猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒的研制 被引量：4

1

作者 余波 谭诗文 +3 位作者 冉懋韬 徐景峨 史开志 杨丽娟 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期152-154,180,共4页

根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7 N基因、猪乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、特异性结... 根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7 N基因、猪乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、特异性结果显示,该RT-PCR诊断试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV 0.2 ng/L、JEV 0.4 ng/L,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性。对52份疑似病猪样品的检测结果表明,该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪乙型脑炎病毒 双重一步法rt—pcr

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双重一步法RT-PCR检测2种主要兰花病毒 被引量：6

2

作者 柳爱春 赵芸 +1 位作者 刘超 张乐 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第27期12960-12961,13009,共3页

[目的]研究建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)双重一步法RT-PCR检测方法,为病毒的早期快速诊断提供技术支持。[方法]根据2种病毒的外壳蛋白基因的保守序列分别设计两对特异性引物,并进行双重与单一RT-PCR对比试验。[结果]结果在... [目的]研究建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)双重一步法RT-PCR检测方法,为病毒的早期快速诊断提供技术支持。[方法]根据2种病毒的外壳蛋白基因的保守序列分别设计两对特异性引物,并进行双重与单一RT-PCR对比试验。[结果]结果在健康蜘蛛兰被人工接种病毒后第10天和第21天用一步法RT-PCR方法分别获得CymMV和ORSV与预期相符的约764和946 bp扩增产物条带;且双重一步法RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,出现两条与单一RT-PCR产物相对应的清晰条带,获得较理想的检出效果;扩增产物的核酸序列经BLAST分析,同源性均在85%以上,证实了检测结果的准确性。[结论]该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点,适合于两种主要兰花病毒的同时快速检测。 展开更多

关键词 建兰花叶病毒 齿兰环斑病毒 双重一步法rt—pcr

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一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立 被引量：38

3

作者 包静月 李林 +3 位作者 王志亮 李金明 刘春菊 肖肖 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2007年第8期21-23,共3页

建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反... 建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 一步法实时定量rt—pcr 检测

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Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒一步法的建立 被引量：5

4

作者 陈晓 曾志磊 +3 位作者 朱丹 彭丹 余建萍 谢鹏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1107-1110,共4页

目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建... 目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出西尼罗病毒,不与日本脑炎病毒及其他病毒产生交叉反应。该方法的最低检出浓度为3.6×102copies/μl,标准曲线的线性范围为3.6×102～3.6×107copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于西尼罗病毒感染样本的检测。 展开更多

关键词 西尼罗病毒 real—time rt—pcr 一步法 TAQMAN探针 快速检测

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一步法RT-PCR检测烟草环斑病毒试剂盒的研制与应用 被引量：5

5

作者 张永江 李明福 +1 位作者 黄冲 相宁 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2006年第10期2072-2073,共2页

根据烟草环斑病毒基因组序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术研制成一步法检测该病毒的试剂盒,并建立了操作程序。对试剂盒扩增到的预期产物进行测序验证,产物序列与目的序列间的同源性为97.8%,表明该试剂盒的准确性较高。试验结果还表明... 根据烟草环斑病毒基因组序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术研制成一步法检测该病毒的试剂盒,并建立了操作程序。对试剂盒扩增到的预期产物进行测序验证,产物序列与目的序列间的同源性为97.8%,表明该试剂盒的准确性较高。试验结果还表明,该试剂盒在常温、4℃和-20℃下可分别保存2d、7d和60d;灵敏度是DAS-ELISA的100倍;质量控制试验结果一致,具有较高的重复性。 展开更多

关键词 一步法rt—pcr 烟草环斑病毒 检测 试剂盒

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一步法RT-PCR检测柑橘鳞皮病毒 被引量：3

6

作者 吕婵娟 周常勇 +2 位作者 周彦 唐科志 李小松 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期113-114,共2页

柑橘鳞皮病是一种极具破坏性的柑橘病害,广泛分布于南美及地中海地区。我国目前缺乏对该病害的快速检测技术。以柑橘鳞皮病毒(CPV)的外壳蛋白基因(CPG)为靶标,初步建立了一步法RT-PCR快速检测体系,扩增产物与NCBI数据库中已知CPVCPG的... 柑橘鳞皮病是一种极具破坏性的柑橘病害,广泛分布于南美及地中海地区。我国目前缺乏对该病害的快速检测技术。以柑橘鳞皮病毒(CPV)的外壳蛋白基因(CPG)为靶标,初步建立了一步法RT-PCR快速检测体系,扩增产物与NCBI数据库中已知CPVCPG的核苷酸序列进行比对,2者序列间同源性超过99%。 展开更多

关键词 柑橘鳞皮病毒 一步法rt—pcr 检测

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加工番茄马铃薯Y病毒一步法RT-PCR检测及CP基因的克隆与序列分析 被引量：1

7

作者 梁学超 向本春 +2 位作者 程朝玲 苏海娣 郑银英 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第6期2340-2344,共5页

本文通过一步法RT-PCR技术,检测新疆加工番茄马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)感染率。结果表明,新疆加工番茄马铃薯Y病毒感染率为25%。选取10个样品利用RT-PCR技术,克隆CP基因,获得807 bp全长CP基因,编码268个氨基酸。CP基因序列比对... 本文通过一步法RT-PCR技术,检测新疆加工番茄马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)感染率。结果表明,新疆加工番茄马铃薯Y病毒感染率为25%。选取10个样品利用RT-PCR技术,克隆CP基因,获得807 bp全长CP基因,编码268个氨基酸。CP基因序列比对分析与系统进化树分析表明,侵染新疆加工番茄的马铃薯Y病毒属于PVYN:O株系。 展开更多

关键词 马铃薯Y病毒 加工番茄 一步法rt—pcr CP基因

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一步法和两步法RT-PCR对裸大麦β-actin基因的检测 被引量：1

8

作者 吴昆仑 邓晓青 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2012年第6期35-37,共3页

通过一步法RT-PCR和两步法RT-PCR扩增裸大麦内参基因β-actin,都得到500bp的目的片段。结果表明,一步法RT-PCR和两步法RT-PCR都能快速检测出目的基因,一步法比较简便、快速、污染少,但是有明显的引物二聚体形成,对后续的荧光定量试验不... 通过一步法RT-PCR和两步法RT-PCR扩增裸大麦内参基因β-actin,都得到500bp的目的片段。结果表明,一步法RT-PCR和两步法RT-PCR都能快速检测出目的基因,一步法比较简便、快速、污染少,但是有明显的引物二聚体形成,对后续的荧光定量试验不利;两步法灵敏度更高而且比较经济,目的条带单一,无引物二聚体,更适合裸大麦后续的分子克隆试验。 展开更多

关键词 裸大麦 内参基因 一步法rt—pcr 两步法rt—pcr

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一步法RT-PCR快速检测口蹄疫O型病毒

9

作者 周向梅 赵德明 +2 位作者 孙艳明 杨建民 马李颖 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2007年第1期47-49,共3页

关键词 pcr快速检测 一步法扩增 病毒分离 口蹄疫 rt 血清学试验 pcr技术 O型

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猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重RT-PCR鉴别方法的建立 被引量：11

10

作者 刘邓 袁秀芳 +3 位作者 徐丽华 牛登元 王朝文 王一成 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第10期1-5,共5页

根据GenBank发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Purdue P115株的基因序列,针对其基因保守区,设计1条共用的下游引物和2条各自病毒的上游引物,可特异扩增出大小分别为213 bp和546 bp目的条带。经过对TaqDNA... 根据GenBank发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Purdue P115株的基因序列,针对其基因保守区,设计1条共用的下游引物和2条各自病毒的上游引物,可特异扩增出大小分别为213 bp和546 bp目的条带。经过对TaqDNA聚合酶和Mg2+浓度、退火温度(Tm)等PCR反应条件的优化,最终确定该双重RT-PCR的最佳条件为TaqDNA聚合酶浓度为0.03 U/μL,Mg2+浓度为0.05 mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Tm为51℃。特异性和敏感性检测结果显示,所建立的检测方法具有很好的特异性以及较高的敏感性。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 双重rt—pcr

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同时检测口蹄疫病毒和牛肠道病毒双重RT-PCR方法的建立 被引量：5

11

作者 吴丹 吴涛 +6 位作者 张鹤晓 高志强 蒲静 汪琳 乔彩霞 谷强 夏春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期976-979,共4页

为建立同时检测口蹄疫病毒(FMDV)和牛肠道病毒(BEV)的双重RT-PCR方法,本研究根据已发表的FMDV和BEV基因的5'UTR保守区域,分别设计、筛选出一对特异性引物建立了双重RT-PCR方法,并优化了反应体系和条件。采用该方法检测其他几种牛相... 为建立同时检测口蹄疫病毒(FMDV)和牛肠道病毒(BEV)的双重RT-PCR方法,本研究根据已发表的FMDV和BEV基因的5'UTR保守区域,分别设计、筛选出一对特异性引物建立了双重RT-PCR方法,并优化了反应体系和条件。采用该方法检测其他几种牛相关病毒结果均为阴性,表明特异性良好。该方法对FMDV的最低检出限为8 TCID50/0.1 mL,对BEV的最低检出限为2 TCID50/0.1 mL,表明其具有良好的敏感性。采用该方法检测了852份临床样品,并与病毒分离方法比较,结果两种方法检测结果完全一致。本研究首次建立了同时检测FMDV和BEV的双重RT-PCR快速检测方法,该方法的建立为FMDV和BEV的检测提供了一种技术手段。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 牛肠道病毒 双重rt—pcr

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猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用 被引量：18

12

作者 李晶梅 刘丹 +5 位作者 薛霜 秦红刚 陈其兵 靖志强 漆世华 谢红玲 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第4期66-71,共6页

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒同属于黄病毒科瘟病毒属,在基因组序列上有很高的同源性,2种病毒交叉污染的情况十分严重,给疫病诊断和疫苗质量控制带来很大麻烦。为了更好的对这2种病的病原进行分子生物学鉴别检测,参考GenBank上2种病毒标... 猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒同属于黄病毒科瘟病毒属,在基因组序列上有很高的同源性,2种病毒交叉污染的情况十分严重,给疫病诊断和疫苗质量控制带来很大麻烦。为了更好的对这2种病的病原进行分子生物学鉴别检测,参考GenBank上2种病毒标准株的基因组序列,选取各自的保守基因区域设计可以进行鉴别检测的特异性引物,经过对PCR反应条件的优化,建立了可以对2种病毒同时检测的双重RT-PCR方法。该方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型的扩增结果均为阴性;该检测方法的敏感性为5ng病毒基因组RNA。建立的猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可以用于2种疫病的临床分子检测,也可用于猪瘟疫苗的质量控制,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 牛病毒性腹泻病毒 双重rt—pcr 鉴别检测

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猪繁殖与呼吸综合征病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立 被引量：1

13

作者 张靖飞 张园 +3 位作者 李志辉 王慧煜 曹达江 梅琳 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第4期74-77,共4页

为了建立一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒并且能够区分普通毒株和高致病性毒株的荧光PCR方法,根据GenBank已经公布的国内发表的高致病性PRRSV NSP2基因序列,针对Nsp2缺失区设计一对引物和探针,在结合PRRSV通用检测引物探针进行荧光... 为了建立一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒并且能够区分普通毒株和高致病性毒株的荧光PCR方法,根据GenBank已经公布的国内发表的高致病性PRRSV NSP2基因序列,针对Nsp2缺失区设计一对引物和探针,在结合PRRSV通用检测引物探针进行荧光定量PCR,对反应条件进行优化,用已知PRRSV普通株和高致病性株及其他病毒进行试验。结果表明,该方法可以特异检测并区分高致病性株和普通株。将该方法用于临床标本的检测,通过对32份样本检测,通用阳性为28份,阳性率为87.5%。高致病性株为17份,阳性率为59.38%。表明建立的方法可以用于PRRSV的快速检测,并且可以区分普通株和高致病性株。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 高致病性毒株 双重荧光rt—pcr

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两种一步法RNA提取试剂的比较 被引量：4

14

作者 孙映雪 孙承英 +3 位作者 赵永刚 陈继明 宋翠平 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2004年第12期22-24,共3页

RNA的提取在生物医学研究和临床检测上应用广泛。本文分别用进口Invitrogen公司生产的以及我们自己研制的一步法RNA提取试剂,提取大肠杆菌RNA、鸡肌肉组织RNA和尿裳液RNA,通过核酸电泳和荧光定量RT-PCR进行比较。结果表明用我们自己研... RNA的提取在生物医学研究和临床检测上应用广泛。本文分别用进口Invitrogen公司生产的以及我们自己研制的一步法RNA提取试剂,提取大肠杆菌RNA、鸡肌肉组织RNA和尿裳液RNA,通过核酸电泳和荧光定量RT-PCR进行比较。结果表明用我们自己研制的和进口的试剂提取的RNA都不含有DNA;这些RNA都可以作为模板进行RT-PCR检测,并且在数量上相互之间没有明显差异。说明我们自己研制的一步法RNA提取试剂可以取代进口试剂。此外,本文还讨论了此类试剂一些评定方法。 展开更多

关键词 一步法 RNA 提取 试剂 荧光定量rt—pcr

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基于荧光熔解曲线模式RT-PCR快速检测H_5N_1亚型禽流感病毒 被引量：1

15

作者 岳华 李明义 +3 位作者 马莉 汤承 张兆敏 张斌 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期116-121,共6页

针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因保守序列设计2对引物,建立了SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,实现了同一反应管内同时检测AIV的H5和N1亚型基因。熔解曲线分析显示,H5和N1扩增片段的熔解温度分别为(79.5±0.3)℃... 针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因保守序列设计2对引物,建立了SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,实现了同一反应管内同时检测AIV的H5和N1亚型基因。熔解曲线分析显示,H5和N1扩增片段的熔解温度分别为(79.5±0.3)℃和(83.3±0.3)℃,无引物二聚体形成,扩增产物片段大小分别为150 bp和474bp,与预期大小相符,测序结果证实为H5和N1亚型基因的靶序列。该方法能从H5N1样本中检出阳性扩增信号,熔解曲线可见H5和N1双特异峰;而H5N2样本有阳性扩增,熔解曲线仅见H5单特异峰。AIV的其他HA亚型和其他病毒的RNA、DNA无扩增信号。本法最低可检测21.0拷贝.μL-1和19.5拷贝.μL-1H5和N1重组质粒,敏感度分别是RT-PCR的100、1 000倍。本研究建立的基于荧光熔解曲线模式RT-PCR可用于HN亚型AIV的检测。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H5N1亚型 双重荧光rt—pcr 熔解曲线

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鸭副粘病毒与H9亚型禽流感病毒双重PCR检测方法的初步建立

16

作者 刘宇卓 魏雪涛 +1 位作者 李银 张敬峰 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期55-59,共5页

通过对GenBank发表的鸭副粘病毒(DPV)和鸭H9亚型禽流感病毒(AIV,H9)基因序列分析,针对保守区分别设计并合成2对特异性引物。通过对扩增条件的优化,建立了检测两种病毒的快速双重PCR方法。结果表明,该检测方法可同时扩增出DPV(363 bp)和H... 通过对GenBank发表的鸭副粘病毒(DPV)和鸭H9亚型禽流感病毒(AIV,H9)基因序列分析,针对保守区分别设计并合成2对特异性引物。通过对扩增条件的优化,建立了检测两种病毒的快速双重PCR方法。结果表明,该检测方法可同时扩增出DPV(363 bp)和H9亚型AIV(732 bp)的特异性片段,而对照DHV、IBV、IBDV及SPF鸡胚尿囊液均未见条带。该方法具敏感性,对鸡胚感染尿囊液中两种病原核酸的检出率均为2 ng.μL。对保存不同时间的两种病毒及临床可疑病料均可检测到阳性条带。试验证明该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,可以用于临床样品的早期快速检测和鉴别诊断。 展开更多

关键词 鸭副粘病毒 H9亚型禽流感 双重rt—pcr 检测

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高致病性禽流感RT-PCR快速诊断方法的建立 被引量：2

17

作者 彭晓玲 兰玲 +1 位作者 马亚珍 成进 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第1期40-42,共3页

参照国内外方法,选择M基因的保守序列作为靶序列,应用快速、高效、特异的一步法RT-PCR检测法进行禽流感病毒型特异性诊断,得到大小为229 bp的特异性产物,与预期结果一致。另外,采用柱式总RNA提取方法,与酚/氯仿的抽提方法相比,具有快速... 参照国内外方法,选择M基因的保守序列作为靶序列,应用快速、高效、特异的一步法RT-PCR检测法进行禽流感病毒型特异性诊断,得到大小为229 bp的特异性产物,与预期结果一致。另外,采用柱式总RNA提取方法,与酚/氯仿的抽提方法相比,具有快速,对操作人员技术要求较低,整个反应和扩增体系设计合理等特点。以上技术,简化了操作程序,节约了检测时间,缩小了因微量操作引起的误差,可获得较理想的结果和可靠的检测数据。 展开更多

关键词 禽流感病毒 rt—pcr 一步法

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广东兰花两种主要病毒的检测 被引量：9

18

作者 吴竹妍 黎园 +4 位作者 何晓盈 童诗涵 孙辉 向梅梅 饶雪琴 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期14-16,F0002,共4页

采用双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)对44个兰花病样分别检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV),结果显示,有59.1%的兰花检出CyMV,36.4%的兰花检出ORSV,22.7%的兰花复合... 采用双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)对44个兰花病样分别检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV),结果显示,有59.1%的兰花检出CyMV,36.4%的兰花检出ORSV,22.7%的兰花复合感染了CyMV和ORSV。采用一步逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对24个兰花病样进行检测,结果有83.3%的兰花检出CyMV,75%的兰花检出ORSV,66.7%的兰花复合感染了CyMV和ORSV,可见RT-PCR检测灵敏度高于ELISA。 展开更多

关键词 兰花 建兰花叶病毒 齿兰环斑病毒 DAS—ELISA 一步法rt—pcr 检测

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