为建立并比较牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的检测方法,本研究基于IBRV gB基因和gE基因的保守序列,分别设计用于检测IBRV的TB Green I荧光定量PCR(qPCR)方法和纳米(Nano)PCR方法的特异性引物,利用本实验构建的重组质粒标准品pMD19-T-gB和p...为建立并比较牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的检测方法,本研究基于IBRV gB基因和gE基因的保守序列,分别设计用于检测IBRV的TB Green I荧光定量PCR(qPCR)方法和纳米(Nano)PCR方法的特异性引物,利用本实验构建的重组质粒标准品pMD19-T-gB和pMD19-T-gE为模板,采用方阵法优化各反应条件,初步建立了检测IBRV的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法,并建立荧光定量PCR标准曲线。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛肠道病毒(BEV)和牛流行热病毒(BEFV)等RNA反转录所得cDNA及IBRV基因组DNA为模板,采用本研究建立的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法检测,评估所建方法的特异性;分别以10倍倍比稀释(108~101)的pMD19-T-gB和pMD19-T-gE质粒标准品作为模板,利用本研究建立的两种方法与普通PCR方法检测,比较所建方法的敏感性;以3个不同浓度的重组质粒标准品pMD19-T-gB作为模板,利用TB Green I qPCR方法分别于同一时间和不同时间进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。标准曲线结果显示,质粒标准品pMD19-T-gB在5.54×10^(8)拷贝/μL~5.54×10^(1)拷贝/μL范围内与其Ct值之间的线性关系良好,相关系数R2=0.999,溶解曲线为单一峰。特异性试验结果显示,所建立的两种方法仅能检出IBRV,其他病毒均为阴性结果,特异性强。敏感性试验结果显示,所建立的TB Green I qPCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gB的检测限为55.4拷贝/μL;Nano PCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gE的检测限为4.28×10^(3)拷贝/μL,所建立两种方法的敏感性均较高。重复性试验结果显示,该qPCR方法批内、批间重复性试验的变异系数在0.16%~0.67%,重复性较好。采用本实验建立的两种方法和普通PCR方法对延边地区采集的50份疑似IBRV感染的样品进行检测,结果显示,普通PCR对样品的阳性检测率为84%(42/50),Nano PCR对样品的阳性检测率为90%(45/50),qPCR对样品的阳性检测率为92%(46/50),3种检测方法的总符合率均高于85%。本研究建立的qPCR方法对样品的阳性检出率最高、特异性更强,为临床样品的快速检测及相应疾病早期诊断的首选;Nano PCR次之。本实验首次同时建立并比较了用于IBRV检测的TB Green I qPCR方法与Nano PCR方法,且首次对延边地区的IBRV流行病学作了初步调查,为牛养殖业和疫病防控工作提供技术支撑和参考依据。展开更多
为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38....为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。展开更多
文摘为建立并比较牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的检测方法,本研究基于IBRV gB基因和gE基因的保守序列,分别设计用于检测IBRV的TB Green I荧光定量PCR(qPCR)方法和纳米(Nano)PCR方法的特异性引物,利用本实验构建的重组质粒标准品pMD19-T-gB和pMD19-T-gE为模板,采用方阵法优化各反应条件,初步建立了检测IBRV的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法,并建立荧光定量PCR标准曲线。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛肠道病毒(BEV)和牛流行热病毒(BEFV)等RNA反转录所得cDNA及IBRV基因组DNA为模板,采用本研究建立的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法检测,评估所建方法的特异性;分别以10倍倍比稀释(108~101)的pMD19-T-gB和pMD19-T-gE质粒标准品作为模板,利用本研究建立的两种方法与普通PCR方法检测,比较所建方法的敏感性;以3个不同浓度的重组质粒标准品pMD19-T-gB作为模板,利用TB Green I qPCR方法分别于同一时间和不同时间进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。标准曲线结果显示,质粒标准品pMD19-T-gB在5.54×10^(8)拷贝/μL~5.54×10^(1)拷贝/μL范围内与其Ct值之间的线性关系良好,相关系数R2=0.999,溶解曲线为单一峰。特异性试验结果显示,所建立的两种方法仅能检出IBRV,其他病毒均为阴性结果,特异性强。敏感性试验结果显示,所建立的TB Green I qPCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gB的检测限为55.4拷贝/μL;Nano PCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gE的检测限为4.28×10^(3)拷贝/μL,所建立两种方法的敏感性均较高。重复性试验结果显示,该qPCR方法批内、批间重复性试验的变异系数在0.16%~0.67%,重复性较好。采用本实验建立的两种方法和普通PCR方法对延边地区采集的50份疑似IBRV感染的样品进行检测,结果显示,普通PCR对样品的阳性检测率为84%(42/50),Nano PCR对样品的阳性检测率为90%(45/50),qPCR对样品的阳性检测率为92%(46/50),3种检测方法的总符合率均高于85%。本研究建立的qPCR方法对样品的阳性检出率最高、特异性更强,为临床样品的快速检测及相应疾病早期诊断的首选;Nano PCR次之。本实验首次同时建立并比较了用于IBRV检测的TB Green I qPCR方法与Nano PCR方法,且首次对延边地区的IBRV流行病学作了初步调查,为牛养殖业和疫病防控工作提供技术支撑和参考依据。
文摘为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。
