酵母双杂交技术筛选细胞极化蛋白PALS1的结合蛋白

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作者 高雪敏 刘晓颖 +2 位作者 张庆慧 戴寒晶 范礼斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2007年第2期154-157,共4页

目的筛选细胞极化蛋白PALS1的结合蛋白,进一步探讨PALS1的功能及其分子机制。方法将PALS1的全长cDNA序列克隆到载体pGBKT7中,重组的pGBKT7-PALS1质粒转入酵母AH109细胞,细胞置于SD/-Trp培养基上生长,阳性细胞再用Hela细胞的cDNA文库质... 目的筛选细胞极化蛋白PALS1的结合蛋白,进一步探讨PALS1的功能及其分子机制。方法将PALS1的全长cDNA序列克隆到载体pGBKT7中,重组的pGBKT7-PALS1质粒转入酵母AH109细胞,细胞置于SD/-Trp培养基上生长,阳性细胞再用Hela细胞的cDNA文库质粒转化,生长于SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal,显蓝色的克隆为阳性。阳性克隆细胞中的DNA被抽提后转化细菌细胞,然后抽提DNA进行酶切分型。合适的类型测序后进行BLAST检索分析。结果筛选到了13个阳性克隆,其中有2个是已知蛋白的基因即ATRAP和GLT28D1。结论利用酵母双杂交系统成功克隆了PALS1的结合蛋白的基因,为进一步研究PALS1蛋白的功能提供了有益的启示。 展开更多

关键词 酵母菌 双杂交系统技术 PALS1 结合蛋白

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酵母双杂交技术筛选胞内氯离子通道蛋白1结合蛋白 被引量：2

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作者 戴寒晶 刘晓颖 +1 位作者 钟子琳 范礼斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2006年第2期175-177,共3页

目的应用酵母双杂交技术研究胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)的结合蛋白,以进一步了解其功能。方法首先将CLIC1的全长cDNA连接到pGBKT7载体中,重组质粒pGBKT7CLIC1转化入酵母菌株AH109,再将人Hela细胞的cDNA文库转化AH109细胞,用αgal检测... 目的应用酵母双杂交技术研究胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)的结合蛋白,以进一步了解其功能。方法首先将CLIC1的全长cDNA连接到pGBKT7载体中,重组质粒pGBKT7CLIC1转化入酵母菌株AH109,再将人Hela细胞的cDNA文库转化AH109细胞,用αgal检测阳性克隆。所获得阳性克隆测序后进行BLAST检索。结果用酵母双杂交方法筛选到了16个阳性克隆,其中有4个是已知蛋白的基因。结论利用酵母双杂交系统筛选到了数个结合蛋白。 展开更多

关键词 酵母菌 双杂交系统技术 氯化物通道

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应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2结合的肝细胞蛋白编码基因 被引量：1

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作者 梁赟磊 成军 +7 位作者 邢卉春 王琦 李越 张斌 樊万虎 袁菊 张黎颖 洪源 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期793-795,共3页

目的构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2(HBEBP2)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与HBEBP2相互作用的基因。方法通过PCR扩增获得HBEBP2基因,构建真核表达载体pGBKT7-HBEBP2,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质... 目的构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2(HBEBP2)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与HBEBP2相互作用的基因。方法通过PCR扩增获得HBEBP2基因,构建真核表达载体pGBKT7-HBEBP2,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆。提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-HBEBP2共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆。挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析。结果筛选出6种与HBEBP2相互作用的蛋白,其中包括人类线粒体蛋白、人类α-2-糖蛋白1、人类磷酸甘露糖-p-长醇利用缺陷1和人类丝氨酸蛋白酶抑制剂等4个已知功能蛋白及2个未知功能序列。结论筛出人肝细胞中一组与HBEBP2相互作用的蛋白,为进一步探讨HBEBP2在HBV致病过程中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 HBEBP2 双杂交系统技术 蛋白质相互作用

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人肠三叶因子酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用鉴定

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作者 王林 孙勇 +4 位作者 王臻 张勇 吴炜 吕尚军 彭曦 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期957-959,共3页

目的构建人肠三叶因子酵母双杂交诱饵载体并验证其自激活作用。方法以pET32a-hITF质粒为模板,PCR扩增hITF成熟肽cDNA片段,SalI和EcoRⅤ双酶切后连接到pENTR3c载体,通过λ噬菌体臂同源重组反应(LR重组反应)将hITF片段连接到酵母双杂交诱... 目的构建人肠三叶因子酵母双杂交诱饵载体并验证其自激活作用。方法以pET32a-hITF质粒为模板,PCR扩增hITF成熟肽cDNA片段,SalI和EcoRⅤ双酶切后连接到pENTR3c载体,通过λ噬菌体臂同源重组反应(LR重组反应)将hITF片段连接到酵母双杂交诱饵载体pDEST32,获得诱饵质粒pDEST32-hITF,测序后与酵母双杂交空质粒pDEST22共转化到酵母菌株Mav203,经营养缺陷培养基筛选后,观察在含不同浓度3-氨基三唑(3AT)的营养缺陷培养基中pDEST32-hITF的自激活作用。结果成功克隆hITF基因片段,构建酵母双杂交诱饵质粒pDEST32-hITF,其与酵母双杂交空载体pDEST22共转化到酵母菌株Mav203后,可在3AT浓度为0、10、25mmol/L的营养缺陷培养基上生长,而在3AT浓度为50、75、100mmol/L的营养缺陷培养基上不能生长。结论成功构建酵母双杂交诱饵载体,经验证50mmol/L及以上浓度的3AT营养缺陷培养基可以抑制其自激活作用。 展开更多

关键词 肠三叶因子 双杂交系统技术 自激活作用

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PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者结核分枝杆菌耐药性的价值 被引量：5

5

作者 刘轾彬 吴敏 +3 位作者 吴小翠 韩敏 肖和平 张青 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2021年第1期47-51,共5页

目的评估PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者痰标本中MTB耐药性的价值。方法收集2015年6月至2019年1月上海市肺科医院诊治的400例复治涂阳肺结核患者的痰标本,每份标本量均不少于2ml;每例患者采用同一标本进行PCR-反向点杂交法MTB耐药基... 目的评估PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者痰标本中MTB耐药性的价值。方法收集2015年6月至2019年1月上海市肺科医院诊治的400例复治涂阳肺结核患者的痰标本,每份标本量均不少于2ml;每例患者采用同一标本进行PCR-反向点杂交法MTB耐药基因检测、GeneXpert MTB/RIF检测和BACTEC MGIT960液体培养、菌种鉴定、微孔板法药物敏感性试验(简称"药敏试验"),最终纳入357例(株)为研究对象。以微孔板法药敏试验结果为参考标准,评价PCR-反向点杂交法的检测效能。结果以微孔板法药敏试验结果为参考标准,PCR-反向点杂交法检测MTB对利福平耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值分别为97.5%(115/118)、97.1%(232/239)、94.3%(115/122)、98.7%(232/235)、97.2%(347/357)和0.937,对异烟肼耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值分别为82.5%(113/137)、99.1%(218/220)、98.3%(113/115)、90.1%(218/242)、92.7%(331/357)和0.841,对链霉素耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值分别为86.5%(115/133)、99.1%(222/224)、98.3%(115/117)、92.5%(222/240)、94.4%(337/357)和0.877,对乙胺丁醇耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值分别为60.7%(37/61)、98.6%(292/296)、90.2%(37/41)、92.4%(292/316)、92.2%(329/357)和0.682。结论 PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者痰标本中MTB耐药性有较好的效能。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 结核 抗多种药物性 微生物敏感性试验 聚合酶链反应 双杂交系统技术 评价研究 数据说明 统计

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乙型肝炎病毒e抗原与金属硫蛋白相互作用的研究 被引量：6

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作者 陆荫英 王琳 +4 位作者 刘妍 李克 成军 张玲霞 李莉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期451-453,共3页

乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)被认为与乙型肝炎病毒 (HBV)引起免疫耐受 ,免疫系统功能障碍有关。为探讨HBeAg在乙型肝炎发病机制中的作用 ,寻找防治HBV感染的有效方法 ,应用酵母双杂交系统 3构建HBeAg诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH10 9后 ,与... 乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)被认为与乙型肝炎病毒 (HBV)引起免疫耐受 ,免疫系统功能障碍有关。为探讨HBeAg在乙型肝炎发病机制中的作用 ,寻找防治HBV感染的有效方法 ,应用酵母双杂交系统 3构建HBeAg诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH10 9后 ,与含肝cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合、双杂交 ,在营养缺陷培养基 (SD/ Trp Leu His Ade)上及X α 半乳糖苷酶 (X α gal)蓝白斑双重筛选与肝细胞蛋白结合的蛋白 ,结果获得真阳性菌落 39个 ,提取酵母质粒转化大肠杆菌 ,测序后进行生物信息学分析 ,发现其中含金属硫蛋白(MT)基因的菌落有 3个。进一步用网织红细胞裂解物体外翻译、蛋白间免疫共沉淀实验证实 ,金属硫蛋白与HBeAg间有确切的结合作用。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒E抗原 金属硫蛋白 相互作用 研究 双杂交系统技术

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带核定位信号的RARα与谷氨酸氨连接酶蛋白相互作用的胞内外验证 被引量：4

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作者 吴燕 刘北忠 +4 位作者 王翀 钟梁 朱丹 王春光 金丹婷 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期468-471,共4页

目的通过胞内外实验验证谷氨酸氨连接酶(GLUL)与带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)之间的相互作用。方法将表达GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白的两种重组表达质粒共同转化入AH109酵母菌,采用一对一的酵母双杂交技术验证它们在活... 目的通过胞内外实验验证谷氨酸氨连接酶(GLUL)与带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)之间的相互作用。方法将表达GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白的两种重组表达质粒共同转化入AH109酵母菌,采用一对一的酵母双杂交技术验证它们在活细胞内的相互作用;通过构建GLUL及NLS-RARα蛋白标签融合表达载体,共转染至人胚肾HEK293细胞,利用免疫共沉淀技术在细胞外验证它们之间的相互作用。结果 GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色的阳性克隆;GLUL蛋白及NLS-RARα标签融合表达载体构建成功,共同转染至HEK293细胞,采用抗HA多克隆抗体免疫沉淀HA-NLS-RARα相互作用蛋白复合物后,抗c-Myc单克隆抗体免疫印迹检测,检测到GLUL-cMyc蛋白。结论采用酵母双杂交和免疫共沉淀技术成功地在胞内外验证了GLUL与NLS-RARα之间存在特异性的相互作用。 展开更多

关键词 维甲酸受体Α 核定位信号 谷氨酸氨连接酶 蛋白质相互作用 双杂交系统技术 免疫共沉淀

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丙型肝炎病毒核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用 被引量：4

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作者 李小权 成军 +3 位作者 张树林 王琦 李国力 洪源 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期790-792,共3页

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用。方法分别扩增HCV核心蛋白core及其结合蛋白HCBP6的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体。测序正确后应用双杂交技术把目的片段分别插入哺乳动物细胞双杂交... 目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用。方法分别扩增HCV核心蛋白core及其结合蛋白HCBP6的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体。测序正确后应用双杂交技术把目的片段分别插入哺乳动物细胞双杂交系统的表达质粒pBIND和pACT中构建重组载体。将构建的pBIND-core和pACT-HCBP6重组载体和报告质粒pG5luc共转染HepG2细胞,并设背景对照组(pBIND+pACT)、阳性对照组(pBIND-Myod+pACT-Id)、2个阴性对照组(pBIND-core+pACT、pBIND+pACT-HCBP6)和空白对照组。采用Dual-荧光检测系统和TurnerBiosystemsVeritas微孔板化学发光检测仪检测荧虫素酶活性。结果成功构建重组载体pBIND-core和pACT-HCBP6,共转染HepG2细胞之后,其荧虫素酶活性与海肾素酶活性的比值与各对照组相比有统计学差异(P≤0·05)。结论HCV核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在肝癌细胞系中确有一定的相互作用,为进一步阐明HCV核心蛋白在细胞凋亡及细胞恶变中的作用机制提供了新的思路。 展开更多

关键词 肝炎病毒 病毒核心蛋白质类 双杂交系统技术

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乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1相互作用蛋白的筛选与鉴定 被引量：1

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作者 伦永志 成军 +3 位作者 武会娟 于增国 王琦 王芳 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期973-975,共3页

目的筛选并鉴定与乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节蛋白(HBVDNAPTP1)相互作用的蛋白。方法将HBVDNAPTP1基因片段插入酵母细胞表达载体pGBKT7中,转化AH109酵母菌株并获得表达,与含有白细胞文库质粒的Y187酵母菌株配合,利用营养缺陷型... 目的筛选并鉴定与乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节蛋白(HBVDNAPTP1)相互作用的蛋白。方法将HBVDNAPTP1基因片段插入酵母细胞表达载体pGBKT7中,转化AH109酵母菌株并获得表达,与含有白细胞文库质粒的Y187酵母菌株配合,利用营养缺陷型培养基筛选阳性克隆。提取单个阳性文库质粒进行酶切鉴定,测序后回复验证其在酵母中的相互作用。利用免疫共沉淀方法进一步验证HBVDNAPTP1与成对免疫球蛋白受体α(PILRα)在体外的相互作用。结果经RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,成功构建HBVDNAPTP1基因的酵母细胞"诱饵"表达质粒,获得了与HBVDNAPTP1具有相互作用的已知功能蛋白4种,分别为PILRα、酶原颗粒蛋白16、羧酸脂酶1、β转导素样蛋白2。免疫共沉淀结果表明HBVDNAPTP1与PILRα在体外存在相互作用。结论获得了4种可与HBVDNAPTP1相互作用的候选蛋白,HBVDNAPTP1可能参与了肝细胞的增殖分化、信息传递和生长代谢。 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 DNA聚合酶 反式激活因子类 双杂交系统技术

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人端粒相关蛋白T-STAR的克隆及其与端粒酶催化亚单位hTERT的相互作用研究 被引量：1

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作者 周平 房殿春 +4 位作者 毛高平 张启杰 曹传平 步晓华 刘为纹 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期546-548,共3页

目的克隆人端粒相关蛋白T-STAR并研究其与端粒酶催化亚单位hTERT在哺乳细胞内的相互作用。方法构建表达载体pGBKT7-hTERT,以pGBKT7-hTERT为诱饵,采用酵母双杂交技术进行cDNA文库筛选;构建pVP16-T-STAR和pMhTERT重组载体,脂质体法将其与... 目的克隆人端粒相关蛋白T-STAR并研究其与端粒酶催化亚单位hTERT在哺乳细胞内的相互作用。方法构建表达载体pGBKT7-hTERT,以pGBKT7-hTERT为诱饵,采用酵母双杂交技术进行cDNA文库筛选;构建pVP16-T-STAR和pMhTERT重组载体,脂质体法将其与报告质粒共转染入胃腺癌细胞株SGC-7901,以pM-53＋pVP16-T、pM3-VP16为阳性对照,以pM53＋pVP16-CP为阴性对照;以pM-hTERT＋pVP16、pM＋pVP16-T-STAR、pM＋pVP16为交叉阴性对照。ELISA法检测报告基因CAT的表达。结果成功构建真核表达载体pGBKT7-hTERT,将获得的阳性克隆测序,并进行同源性比较证实为是已收录的人cDNA序列T-STAR。pGBKT7-hTERT和pVP16-T-STAR共转染之后,报告基因CAT的表达（A值为0.258）显著高于阴性对照（A值为0.002~0.015）。结论T-STAR与hTERT在胃癌细胞内发生了相互作用,T-STAR可能是人端粒相关蛋白新成员,通过hTER参与端粒酶活性的调控。 展开更多

关键词 端粒 末端转移酶 端粒结合蛋白质类 双杂交系统技术

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肝细胞内与HBeAg结合的新蛋白编码基因E-36的筛选与克隆

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作者 陆荫英 梁耀东 +6 位作者 成军 邵清 陈天艳 王琳 张健 李克 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第12期1077-1079,共3页

目的　探讨HBeAg在乙型肝炎病毒 (HBV)致病过程中所起的作用。方法　利用酵母双杂交系统 3筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBeAg有相互作用的蛋白的基因。将HBeAg编码基因克隆入酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH10 9... 目的　探讨HBeAg在乙型肝炎病毒 (HBV)致病过程中所起的作用。方法　利用酵母双杂交系统 3筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBeAg有相互作用的蛋白的基因。将HBeAg编码基因克隆入酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH10 9并在其内表达 ,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合 ,双重筛选阳性菌落 ,提取质粒并测序。结果　通过行生物信息学分析 ,发现其中有 1个未知基因 ,命名为E 36。结论　根据GenBank中的序列信息设计引物 ,从HepG2细胞中扩增出E 36新基因的完整序列并克隆到另一酵母表达载体pGADT7中 ,并用体外免疫共沉淀方法再次验证了HBeAg与E 36新蛋白之间有结合作用 ,为HBeAg的功能研究提供了新线索。 展开更多

关键词 肝炎E抗原 乙型 基因 双杂交系统技术

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Sedlin突变体S124A对其与PAM14相互作用的影响

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作者 汪云飞 朱恒锐 +4 位作者 张庆慧 邢昕 武标 刘晓颖 范礼斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2009年第1期10-13,共4页

目的构建Sedlin的点突变体,研究其与PAM14在酵母中的相互作用,寻找其相互作用的位点。方法用蛋白质在线序列分析软件CPHmodels预测Sedlin蛋白的磷酸化位点,可能的磷酸化位点主要有S2、S30、S119、S124、Y115,针对其中一个磷酸化位点(S1... 目的构建Sedlin的点突变体,研究其与PAM14在酵母中的相互作用,寻找其相互作用的位点。方法用蛋白质在线序列分析软件CPHmodels预测Sedlin蛋白的磷酸化位点,可能的磷酸化位点主要有S2、S30、S119、S124、Y115,针对其中一个磷酸化位点(S124)设计定点突变引物;以pAS-Sedlin为模板,以两条含有突变位点的互补序列为引物进行PCR扩增,将得到的PCR产物用DpnⅠ酶切除去模板,消化产物转化大肠杆菌感受态DH5α,对得到的阳性克隆进行测序;将构建的定点突变质粒pAS-SedlinS与pACT2-PAM14共转化至酵母Y190中,并对生长至合适大小的克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析。结果构建了pAS-Sedlin的定点突变质粒pAS-SedlinS,其与pACT2-PAM14共转克隆的β-半乳糖苷酶活性反应呈阳性,并且Sedlin S124A蛋白与PAM14蛋白的相互作用比野生型Sedlin蛋白与PAM14蛋白相互作用强。结论成功构建了Sedlin S124A,Sedlin蛋白的S124并不是其与PAM14在酵母中相互作用的特异性结合位点。 展开更多

关键词 蛋白质类/遗传学 酵母菌/遗传学 双杂交系统技术 骨骺 脊柱/畸形

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HBV(ayw)转基因小鼠HBV复制中间体的检测 被引量：1

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作者 陈阳述 尤玉琴 +5 位作者 苏蔚 易学瑞 袁有成 陈文吟 张锋 孔祥平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期959-961,共3页

目的建立稳定、高灵敏度化学发光Southern blotting检测系统,检测HBV(ayw)转基因小鼠肝脏及其他组织的HBV复制水平。方法采用地高辛标记HBV探针,利用pTHBV1047质粒检测杂交系统的灵敏度及重复性;提取第27代HBV(ayw)转基因小鼠肝、肾、... 目的建立稳定、高灵敏度化学发光Southern blotting检测系统,检测HBV(ayw)转基因小鼠肝脏及其他组织的HBV复制水平。方法采用地高辛标记HBV探针,利用pTHBV1047质粒检测杂交系统的灵敏度及重复性;提取第27代HBV(ayw)转基因小鼠肝、肾、脾和肌肉组织总DNA,经HindⅢ酶切后电泳、转膜,利用高灵敏度化学发光杂交Southern blotting检测各组织中HBV复制中间体的水平。结果地高辛标记的化学发光检测系统灵敏度达0.1pg,且杂交系统稳定可靠。HBV(ayw)转基因小鼠基因组DNA中检测到整合的外源HBV DNA,但低于HepG2.2.15细胞的HBV复制水平。肝、肾、脾和肌肉组织中都有HBV复制中间体存在,以肝组织中含量最高。结论第27代HBV(ayw)转基因小鼠染色体含有稳定的HBV基因整合,为复制型HBV转基因小鼠。 展开更多

关键词 小鼠 转基因 肝炎病毒 乙型 双杂交系统技术

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