HPV 6b L1基因原核表达系统的构建及鉴定 被引量：2

1

作者 刘希君 庄敏 +4 位作者 商庆龙 王燕 魏兰兰 李迪 谷鸿喜 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2005年第4期25-27,共3页

克隆、构建人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)L1基因重组质粒,并进行表达和鉴定。用PCR方法,从尖锐湿疣标本中扩增出HPV6b型L1基因,构建重组克隆质粒pblue-HPV6bL1,测序分析其基因变异。将本地株HPV6b型L1基因酶切后连接到原核表达质粒pBAD,构建... 克隆、构建人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)L1基因重组质粒,并进行表达和鉴定。用PCR方法,从尖锐湿疣标本中扩增出HPV6b型L1基因,构建重组克隆质粒pblue-HPV6bL1,测序分析其基因变异。将本地株HPV6b型L1基因酶切后连接到原核表达质粒pBAD,构建原核表达系统pBAD-HPV6bL1/Top10,酶切鉴定证明重组质粒的正确性。经L-Arobinose诱导后表达HPV6b型L1蛋白,利用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。经酶切及序列分析鉴定,重组质粒pBAD-HPV6bL1构建成功,诱导后能够表达L1融合蛋白。HPV6bL1重组质粒构建成功,并获得HPV6bL1蛋白,为该蛋白的功能及HPV的基因工程疫苗研究提供了物质基础。 展开更多

关键词 尖锐湿疣 人乳头瘤病毒6b型 L1基因 基因克隆 基因表达 原核表达系统 酶切鉴定 质粒构建 HPV 基因重组质粒

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葡萄球菌肠毒素B基因原核表达系统的构建及其表达产物促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的研究 被引量：1

2

作者 毛亚飞 徐水凌 +1 位作者 罗冬娇 严杰 《浙江大学学报（理学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期553-558,共6页

构建葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxins B，SEB）基因原核表达系统，了解重组表达产物rSEB促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用．采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株DNA中扩增全长SEB基因片段，T—A克隆后测序，构建SE... 构建葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxins B，SEB）基因原核表达系统，了解重组表达产物rSEB促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用．采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株DNA中扩增全长SEB基因片段，T—A克隆后测序，构建SEB基因原核表达系统pET32α-SEB—E．coliBL2IDE3．采用SDS-PAGE检测rSEB表达产量，Ni—NTA亲和层析法提纯rSEB．采用TCID50法测定rSEB对Vero细胞的细胞毒性作用并计算TCID50值．采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEB体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用以及对HepG2细胞（人肝腺癌细胞）、HeLa细胞（人宫颈癌上皮细胞）的生长抑制作用．与公布的相关序列比较，所克隆的SEB基因核苷酸序列相似性为100％．rSEB表达量约为细菌总蛋白的40％．rSEB对Vero细胞的TCIC50为3．02μg．5．0～20．0μg／ml的rSEB对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用（P〈0．05）．5．0～20．0μg／ml rSEB作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长（P〈0．05）．本研究成功地构建了rSEB高效原核表达系统．rSEB仍然具有生物学活性．所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法，为以后减毒rSEB突变体的筛选奠定了基础． 展开更多

关键词 葡萄球菌肠毒素B SEB基因/克隆 原核表达系统/构建 重组蛋白/表达 细胞毒性 淋巴细胞/增殖 肿瘤细胞/抑制

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真核化的原核表达系统增强HBV preS2/S基因免疫的效果 被引量：1

3

作者 袁志刚 张进平 +3 位作者 王缨 储以微 徐薇 熊思东 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期6-10,15,共6页

目的研究真核化的原核表达系统——pCMV-T7pol/pT7IRES-HBs双质粒共表达体系与常规真核表达质粒相比在真核细胞中的表达差异;基因免疫小鼠诱生特异性体液免疫应答的能力及二者所诱生的抗体亚型的差异。方法运用分子生物学方法构建真核... 目的研究真核化的原核表达系统——pCMV-T7pol/pT7IRES-HBs双质粒共表达体系与常规真核表达质粒相比在真核细胞中的表达差异;基因免疫小鼠诱生特异性体液免疫应答的能力及二者所诱生的抗体亚型的差异。方法运用分子生物学方法构建真核化的原核表达系统,将构建的质粒进行基因免疫,应用DOT-EIA和ELISA等检测其所产生的抗体水平。结果①真核化的原核表达系统在真核细胞中的表达能力明显强于常规真核表达质粒。②真核化的原核表达系统基因免疫小鼠不仅可诱生特异性体液免疫应答,且具有明显增强效应(P<0·05)。③真核化的原核表达系统与常规真核表达质粒相比不仅可诱生同等程度的Th1型免疫应答,而且能够诱生更强的Th2型免疫应答(P<0·01)。结论真核化的原核表达系统——pCMV-T7pol/pT7IRES-HBs双质粒能诱导较强的体液免疫应答。 展开更多

关键词 真核化的原核表达系统 基因免疫 HBV

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牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p20的原核表达

4

作者 王婉怡 李娅婕 +1 位作者 王桂花 韩晓东 《动物医学进展》 北大核心 2024年第10期48-52,共5页

牛病毒性腹泻是由黄病毒科、瘟病毒属中的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染牛引起的一种传染病,是一种全球性牛传染病。为了在原核表达系统表达BVDV非结构蛋白p20,并分离纯化蛋白进行晶体学研究。首先对BVDV-1 p20蛋白基因进行密码子优化,合... 牛病毒性腹泻是由黄病毒科、瘟病毒属中的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染牛引起的一种传染病,是一种全球性牛传染病。为了在原核表达系统表达BVDV非结构蛋白p20,并分离纯化蛋白进行晶体学研究。首先对BVDV-1 p20蛋白基因进行密码子优化,合成后克隆到pET30表达载体上。测序鉴定成功的pET30-p20表达质粒转化大肠埃希氏菌表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导获得的p20蛋白经过Ni柱、分子筛纯化。最终,经过多重缓冲溶液的筛选,p20蛋白可以稳定存在于含有5 mmol/Lβ-巯基乙醇、5%甘油、150 mmol/L氯化钠(pH8.0)的Tris-HCl缓冲液中。高纯度均一性的p20蛋白获得,为后续p20晶体学研究以及单克隆抗体的制备提供原核表达纯化方案。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 原核表达系统 分子筛 p20蛋白质

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HCG嵌合肽CP12基因的构建和原核系统表达

5

作者 徐万祥 熊艳 +5 位作者 孙志达 廖矛川 顾少华 应康 刘建平 谢毅 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期96-97,共2页

关键词 HCG嵌合肽 CP12基因 基因构建 原核系统表达

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人胱抑素C的原核表达纯化鉴定及抗血清的制备 被引量：3

6

作者 陈婷梅 俸家富 +2 位作者 曹炬 文阳安 涂植光 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期938-940,共3页

目的构建人胱抑素C(cystatin C,Cys C)的原核表达载体,并用纯化的Cys C重组蛋白免疫家兔,制备CysC抗血清。方法从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,将测序正确的目的基因克隆至pET32(a)表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3... 目的构建人胱抑素C(cystatin C,Cys C)的原核表达载体,并用纯化的Cys C重组蛋白免疫家兔,制备CysC抗血清。方法从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,将测序正确的目的基因克隆至pET32(a)表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA、Western blot进行检测。结果测序证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符;SDS-PAGE、Western blot结果证实获得相对分子质量为35×103的Cys C融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni2+亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1∶8000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论获得了Cys C重组蛋白及特异性多克隆抗体。 展开更多

关键词 胱抑素C 原核表达系统 蛋白纯化 抗血清

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外源基因表达系统的研究进展 被引量：38

7

作者 郭广君 吕素芳 王荣富 《科学技术与工程》 2006年第5期582-587,592,共7页

最近20多年来,随着重组DNA技术的迅速发展,对于克隆基因表达问题的研究也日渐深入,并积累了相当丰富的知识。外源基因的表达系统包括原核表达系统和真核表达系统,它们各有优缺点,在选择时应衡量使用。

关键词 原核表达系统 真核表达系统 大肠杆菌表达系统 酵母表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物细 胞表达系统

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犬干扰素α2的原核表达及抗病毒活性分析 被引量：5

8

作者 姚凌云 王晶宇 +8 位作者 欧阳伟 钱晶 吴世妍 夏兴霞 诸玉梅 王晓丽 潘群兴 芮荣 王永山 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2018年第2期59-63,共5页

本研究将人工合成的犬干扰素α2成熟区序列插入原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-28a-Ca IFN-α2;然后将该质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,分子量约为23 k Da的... 本研究将人工合成的犬干扰素α2成熟区序列插入原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-28a-Ca IFN-α2;然后将该质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,分子量约为23 k Da的目的蛋白表达,表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量约占菌体总蛋白的52.5%。包涵体蛋白经变性、复性和纯化处理后,获得的重组Ca IFN-α2纯度为92%;用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测重组蛋白的抗病毒活性为3.16×106/m L。本研究结果为进一步研制新型犬用干扰素制品奠定了物质基础。 展开更多

关键词 重组犬干扰素α2 原核表达系统 抗病毒活性

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胸腺肽α_1的温度诱导原核可溶性表达与简易纯化 被引量：3

9

作者 陈培富 李红芳 +1 位作者 鲁琼芬 陈俊 《云南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期183-187,共5页

将人工合成的人胸腺肽α1(Tα1)基因插入到载体pBV222,转化大肠杆菌DH5α菌株并置42℃诱导表达可溶性融合蛋白。融合蛋白经镍亲和层析柱纯化,加入肠激酶切割,再将酶切反应体系回到镍亲和层析柱。所获穿过液中的重组胸腺肽α1(rTα1),经... 将人工合成的人胸腺肽α1(Tα1)基因插入到载体pBV222,转化大肠杆菌DH5α菌株并置42℃诱导表达可溶性融合蛋白。融合蛋白经镍亲和层析柱纯化,加入肠激酶切割,再将酶切反应体系回到镍亲和层析柱。所获穿过液中的重组胸腺肽α1(rTα1),经十二烷基硫酸钠-聚苯烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离及分析,纯度分别为94.5%和72%。以癌症患者外周血淋巴细胞开展玫瑰花环试验,所获rTα1纯品显示出与化学合成Tα1(sTα1)相同的生物学活性。 展开更多

关键词 胸腺肽Α1 原核表达系统 镍亲和层析 反相高效液相色谱 玫瑰花环试验

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禽网状内皮组织增殖病病毒PCR及RT-PCR检测方法的研究和p30主要抗原域的原核表达 被引量：6

10

作者 葛兆宏 陆广富 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期441-445,共5页

根据MONAM.ALY发表的一对引物,5'-CATACTGGAGCCAATGGTGTAAAGGGCAGA-3'(上游引物),5'-AATGTTGTAGCGAAGTACT-3'(下游引物),上游引物位于REV-SNV毒株LTR序列上游237bp到267bp,下游引物在499bp到517bp之间,扩增产物总长为28... 根据MONAM.ALY发表的一对引物,5'-CATACTGGAGCCAATGGTGTAAAGGGCAGA-3'(上游引物),5'-AATGTTGTAGCGAAGTACT-3'(下游引物),上游引物位于REV-SNV毒株LTR序列上游237bp到267bp,下游引物在499bp到517bp之间,扩增产物总长为281bp。以REV-T株感染的鸡胚成纤维细胞DNA作为PCR扩增模板,进行PCR扩增,提取病毒RNA进行RT-PCR,这两种方法均获得了禽网状内皮增生症T株的部分LTR序列,将其克隆入pGEM-TEasy克隆载体中,经测序,证实为禽网状内皮增生症T株的部分LTR序列,初步建立了REV的PCR和RT-PCR检测方法。人工合成了REVp30的主要抗原域,用构建成功的表达禽网状内皮增生症p30主要抗原域的原核表达载体pET-p30,转化大肠杆菌BL21,挑取阳性克隆培养,IPTG诱导后裂解菌体作SDS-PAGE分析,出现大小约25Ku的表达产物即融合蛋白TrxA-p30主要抗原域,经Westernblot验证融合蛋白具有REV特异的反应原性。采用常规表达条件:LB培养基,37℃培养,待菌生长至OD600为0.4h～0.6h,用终浓度为0.2mmol/L～0.8mmol/L的IPTG进行诱导,于37℃振荡培养4h～5h,均能高效表达。本研究为建立REV抗体的ELISA检测方法打下基础。 展开更多

关键词 禽网状内皮增生症病毒 p30蛋白主要抗原域 原核表达系统 Western BLOT

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人乳腺珠蛋白基因亚型的原核表达及纯化 被引量：2

11

作者 刘秀娜 潘自铁 +3 位作者 王仙园 周娟 赵力军 胡川闽 《医学研究生学报》 CAS 2006年第2期107-110,共4页

目的:克隆人乳珠蛋白(hMAM)编码全长cDNA,原核表达并纯化蛋白产物,为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础。方法:自乳腺癌组织及乳腺癌细胞株MD-MB453提取总RNA,通过RT-PCR克隆hMAM cD-NA,构建pQE40-hMAM表达质粒,在大肠杆菌M15中表达... 目的:克隆人乳珠蛋白(hMAM)编码全长cDNA,原核表达并纯化蛋白产物,为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础。方法:自乳腺癌组织及乳腺癌细胞株MD-MB453提取总RNA,通过RT-PCR克隆hMAM cD-NA,构建pQE40-hMAM表达质粒,在大肠杆菌M15中表达,利用镍-亚硝胺乙酸组氨酸(N i-NTA-H is)亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果:乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中发现两种hMAM cDNA亚型,即hMAM和hMAM(Isoform),长度分别为279和270 bp,两者相差9个连续碱基,其翻译产物相差3个连续氨基酸残基;表达的融合蛋白以不溶性包涵体形式存在,纯化后得到纯度为97%的目的蛋白。结论:获得hMAM cDNA并发现一个新的hMAM突变体;融合蛋白的表达及纯化成功。 展开更多

关键词 乳腺癌 人乳腺珠蛋白 原核表达系统 蛋白纯化

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基因表达系统研究进展 被引量：20

12

作者 孙柏欣 刘长远 +3 位作者 陈彦 赵华 赵彤华 李柏宏 《现代农业科技》 2008年第2期205-207,209,共4页

随着世界分子生物学的研究不断发展,基因表达技术有了很大的提高。到目前为止,人们已经研究出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白。原核生物表达系统主要有大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统等;真核生物表达系统主要包括酵... 随着世界分子生物学的研究不断发展,基因表达技术有了很大的提高。到目前为止,人们已经研究出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白。原核生物表达系统主要有大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统等;真核生物表达系统主要包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统等。各种表达系统各具优缺点,对其进行了详细介绍。 展开更多

关键词 基因表达 原核表达系统 真核表达系统

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重组角质细胞生长因子(KGF)的原核表达及优化 被引量：3

13

作者 田顺立 郑春阳 《安徽农业科学》 CAS 2018年第33期71-74,共4页

[目的]在原核表达系统中进行重组人角质细胞生长因子(KGF)的表达及优化。[方法]选取缺失N端23个氨基酸残基的KGF片段作为目的基因,按照大肠杆菌的密码子偏好性,将其进行密码子优化。使用BL21(DE3)菌株表达KGF(ΔN23)、SUMO融合的SUMOKGF... [目的]在原核表达系统中进行重组人角质细胞生长因子(KGF)的表达及优化。[方法]选取缺失N端23个氨基酸残基的KGF片段作为目的基因,按照大肠杆菌的密码子偏好性,将其进行密码子优化。使用BL21(DE3)菌株表达KGF(ΔN23)、SUMO融合的SUMOKGF(ΔN23)和Fh8-SUMO融合的Fh8-SUMO-KGF(ΔN23),并测试不同表达温度(37、23℃)对KGF(ΔN23)表达结果的影响。[结果]在BL21(DE3)菌株中,37℃表达时KGF(ΔN23),SUMO-KGF(ΔN23)和Fh8-SUMO-KGF(ΔN23)的表达量都较高,其中可溶性蛋白表达量KGF(ΔN23)<SUMO-KGF(ΔN23)<Fh8-SUMO-KGF(ΔN23)。降低诱导温度为23℃后,3种KGF的表达量都显著降低,但是可溶性蛋白的占比显著提高,均接近100%。[结论]降低诱导温度能够促进KGF的可溶性表达,但是总蛋白的表达水平显著下降;与可溶性标签蛋白融合表达能够提高KGF在37℃表达时可溶性蛋白占比,其中融合Fh8-SUMO标签的KGF表达量和可溶性蛋白占比较高。 展开更多

关键词 角质细胞生长因子(KGF) 原核表达系统 密码子优化 融合表达 标签蛋白

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重组人细胞角蛋白9 cDNA的原核表达及纯化

14

作者 王博 周艳 +5 位作者 侯卫坤 蔡永松 张英 王林玉 韩燕 孟列素 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期502-506,共5页

目的克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his... 目的克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达。表达的融合蛋白通过Ni 2+亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合。结论成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9。 展开更多

关键词 原核表达系统 细胞角蛋白9 融合蛋白 细胞骨架

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Cys C的原核表达载体构建和鉴定

15

作者 王箭 阳强 +1 位作者 陈婷梅 尹一兵 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2008年第3期331-333,共3页

目的:构建人胱抑素C(Cys C)的原核表达载体,为进一步表达纯化Cys C重组蛋白奠定基础。方法:从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,再将目的基因克隆至PET32a(+)表达载体中,构建人Cys C原核表达质粒PET32a(+) /Cys c;再将此重组... 目的:构建人胱抑素C(Cys C)的原核表达载体,为进一步表达纯化Cys C重组蛋白奠定基础。方法:从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,再将目的基因克隆至PET32a(+)表达载体中,构建人Cys C原核表达质粒PET32a(+) /Cys c;再将此重组子进行双酶切电泳鉴定和测序鉴定。结果:酶切电泳鉴定结果显示Cys C基因克隆入载体中,测序结果证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符。结论:获得了人Cys C原核表达质粒PET32a(+)/Cys C,为进一步表达和纯化Cys C重组蛋白奠定了工作基础。 展开更多

关键词 胱抑素C 原核表达系统 表达载体 重组蛋白 免疫学法检测试剂盒

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融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化

16

作者 戚华兵 汪仕良 王凤君 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第22期2213-2215,共3页

目的构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1αPAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表... 目的构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1αPAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。结论含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础。 展开更多

关键词 原核表达系统 TAT蛋白转导结构域 缺氧诱导因子1Α PAS—B结构域

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猪传染性胃肠炎病毒YK株N基因的原核表达与N蛋白的生物学活性检测

17

作者 张雷 卫广森 《中国兽药杂志》 2005年第5期10-12,19,共4页

将猪传染性胃肠炎病毒的N基因克隆到表达载体pET28a后,转化到BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中。通过筛选表达温度和IPTG的浓度,使N基因在原核表达系统中表达并使目的表达产物产量达到最高值。将诱导表达的产物进行SDS-PAGE蛋白电泳和Wester... 将猪传染性胃肠炎病毒的N基因克隆到表达载体pET28a后,转化到BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中。通过筛选表达温度和IPTG的浓度,使N基因在原核表达系统中表达并使目的表达产物产量达到最高值。将诱导表达的产物进行SDS-PAGE蛋白电泳和Western检验,证明该表达产物是猪传染性胃肠炎病毒的N蛋白。试验结果说明,猪传染性胃肠炎病毒N基因能够在原核表达系统中大量表达,而且表达的蛋白质具有生物学活性。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 N基因 N蛋白 活性检测 大肠杆菌表达系统 原核表达系统 Western 表达产物 生物学活性 表达载体 基因克隆 IPTG 蛋白电泳 PAGE 诱导表达 试验结果 SDS 蛋白质

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鸭坦布苏病毒NS1蛋白的原核表达与多克隆抗体制备 被引量：2

18

作者 张喜文 鲁绍芳 +8 位作者 李盼盼 冉梦媛 李卓燕 焦凤超 董建国 黄立 赵聘 曲哲会 时代 《养殖与饲料》 2023年第4期19-25,共7页

[目的]利用原核表达系统制备鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)NS1蛋白及其多克隆抗体。[方法]利用PCR与核苷酸序列测定方法克隆DTMUV NS1基因,连接至重组表达载体p ET-30a(+),构建重组质粒p ET-NS1,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)... [目的]利用原核表达系统制备鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)NS1蛋白及其多克隆抗体。[方法]利用PCR与核苷酸序列测定方法克隆DTMUV NS1基因,连接至重组表达载体p ET-30a(+),构建重组质粒p ET-NS1,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE和Western blot进行IPTG诱导表达产物分析与鉴定,从IPTG的浓度和诱导时间进行表达条件优化,并进行表达产物可溶性分析,重组DTMUV NS1蛋白经亲和层析纯化后免疫小鼠,制备鼠抗DTMUV NS1蛋白多克隆抗体,并通过间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。[结果]成功克隆DTMUV NS1基因,约1065 bp,获得重组质粒p ET-NS1,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)后,可见分子质量约43 ku的特异蛋白,可以与鸡抗DTMUV多克隆抗体发生免疫反应,终浓度为0.8 mmol/L的IPTG诱导2~5 h为DTMUV NS1蛋白最佳表达条件,呈包涵体形式表达,经亲和层析纯化后,成功获得分子质量约43ku的NS1蛋白,蛋白质量浓度为329μg/m L,鼠抗DTMUV NS1蛋白多克隆抗体可以与DTMUV发生特异性免疫反应。[结论]本研究利用原核表达系统表达和纯化DTMUV NS1蛋白,并制备鼠抗DTMUV NS1蛋白多克隆抗体,可为DTMUV致病机制研究和免疫学检测方法建立提供物质材料与技术指导。 展开更多

关键词 鸭坦布苏病毒 NS1蛋白 原核表达系统 多克隆抗体

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黄单胞杆菌纤维素酶的原核表达及固定化研究

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作者 王开胜 梁如冰 +2 位作者 刘喜朋 刘建华 邵志峰 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第2期290-294,共5页

从野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris)中PCR克隆得到删除信号肽的纤维素酶基因engXCAΔSP,并成功使用CPEC(circular polymerase extension cloning)方法构建了原核表达载体pET28a-engXCAΔSP;将该载体转入大肠杆菌... 从野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris)中PCR克隆得到删除信号肽的纤维素酶基因engXCAΔSP,并成功使用CPEC(circular polymerase extension cloning)方法构建了原核表达载体pET28a-engXCAΔSP;将该载体转入大肠杆菌rosetta(DE3)中,用IPTG诱导蛋白质的表达;通过Ni-NTA树脂非变性亲和纯化到了较纯的蛋白。SDS-PAGE电泳结果表明:engXCAΔSP基因编码出约50 kD的蛋白质ENGXCAΔSP。然后对该酶成功进行了固定化。该酶比活为60 U.mg-1,固定前后最适温度为53℃与62℃,最适pH为5.4与5.8,动力学常数分别为Vmax:411μmol.mL-1.h-1与383μmol.mL-1.h-1,Km:0.2500%与0.3125%。 展开更多

关键词 野油菜黄单胞杆菌 内切葡聚糖酶 原核表达系统 固定化酶

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植酸酶基因在原核细胞中表达及植酸酶应用进展

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作者 卢珊 张守纯 +1 位作者 朱航 梁志刚 《现代畜牧兽医》 2007年第7期51-54,共4页

植酸酶（Phytase）是催化植酸及其盐类物质水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称，广泛存在于微生物、麦芽、种子等中。植酸酶可使单胃动物对饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷的排出量减少40％，另外还可降低植酸的抗营养作用。因此植酸... 植酸酶（Phytase）是催化植酸及其盐类物质水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称，广泛存在于微生物、麦芽、种子等中。植酸酶可使单胃动物对饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷的排出量减少40％，另外还可降低植酸的抗营养作用。因此植酸酶在饲料工业中的应用对提高养殖业效益和降低环境污染有重要意义。生产植酸酶的表达系统包括真核表达系统和原核表达系统。真核表达系统主要有丝状真菌表达系统和酵母表达系统；原核表达系统主要是大肠杆菌表达系统。 展开更多

关键词 植酸酶 酶应用 原核细胞 原核表达系统 大肠杆菌表达系统 真核表达系统 基因 本科

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