方法以及测序对临床样品进行检测,三者结果完全吻合。本研究所建立的新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR检测方法为H5和H7亚型HPAIV监测和临床检测提供了可行的技术手段。 展开更多
关键词 H5亚型禽流感 H7亚型禽流感 HA裂解位点 双重荧光定量rt-pcr 微芯片
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基因A型和B型牛鼻病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:4
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作者 周昱行 汤承 岳华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期1059-1065,共7页
牛鼻病毒(BRV)是引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)的重要病原,分为基因A型(BRAV)和基因B型(BRBV)。为建立同时检测BRAV和BRBV的双重荧光定量RT-PCR方法,本研究根据BRAV 5’非翻译区(5’NTR)和BRBV 3’非翻译区(3’NTR)分别设计特异性引物和... 牛鼻病毒(BRV)是引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)的重要病原,分为基因A型(BRAV)和基因B型(BRBV)。为建立同时检测BRAV和BRBV的双重荧光定量RT-PCR方法,本研究根据BRAV 5’非翻译区(5’NTR)和BRBV 3’非翻译区(3’NTR)分别设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化各反应条件,初步建立了同时检测BRAV与BRBV的双重荧光定量RT-PCR方法。特异性试验结果显示,该方法仅对BRAV和BRBV检测为阳性,对其他常见牛呼吸道病原,包括D型流感病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型、牛腺病毒3型、牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、大肠杆菌和沙门菌检测结果均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法对BRAV和BRBV重组质粒标准品的检测下限均为3.2×10^(1)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,批内与批间重复性试验变异系数均小于5%,重复性较好。利用该方法与国外文献报道的3种BRAV荧光定量RT-PCR方法以及4种BRBV荧光定量RT-PCR方法同时检测43份BRDC患牛鼻拭子样品,结果显示该方法对BRAV和BRBV的检出率分别为32.56%(14/43)和30.23%(13/43),其他方法对BRAV的检出率分别为0(0/43)、2.33%(1/43)、23.26%(10/43),对BRBV的检出率分别为27.91%(12/43)、27.91%(12/43)、27.91%(12/43)、27.91%(12/43),表明本研究所建方法的检测性能较强。本研究首次建立了同时检测BRAV和BRBV的双重荧光定量RT-PCR方法,其特异性强、敏感性高、稳定性好,并且首次证实BRAV在中国的存在,为BRDC的防控提供了重要参考。 展开更多
关键词 牛鼻病毒 基因A型 基因B型 双重荧光定量rt-pcr 混合感染
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犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量:10
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作者 徐航 任建炜 +2 位作者 于德涛 曹志 温建新 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期379-384,共6页
为建立鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCoV)的方法,本研究采用PCR方法分别扩增CDV N基因和CCoV S基因,并克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pCDV-N、pCCoV-S,均经PCR和测序鉴定后测定浓度作为质粒标准品。同时针对CDV N基因和CCoV ... 为建立鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCoV)的方法,本研究采用PCR方法分别扩增CDV N基因和CCoV S基因,并克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pCDV-N、pCCoV-S,均经PCR和测序鉴定后测定浓度作为质粒标准品。同时针对CDV N基因和CCoV S基因设计特异性引物和TaqMan探针,采用方阵试验对各反应条件的优化,建立了同时检测这两种病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品按照该方法检测,建立标准曲线,结果显示,两个重组质粒标准品均与各自的Ct值具有良好的线性关系。采用该方法分别检测CDV、CCoV、犬细小病毒、犬传染性喉气管炎病毒2型、犬副流感病毒,评估该方法的特异性;将两种质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后,取108~101稀释度的质粒混合物作为模板,采用该方法检测,评估该方法的敏感性;将两种质粒标准品10倍倍比稀释并等体积混合后,分别取107、105、103稀释度的质粒标准品混合物采用该方法检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增CDV和CCoV,与犬的其他病毒均无交叉反应,特异性较强;对CDV质粒标准品的检测限为5.0×103拷贝/μL,对CCoV质粒标准品的检测限为4.93×103拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。利用本实验建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法和已报道的CCoV RT-PCR及国标规定的CDV RT-PCR方法同时检测采集的100份临床腹泻犬样品,结果显示,共检出35份阳性样品,其中,CDV的阳性检出率为16%(16/100),CCoV的阳性检出率为19%(19/100),阴性样品65份,与CCoV和CDV参考方法的检测结果均一致。本研究建立的CDV和CCoV双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可在40 min内完成检测,且准确、快速、敏感,为CDV和CCoV临床大量样品的快速和特异性鉴别检测提供了有效技术手段。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 犬冠状病毒 双重荧光定量rt-pcr
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