罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶的克隆及原核表达质粒构建 被引量：4

1

作者 李庆勇 可小丽 +2 位作者 卢迈新 朱华平 高风英 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期92-99,共8页

为进一步了解无乳链球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基团的相关信息,通过提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA,利用特异性引物PCR扩增出scpB基因的全长开放阅读框(ORF)。结果表明,该基因包括3 405 bp的ORF,可编码1 134个氨基... 为进一步了解无乳链球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基团的相关信息,通过提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA,利用特异性引物PCR扩增出scpB基因的全长开放阅读框(ORF)。结果表明,该基因包括3 405 bp的ORF,可编码1 134个氨基酸,与已报道的人源无乳链球菌ScpB的氨基酸同源性达99.74%。利用生物信息学软件DNAstar、Clustal X 2.0和MEGA 5.05及在线分析工具ExPASy ProtParam、NCBIProten blast及Conserved Domain等对推导的氨基酸序列进行分析,结果显示罗非鱼无乳链球菌scpB基因编码的氨基酸序列含有3个催化三联体(catalytic triad)位点、7个假定活性位点(putative active site)、2个特异位点(spe-cific hits),以及4个超家族结构(2个肽酶超家族结构Peptidases-S8-S53 superfamily、1个类纤连蛋白超家族结构DUF1034 superfamily和1个鞭毛钩蛋白超家族结构FlgD-lg superfamily);并且该氨基酸序列有多个抗原表位,推测ScpB蛋白应具有较强的免疫原性,可作为候选的蛋白疫苗成分。将该片段插入原核表达载体pET32a(+),转入大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆,经PCR、酶切及测序鉴定表明成功构建原核表达载体pET32a(+)/scpB。 展开更多

关键词 罗非鱼 无乳链球菌 C5a肽酶 克隆 原核表达质粒

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人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建 被引量：3

2

作者 张志 黄宗青 +6 位作者 沈琪 刘洪涛 邓英太 李爱东 周国强 汪华侨 何蕴韶 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期288-291,共4页

【目的】克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。【方法】采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质... 【目的】克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。【方法】采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。【结果】人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。【结论】成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。 展开更多

关键词 苯丙酮尿症 苯丙氨酸羟化酶 克隆 原核表达质粒

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小鼠内皮抑制素原核表达质粒的构建及表达 被引量：2

3

作者 黎培员 冯作化 +3 位作者 张桂梅 薛胜利 黄波 王洪涛 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期227-229,233,共4页

内皮抑制素具有强烈的抑制新生血管形成的作用 ,其主要在肝脏合成。提取小鼠肝细胞总 RNA,设计合适的引物 ,用 RT- PCR扩增出小鼠内皮抑制素 c DNA片段 ,插入原核表达载体 p RSET- A中 ,构建出重组质粒 p RSET- ES。将其转化入大肠杆菌 ... 内皮抑制素具有强烈的抑制新生血管形成的作用 ,其主要在肝脏合成。提取小鼠肝细胞总 RNA,设计合适的引物 ,用 RT- PCR扩增出小鼠内皮抑制素 c DNA片段 ,插入原核表达载体 p RSET- A中 ,构建出重组质粒 p RSET- ES。将其转化入大肠杆菌 DH5 α中扩增 ,质粒酶切筛选 ,DNA测序予以证实。重组质粒转化入大肠杆菌 BDPS中 ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测到约 19. 展开更多

关键词 小鼠 内皮抑制素 原核表达质粒 构建 基因表达

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尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒的构建及鉴定 被引量：2

4

作者 陈文昭 黄路 +4 位作者 黄山虎 曹凯 舒勇 韩智敏 安洪 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期645-648,共4页

目的:构建尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒。方法:从人尤文肉瘤A673细胞中提取总RNA,以RT-PCR法扩增EWS-FLI1基因序列,目的基因两侧引入SacⅠ和HindⅢ酶切位点,克隆至pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆作PCR鉴定、酶切鉴... 目的:构建尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒。方法:从人尤文肉瘤A673细胞中提取总RNA,以RT-PCR法扩增EWS-FLI1基因序列,目的基因两侧引入SacⅠ和HindⅢ酶切位点,克隆至pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆作PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定。再将EWS-FLI1基因亚克隆至原核表达载体pQE30中,构建重组原核表达质粒pQE30-EWS-FLI1,酶切及测序鉴定。所构建的重组质粒转化JM109,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上,进行Western blot鉴定。结果:PCR结果显示扩增片段大小约为1.5kb,双酶切鉴定目的基因片段大小约为1.5kb,阳性克隆测序结果显示目的基因序列与预期相同。所构建重组质粒在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的54kD蛋白,经鉴定系EWS-FLI1蛋白。结论:成功构建了pQE30-EWS-FLI1,并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 EWS-FLI1融合基因 尤文肉瘤 原核表达质粒

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猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株gE基因原核表达质粒的构建 被引量：1

5

作者 曾智勇 周莉 +7 位作者 汤德元 刘志杰 梁海英 李谦 肖超能 王彬 王凤 甘振磊 《贵州农业科学》 CAS 北大核心 2011年第11期149-152,共4页

为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体... 为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经鉴定后测序。结果表明:目的片段为PRV gE基因完整开放阅读框,大小1 734bp,编码577个氨基酸,在pET32a(+)载体中位置正确,表明,pET32a-gE原核表达质粒构建成功。该基因与国内外其他18株PRV的gE基因推导氨基酸序列同源性为94.8%～98.6%;与国外分离株属同一个进化分支,遗传关系相对较近;而与国内Fa、Min、GDSH等毒株亲缘关系较远。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 GE基因 克隆 原核表达质粒

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重组原核表达质粒pTrc99A-ureB/hlyE的构建和表达 被引量：1

6

作者 焦志勇 陈旻湖 +3 位作者 李国庆 朱森林 陈为 胡品津 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第3期34-36,67,共4页

目的　构建表达幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)尿素酶B亚单位 (ureB)基因与大肠杆菌K - 12株hlyE基因融合表达的原核表达质粒 pTrc99A -hlyE 并表达。 方法　用PCR扩增hlyE基因 ,经酶切连接反应将其克隆入重组原核表达质粒并测序 ,... 目的　构建表达幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)尿素酶B亚单位 (ureB)基因与大肠杆菌K - 12株hlyE基因融合表达的原核表达质粒 pTrc99A -hlyE 并表达。 方法　用PCR扩增hlyE基因 ,经酶切连接反应将其克隆入重组原核表达质粒并测序 ,与GenBank中的核酸和蛋白序列进行BLAST分析 ,重组的阳性克隆经IPTG诱导培养 ,SDS -PAGE电泳进行表达分析 ,薄层扫描分析融合蛋白的含量。结果　对重组质粒进行酶切和PCR检测 ,证明构建了携带hlyE及ureB基因的重组原核表达质粒 pTrc99A -ureB/hlyE ,核酸序列测定及同源性分析证实所构建的原核表达质粒pTrc99A -ureB/hlyE中所含的Hp -ureB及hlyE与GeneBank中的Hp -ureB和hlyE序列的同源性分别为 97 4 2 % (16 6 3/ 170 7)、99% (910 / 918)。重组细菌JM10 9可表达约 10 0kD的融合蛋白ureB/hlyE ,含量占全菌体蛋白含量的 15 5 %。 结论　构建并鉴定了原核表达质粒pTrc99A -hlyE并高效表达 。 展开更多

关键词 重组原核表达质粒 pTrc99A-ureB/hlyE 尿素酶B亚单位 幽门螺杆菌

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人p21活化激酶6基因截短区域的GST标签原核表达质粒的构建及其重组蛋白的表达

7

作者 刘彤 李洋 +2 位作者 李丹妮 耿楠希 李丰 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期437-440,共4页

目的:构建人p21活化激酶6(PAK6)的各个截短区域原核表达质粒,并诱导和鉴定其融合蛋白的表达,为探讨PAK6基因的生物学功能提供依据。方法:以真核表达质粒pcDNA3.1-GFP-PAK6为模板,PCR扩增出PAK6基因的各个截短片段。所获得的各截短片段经... 目的:构建人p21活化激酶6(PAK6)的各个截短区域原核表达质粒,并诱导和鉴定其融合蛋白的表达,为探讨PAK6基因的生物学功能提供依据。方法:以真核表达质粒pcDNA3.1-GFP-PAK6为模板,PCR扩增出PAK6基因的各个截短片段。所获得的各截短片段经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆至GST标签的原核表达载体pGEX-5X-1中。将构建的PAK6各截短质粒转化入E.coli BL21中,采用IPTG诱导PAK6基因截短融合蛋白表达,采用Western blotting法鉴定PAK6基因截短融合蛋白的表达。结果:EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后得到与预期大小相符的载体片段(5 000bp)和PAK6 1-55(165bp)、PAK6 56-210(465bp)、PAK6 211-410(600bp)及PAK6 385-681(891bp)4个片段。Western blotting检测,PAK6各截短区域质粒GST-PAK6截短融合蛋白相对分子质量分别为32 000、43 000、48 000和60 000。结论:成功构建PAK6基因各个截短区域GST标签原核表达质粒并表达其重组蛋白。 展开更多

关键词 P21活化激酶 截短区域 原核表达质粒 GST融合蛋白

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FUS1基因原核表达质粒构建与诱导表达

8

作者 张宝 霍霞 +5 位作者 彭琳 齐宗利 徐锡金 李燕 丘波 郑良楷 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期638-640,共3页

目的构建FUS1基因原核表达质粒,在大肠杆菌[Rosetta(DE3)2plys]中高效表达重组蛋白。方法采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出FUS1基因,并将其接入pET-32a(+),经PCR、测序鉴定后,转化Rosetta(DE3)2plys细菌,并用IPTG诱导表... 目的构建FUS1基因原核表达质粒,在大肠杆菌[Rosetta(DE3)2plys]中高效表达重组蛋白。方法采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出FUS1基因,并将其接入pET-32a(+),经PCR、测序鉴定后,转化Rosetta(DE3)2plys细菌,并用IPTG诱导表达。结果经过PCR、测序鉴定,克隆了pET32a(+)-FUS1重组子;在低浓度IPTG(25μmol/L)诱导3h,RosettaDE3可以高效地表达重组蛋白,约占细菌总蛋白的40%。结论成功地克隆到FUS1基因,并使其在原核系统中高效表达。 展开更多

关键词 FUSI基因 基因表达 原核表达质粒

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阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因原核表达质粒的构建及表达

9

作者 朱晓燕 王雅静 +2 位作者 杨树国 毕世樑 廖琳 《四川动物》 CSCD 北大核心 2008年第2期273-276,共4页

质粒pMD-18T-ap65-3经XhoI和BamHI双酶切,1.0%凝胶电泳后纯化回收阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因,定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达质粒pET32a-ap65-3。重组质粒转化大肠埃希菌JM109感受态细胞中,筛选阳性克隆,进行PCR、酶... 质粒pMD-18T-ap65-3经XhoI和BamHI双酶切,1.0%凝胶电泳后纯化回收阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因,定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达质粒pET32a-ap65-3。重组质粒转化大肠埃希菌JM109感受态细胞中,筛选阳性克隆,进行PCR、酶切及测序鉴定正确后,将重组质粒pET32a-ap65-3转化于大肠埃希菌BL21中,异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达后利用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)对重组蛋白进行分析鉴定。本实验为研究阴道毛滴虫病的致病机制及蛋白生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 阴道毛滴虫 黏附蛋白65-3 原核表达质粒 基因表达

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刚地弓形虫SRS29C截短型基因的克隆及原核表达质粒的构建 被引量：1

10

作者 袁娣 邵怡 +3 位作者 张同瑶 姜阜杉 李秀荣 宋淇淇 《天津农学院学报》 CAS 2021年第3期50-55,共6页

为构建刚地弓形虫SRS29C基因原核表达质粒,利用SignalP-5.0软件预测信号肽序列,去除SRS29C前端信号肽序列,设计引物并扩增SRS29C截短型基因序列,克隆并构建原核表达质粒。结果显示:SRS29C基因前51位氨基酸为信号肽区域,故将此段信号肽... 为构建刚地弓形虫SRS29C基因原核表达质粒,利用SignalP-5.0软件预测信号肽序列,去除SRS29C前端信号肽序列,设计引物并扩增SRS29C截短型基因序列,克隆并构建原核表达质粒。结果显示:SRS29C基因前51位氨基酸为信号肽区域,故将此段信号肽序列切除,获得长度为966bp的SRS29C截短型基因片段(SRS29Ccut),成功构建原核表达质粒p ET-28a-SRS29Ccut和p ET-32a-SRS29Ccut。此研究为今后对刚地弓形虫SRS29C蛋白的生物学功能及免疫特性进行更深入研究打下基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 SRS29C 截短型基因 原核表达质粒

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淋病奈瑟菌孔蛋白B原核重组质粒的构建、表达与蛋白鉴定 被引量：1

11

作者 叶嗣颖 廖芳 +2 位作者 宋启发 崔斌 熊萍 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期529-531,535,共4页

目的克隆和分析淋病奈瑟菌孔蛋白(porinⅠB,PⅠB)的基因序列并表达相应的蛋白质,为淋病奈瑟菌感染的检测和基因工程疫苗的研究与开发建立基础。方法PCR扩增出孔蛋白PⅠB DNA片段后构建出重组质粒pET-PⅠB,并经质粒酶切筛选、DNA测序和... 目的克隆和分析淋病奈瑟菌孔蛋白(porinⅠB,PⅠB)的基因序列并表达相应的蛋白质,为淋病奈瑟菌感染的检测和基因工程疫苗的研究与开发建立基础。方法PCR扩增出孔蛋白PⅠB DNA片段后构建出重组质粒pET-PⅠB,并经质粒酶切筛选、DNA测序和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导大肠埃希菌DE3表达蛋白予以证实。结果所得PⅠB核苷酸序列与GenBank(AF090801)公布的序列相比较,同源性达99.28%,推导氨基酸序列同源性为98.14%。SDS-PAGE检测到40 kD大小的融合蛋白。结论淋病奈瑟菌孔蛋白PⅠB原核表达质粒构建正确。 展开更多

关键词 淋病奈瑟菌 孔蛋白B 原核表达质粒 基因表达

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海洋创伤弧菌反式翻译系统关键因子SmpB基因的克隆及原核表达 被引量：1

12

作者 刘鹏 岑妍慧 +4 位作者 林江 梁忠秀 兰太进 韩丝银 陈振兴 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期100-106,共7页

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种重要的"人鱼共患病"病原菌。通过克隆创伤弧菌反式翻译系统核心因子小蛋白B(Small molecular protein B,SmpB)基因,构建携带目的基因的原核表达质粒,为后续研究SmpB蛋白的互作网络、SmpB蛋... 创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种重要的"人鱼共患病"病原菌。通过克隆创伤弧菌反式翻译系统核心因子小蛋白B(Small molecular protein B,SmpB)基因,构建携带目的基因的原核表达质粒,为后续研究SmpB蛋白的互作网络、SmpB蛋白与创伤弧菌致病性之间的关系并以此开发新型的抑菌靶标奠定基础。使用LiCl沉淀法提取创伤弧菌基因组DNA,以它为模板,PCR扩增目的基因,并构建到pET-28a原核表达载体上测序鉴定后对SmpB序列进行生物信息学分析,将正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果表明使用LiCl沉淀法成功提取到高质量创伤弧菌基因组DNA,以其为模板,扩增到smpB基因,并成功构建pET-28a原核表达重组质粒,测序鉴定正确;smpB基因全长为486 bp,编码161个氨基酸,分子量为18.41 kD,理论等电点为10.28,不稳定系数为35.02,总平均亲水性为-0.635,SmpB蛋白整体表现为稳定亲水性蛋白。生物信息学分析显示其高级结构核心部分为5个β折叠组成的桶状结构,外围由3个α螺旋组成,SmpB C-端亦为α螺旋。诱导表达的重组融合蛋白相对分子质量大小在25.0 kD附近,显示在E.coli中成功表达了SmpB蛋白。 展开更多

关键词 创伤弧菌 小蛋白B 原核表达质粒构建 基因表达

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鸡IL-18cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达 被引量：9

13

作者 胡敬东 崔治中 赵宏坤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期264-268,共5页

运用RT PCR方法,从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系 MDCC MSB1 总 RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin 18,ChIL 18)成熟蛋白基因的 cDNA,并将其克隆到 pMD18 T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到的Ch... 运用RT PCR方法,从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系 MDCC MSB1 总 RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin 18,ChIL 18)成熟蛋白基因的 cDNA,并将其克隆到 pMD18 T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到的ChIL 18 cDNA与国外报道的完全一致,包括终止密码子在内其编码区的长度为510bp,编码169个氨基酸残基的蛋白质。将ChIL 18 成熟肽段编码区定向克隆到原核表达载体 pGEX 6P 1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,构建成原核表达质粒 pGEX ChIL18。该质粒的 BL21(DE3)LysS转化菌在 IPTG的诱导下可高效表达GST ChIL18基因融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的32%。 展开更多

关键词 IL-18 克隆 DNA GST 诱导 编码区 白细胞介素18 高效表达 原核表达质粒 IPTG

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重组绿色荧光蛋白-肿瘤坏死因子融合蛋白的表达及应用 被引量：3

14

作者 孙义敏 尹丙姣 +2 位作者 李卓娅 姜小丹 徐勇 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期519-521,534,共4页

目的　为肿瘤坏死因子 α (TNF α)及其受体 (TNFR)的科学研究提供实验工具。方法　用基因克隆技术构建了人TNF α (rhTNF α)及绿色荧光蛋白 (GFP)与人TNF α的融合蛋白 (GFP TNF)的原核表达质粒pET2 8a/rhTNF及 pET2 8a/GFP TNF ,分... 目的　为肿瘤坏死因子 α (TNF α)及其受体 (TNFR)的科学研究提供实验工具。方法　用基因克隆技术构建了人TNF α (rhTNF α)及绿色荧光蛋白 (GFP)与人TNF α的融合蛋白 (GFP TNF)的原核表达质粒pET2 8a/rhTNF及 pET2 8a/GFP TNF ,分别转化大肠杆菌BL2 1;用IPTG诱导重组蛋白的表达 ,超声裂菌 ,包涵体中的rhTNF α和GFP TNF用镍金属螯合层析柱进行纯化 ;用MTT法检测rhTNF α和GFP TNF的生物活性。结果重组表达的rhTNF α及GFP TNF均具有明显的细胞毒效应 ,GFP TNF还具有GFP的绿色荧光特性。结论　rhTNF α和GFP TNF具有生物活性 ,可用于TNF α和TNFR的实验研究。 展开更多

关键词 HTNF-Α 原核表达质粒 TNFR 肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 融合蛋白 细胞毒效应 绿色荧光蛋白(GFP) 绿色荧光蛋白 IPTG 包涵体

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结核杆菌Mtb8.4抗原在大肠杆菌中表达的初步研究 被引量：2

15

作者 李素华 钟森 +1 位作者 徐建国 史晓玲 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第2期156-158,共3页

目的构建结核杆菌低分子质量抗原Mtb8.4的原核表达质粒,并检测其在大肠杆菌中的表达。方法PCR扩增目的基因,克隆到质粒pETHisT7启动子的下游;酶切和PCR法鉴定重组子;阳性重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导后,SDSPAGE电泳分... 目的构建结核杆菌低分子质量抗原Mtb8.4的原核表达质粒,并检测其在大肠杆菌中的表达。方法PCR扩增目的基因,克隆到质粒pETHisT7启动子的下游;酶切和PCR法鉴定重组子;阳性重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导后,SDSPAGE电泳分析。结果重组质粒pETHisMtb8.4成功构建,含阳性重组子的菌体蛋白经SDSPAGE电泳出现一新的蛋白带,与预计相符。结论初步证明构建的大肠杆菌重组体能够表达目的蛋白,为进一步对其免疫效应的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分支杆菌 低分子质量抗原 分泌性 原核表达质粒 大肠杆菌 蛋白表达

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人源受体相关蛋白在大肠杆菌中表达的优化及纯化 被引量：2

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作者 张红 刘志国 屈伸 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期265-268,272,共5页

目的　获得人源受体相关蛋白 (RAP) ,对表达条件进行优化。方法　RAPcDNA被插入到原核表达质粒pT7 PL和pET 2 8a (+)中 ,分别构建成RAP重组表达载体 ,转化两种BL2 1菌株后 ,转化菌用异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,选择 pT7 PL RAP质... 目的　获得人源受体相关蛋白 (RAP) ,对表达条件进行优化。方法　RAPcDNA被插入到原核表达质粒pT7 PL和pET 2 8a (+)中 ,分别构建成RAP重组表达载体 ,转化两种BL2 1菌株后 ,转化菌用异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,选择 pT7 PL RAP质粒进行表达条件的优化 ,采用镍离子亲和层析纯化所获得的RAP ,通过检测与巨噬细胞的结合能力评估其生物活性。结果　两个重组质粒均获得了RAP的高表达 ,对于pT7 PL RAP质粒 ,RAP在BL2 1(DE3,plysS)菌株中的表达显著高于在BL2 1(DE3)菌株的表达 ;有氯霉素存在时表达高于无氯霉素时 ;诱导表达的RAP大部分为可溶性的 ;镍离子亲和层析树脂纯化所获得的RAP ,可与富含低密度脂蛋白受体(LDLR)家族受体的小鼠巨噬细胞系RAW 2 6 4 7结合。结论　本实验获得了有生物学功能的RAP ,为进一步开发生产此蛋白打下良好的基础。 展开更多

关键词 RAP 表达条件 受体相关蛋白 PL 巨噬细胞 纯化 亲和层析 原核表达质粒 IPTG 诱导表达

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小鼠Pem-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达 被引量：1

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作者 张畅斌 李月琴 +2 位作者 郭芬 王莹 周天鸿 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 2003年第1期68-72,共5页

　目的:为制备重组小鼠Pem(以下简称mPem)-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白,作为研究mPem蛋白功能的材料.方法:根据携带小鼠Pem基因编码序列的模板质粒pEGFP/mPem设计合成特异性引物,PCR扩增小鼠Pem基因编码序列,并插入融合蛋白原核表... 　目的:为制备重组小鼠Pem(以下简称mPem)-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白,作为研究mPem蛋白功能的材料.方法:根据携带小鼠Pem基因编码序列的模板质粒pEGFP/mPem设计合成特异性引物,PCR扩增小鼠Pem基因编码序列,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-3中,得到重组表达质粒pGEX-4T-3/mPem,用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,IPTG诱导重组菌表达mPem蛋白,SDS-PAGE及WesternBlot鉴定表达产物.结果:重组菌株明显诱导表达出预期相对分子质量49000的融合蛋白.结论:成功构建了mPem-GST原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出mPem-GST融合蛋白,为mPem蛋白功能的研究打下了基础. 展开更多

关键词 Pem-GST融合蛋白 基因表达 大肠杆菌 小鼠 原核表达质粒 胚胎发育

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细粒棘球绦虫AgB8/1-AgB8/2重组嵌合抗原表达系统的构建 被引量：1

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作者 古力帕丽.麦曼提依明 马海梅 +5 位作者 吾拉木.马木提 陈洁 陈璐 丁剑冰 马秀敏 温浩 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期502-505,510,共5页

目的构建pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达。方法从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板,用基因特异性引物分别扩增EgAgB8/1和EgAgB8/2基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后... 目的构建pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达。方法从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板,用基因特异性引物分别扩增EgAgB8/1和EgAgB8/2基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此两条基因片段为依据,人工合成EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性。通过对pUCm-T/AgB8/1-AgB8/2重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确后,转化至E.coliBL21(DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1-AgB8/2重组嵌合蛋白。用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。结果测序表明,AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒。SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组嵌合蛋白得到成功表达,在相对分子量约38 kD处有表达条带。结论成功构建了pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1-AgB8/2嵌合重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。 展开更多

关键词 细粒棘球绦虫 AgB8/1-AgB8/2重组嵌合抗原 原核表达质粒

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减毒沙门氏菌载体及其在疫苗研究中的应用进展 被引量：6

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作者 黄小波 曹三杰 +1 位作者 文心田 杨恒 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期478-480,共3页

关键词 沙门氏菌载体 减毒沙门氏菌 疫苗载体 黏膜免疫反应 真核表达质粒 原核表达质粒 基因工程 免疫原性

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